DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di estrarre DNA e RNA ad alta resa e qualità dai sedimenti marini costieri e successivamente quantificare i geni e i trascritti dell'RNA ribosomiale 16S. Questo metodo che descrive l'estrazione di DNA e RNA da sedimenti marini seguita da PCR quantitativa è un passo fondamentale nell'analisi molecolare dell'abbondanza e della diversità microbica nell'ambiente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per coestrarre DNA e RNA dallo stesso campione che possono poi essere utilizzati per analisi a valle, come la PCR quantitativa.

A dimostrare la procedura saranno il Dr. Enrico Tatti della NUI Galway e Duncan Sweeney, uno studente di dottorato dell'Università dell'Essex. Per coestrarre DNA e RNA dai sedimenti costieri dopo aver preparato materiali privi di RNA e raccolto campioni di sedimenti costieri secondo il protocollo di testo, trasferire 0,5 grammi di sedimento in una provetta di lisi a perle da due millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone fosfato CTAB e 500 microlitri di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico alla provetta e capovolgere da cinque a 10 volte per omogeneizzare il campione.

Vortice alla massima velocità per 2,5 minuti prima di girare a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, in una cappa aspirante, estrarre lo strato acquoso superiore e trasferirlo in una nuova provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio e aggiungere 500 microlitri di cloroformio ghiacciato: alcol isoamilico.

Quindi capovolgere la provetta più volte fino a quando non è visibile un'emulsione e centrifugare come prima. In una cappa aspirante, estrarre lo strato acquoso superiore e metterlo in una nuova provetta sterile da 1,5 millilitri. Quindi, per far precipitare gli acidi nucleici, aggiungere due volumi di soluzione di cloruro di sodio PEG al 30% e mescolare bene.

Incubare su ghiaccio per due ore o lasciare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 16.000 volte g a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere delicatamente il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Lasciare circa 10 microlitri di soluzione PEG nel tubo e aggiungere un millilitro di etanolo ghiacciato al 70%. Dopo aver centrifugato il campione, utilizzare una micropipetta per rimuovere lentamente l'etanolo, facendo attenzione a non toccare il pellet. Quindi centrifugare per cinque secondi e rimuovere l'etanolo residuo.

Lasciare asciugare il pellet all'aria per cinque minuti prima di utilizzare 50 microlitri di acqua trattata con DEPC per rimetterlo in sospensione. Aliquotare un campione da 15 microlitri per il DNA e 30 microlitri per l'RNA. Il passaggio più critico consiste nell'assicurarsi che il pellet di DNA/RNA non venga rimosso durante la rimozione del surnatante e che non rimanga etanolo residuo prima di risospendere il pellet in acqua, poiché inibisce la reazione molecolare a valle.

Per digerire il DNA nel campione di RNA, aggiungere tre microlitri di tampone DNasi I e 1,5 microlitri di DNasi I all'aliquota di acido nucleico da 30 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Miscelare il reagente di inattivazione della DNasi agitando per 30 secondi.

Quindi aggiungere 4,8 microlitri di soluzione al campione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti, picchiettando di tanto in tanto il fondo delle provette per mescolare la soluzione. Dopo aver centrifugato il campione, trasferire il surnatante contenente RNA in una nuova provetta, facendo attenzione a non trasferire il precipitante. Per verificare la qualità dell'RNA, diluire due microlitri di RNA, uno su 10, aggiungendo 18 microlitri di acqua deionizzata sterile priva di RNasi.

In reazioni PCR separate, aggiungere un microlitro di RNA puro o una diluizione su 10 a una provetta PCR sterile da 0,5 millilitri. Seguendo la tabella nel protocollo di testo, aggiungere i componenti della reazione PCR per amplificare il gene dell'RNA ribosomiale 16S. Includere un controllo positivo, un controllo inibitore della PCR e un controllo negativo.

