Un modello murino di retina ischemia-riperfusione lesioni a causa di aumento della pressione intraoculare

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire un modello sperimentale di danno da ischemia-riperfusione retinica e delle sue conseguenze patologiche. Questa metodica è comunemente utilizzata per studiare i meccanismi alla base dell'Ischemia-Riperfusione Retinica, nonché per valutare potenziali approcci terapeutici per il trattamento delle patologie associate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea una lesione altamente mirata alle strutture oculari, causando danni minimi ai tessuti circostanti.

L'utilità di questa tecnica si estende verso la comprensione e tre mesi di molteplici manifestazioni di danno da ischemia-riperfusione retinica, tra cui: infiammazione, stress ossidativo e disfunzione dello sguardo nell'unità neurovascolare retinica. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale perché le tecniche chirurgiche per il posizionamento della cannula possono essere difficili da riprodurre senza una guida visiva. Prima di iniziare la procedura, scaldare una gabbia vuota sul tavolo.

Quindi inserire l'estremità affilata del tubo del sito Y preforato del set primario in un flacone di eparina sodica allo 0,1% e appendere il fondo dell'eparina sodica a un'estensione dell'asta della flebo. Aprire a scatto il tappo del filtro dell'aria sul tubo. Quindi sollevare la bottiglia di eparina sodica a 163 centimetri dal piano del tavolo al picco della flebo di eparina sodica, per produrre una pressione di flusso di eparina sodica di 120 millilitri di mercurio.

Aprire il tubo del sito Y preforato del set primario, per consentire all'eparina sodica di riempire il tubo, e collegare il tubo del sito Y preforato del set primario al collettore a cinque valvole. Quindi, utilizzando i raccordi per tubi Luer maschio a Luer maschio, collegare gli aghi da mezzo pollice calibro 30 al collettore a cinque porte. Inserire ciascuno degli aghi nel proprio segmento da dieci pollici di tubo calibro 30.

Quindi, usando gli emostatici, rompere le nuove punte dell'ago da 30 pollici e inserire le loro estremità smussate nelle estremità aperte del tubo da 30 gauge. Quindi, utilizzare del nastro adesivo per disporre i tubi dell'ago in modo tale che i tubi collegati alle porte interne siano posizionati sopra i tubi collegati alle porte esterne per evitare che il tubo si aggrovigli durante l'incannulamento della camera anteriore. Ora, attiva il flusso di eparina sodica allo 0,1% al collettore a cinque valvole e a ciascuna singola porta per due o tre minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Quindi, chiudere tutte le porte sul collettore a cinque valvole. Per eseguire l'incannulamento, dopo aver somministrato l'anestesia, posizionare tutti i topi nella gabbia calda sul tavolo operatorio, confermando il raggiungimento di un'anestesia profonda per mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi dopo cinque-dieci minuti. Quindi somministrare una goccia di Tropicamide per la dilatazione della pupilla e una goccia di proparacaina per l'anestesia locale in ciascuno degli occhi degli animali e disporre i topi nell'ordine dell'anestesia, in modo che il primo topo anestetizzato sia il primo topo ad essere incannulato.

Mentre aspetti che il collirio faccia effetto, prepara pezzi di nastro adesivo dritti da quattro pollici, tirando saldamente il nastro prima di strapparlo e mettendo da parte un pezzo di nastro adesivo per animale. Si noti che se non si tira saldamente il nastro, si provocherà l'arricciamento del nastro. Quando il primo topo è pronto, metti l'animale sotto un microscopio chirurgico.

Quindi, attiva la prima porta di eparina sodica allo 0,1% sul collettore a cinque valvole e usa un paio di pinze per propetere delicatamente un occhio. Successivamente, inserire l'ago della cannula calibro 30 nella camera anteriore a circa metà strada tra le fibre zonulari e l'apice della cornea. Fare attenzione a non penetrare una seconda volta nel conrea.

Si noti che un leggero movimento rotatorio viene utilizzato per inserire la cannula in profondità nella camera anteriore. Ora, premi il tubo calibro 30 contro il piano del tavolo per ridurre al minimo qualsiasi movimento della cannula inserita mentre raggiungi un pezzo di nastro adesivo e usa il nastro per fissare il tubo al tavolo. Una volta fissato il tubo, registrare l'ora di inizio dell'intervento.

Utilizzare il microscopio per verificare che non ci siano perdite, e che l'occhio di Ischemia-Riperfusione sia più grande dell'occhio controlaterale, per stabilire la presenza di distensione oculare. Applicare l'ipromellosa su entrambi gli occhi ogni 30 minuti, fino alla fine dell'esperimento per lubrificare la cornea e sigillare eventuali micro perdite. Se un animale si muove durante la procedura, sollevare la coda e somministrare un booster di ketamina per via intraperitoneale.

90 minuti dopo aver incannulato il primo animale, estrarre delicatamente la cannula dalla camera anteriore e lubrificare entrambi gli occhi con gelatina lubrificante. Man mano che le cannule successive vengono rimosse, riposizionare ogni topo nella gabbia sul tavolo operatorio, fino a quando gli animali non si sono completamente ripresi. Dopo che tutte le cannule sono state rimosse, disinfettarle con salviettine imbevute di alcol.

Quindi utilizzare una siringa da 60 millilitri riempita d'aria per espellere l'eparina sodica dal collettore a cinque valvole, dagli aghi da 30 gauge, dai tubi da 30 gauge e dalle cannule. Successivamente, sciacquare tutti gli strumenti con una siringa da 60 millilitri riempita con acqua distillata. Infine, espellere l'acqua distillata da tutti i materiali con 60 millilitri d'aria e conservare l'attrezzatura disinfettata e risciacquata per un uso successivo.

L'immunomarcatura NeuN dei nuclei neuronali rivela una significativa perdita di cellule nuronali, a seguito dell'insulto di ischemia-riperfusione, mediante imaging microscopico confocale, sette giorni dopo il danno da ischemia-riperfusione. Infatti, la quantificazione manuale delle cellule NeuN positive in controllo e degli occhi riperfusi con ischemia, dimostra una diminuzione della conta dei neuroni dello strato di cellule gangelionali dopo la lesione, indicando la presenza di morte cellulare indotta da ischemia-riperfusione. Ampiezze inferiori delle onde a e b documentate dall'elettroretinografia indicano anche l'insorgenza di compromissioni indotte da ischemia-riperfusione nella funzione neuronale retinica rispetto agli occhi di controllo non feriti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su dieci animali in circa cinque ore, comprese le ultime due ore trascorse in attesa che i topi si riprendano dall'anestesia. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere l'anestesia profonda. Poiché una sedazione efficace impedirà lo spostamento della cannula da parte del movimento dell'animale.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'elettroretinografia, per rispondere a ulteriori domande sulla funzione retinica. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia, delle neuroscienze e della biologia vascolare di esplorare la patogenesi neurovasculare retinica e l'intervento terapeutico nei roditori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una lesione retinica mirata, attraverso l'incannulamento della camera anteriore oculare.

Non dimenticare che lavorare con strumenti chirurgici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come l'uso di un efficace smaltimento di oggetti taglienti.