Quindi eseguire le reazioni di PCR utilizzando i seguenti parametri di amplificazione. Per generare il cDNA del primo filamento dall'RNA, aggiungere i reagenti di reazione a una provetta PCR da 0,2 millilitri secondo il protocollo di testo. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi posizionare i campioni sul ghiaccio per almeno un minuto prima di incubare a 25 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere i reagenti nella tabella qui elencata dal protocollo di testo e incubare a 55 gradi Celsius per 50 minuti. Quindi inattivare la reazione a 72 gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo aver generato gli standard di DNA e RNA per la qPCR secondo il protocollo di testo, scongelare i campioni di DNA e cDNA ambientale, gli standard e i reagenti qPCR su ghiaccio. Diluire gli standard degli acidi nucleici e preparare una diluizione su 10 del DNA e del cDNA ambientale da pulito a 10 a meno tre. Fare un master mix per il numero totale di reazioni più il 10% e mescolare bene.

Aggiungere 19 microlitri di master mix e un microlitro di mascherina in triplicato a ciascun pozzetto in una piastra qPCR ottica a 96 pozzetti. Utilizzare un coperchio ottico qPCR per coprire la piastra. Quindi centrifugare brevemente la piastra e caricarla nel blocco riscaldante della macchina qPCR.

Quindi, aprire il software qPCR manager, quindi fare clic sulla scheda Protocollo, fare clic su Crea nuovo e aggiungere le seguenti condizioni di amplificazione. Impostare il volume del campione su 20 microlitri, fare clic su OK e salvare il protocollo. Ora scegli la scheda Piastra.

Quindi, in Modifica selezionati, fare clic su Seleziona fluoroforo. Aggiungere il colorante reporter per la sonda appropriata e fare clic su OK. Evidenziare i pozzetti contenenti gli standard, quindi dal menu Tipo di campione selezionare Standard. Scegliere Replica serie per modificare la dimensione della replica su tre e fare clic su Applica.

Scegliere Serie di diluizione per aggiungere la concentrazione iniziale calcolata per quella standard. Indicare il fattore di diluizione pari a 10, selezionare Decrescente o Crescente a seconda dell'ordine in cui la curva standard è stata aggiunta alla piastra e fare clic su Applica. Evidenziare le posizioni dei pozzetti contenenti i campioni sconosciuti e selezionare Sconosciuto dal menu a discesa Tipo di campione.

Scegli Replica serie e modifica Dimensione replica su tre, quindi fai clic su Applica. In Nome campione, modificare i nomi dei campioni e ripetere la procedura per i pozzetti di controllo senza modello. Quindi, nella casella dell'editor delle lastre, fare clic su OK e salvare il file.

Quindi fare clic su Avvia esecuzione. Al termine dell'esecuzione, scegliere la scheda Quantificazione per visualizzare la curva standard, i descrittori della curva standard e i grafici di amplificazione. Infine, scegli la scheda Dati di quantificazione per i valori Cp e la quantità iniziale corrispondente per i geni di campioni sconosciuti.

Determinare il numero di copie geniche per grammo di sedimento umido secondo il protocollo di testo. Come mostrato in questa immagine su gel, un'estrazione riuscita dell'acido nucleico produce bande chiare di DNA e RNA dove sono visibili bande nitide di RNA ribosomiale 23S e 16S oltre alla presenza di una banda di DNA genomico ad alto peso molecolare. Questa figura dimostra che quando un intervallo di diluizione di dieci volte viene correttamente preparato e amplificato per generare una curva standard da utilizzare per la reazione qPCR, si osserva una differenza di 3,3 cicli tra ciascuna diluizione standard.

È importante segnalare il punto di incrocio, o valori Cp, dal controllo no template, o NTC, se presente. In tal caso, viene imposto un cutoff Cp per campioni standard e sconosciuti di 3,3 cicli o una piega logaritmica superiore al valore Cp dell'NTC, come descritto in precedenza. Qui, è stata effettuata l'amplificazione del campione ambientale da diluizioni pulite, 10 a meno uno, 10 a meno due e 10 a meno tre.

Il campione pulito non si è amplificato e i valori di Cp da 10 a meno 1 a 10 a meno tre diluizioni sono stati rispettivamente 24,12, 26,02 e 28,40. Come si vede in questo grafico, sono desiderati descrittori di curve standard, inclusi i valori R al quadrato di 0,99 e le efficienze PCR comprese tra il 90 e il 110%. In questo esperimento, il Cp NTC era 30,5 ed è stato imposto un cutoff Cp negativo di 27,2.

La conversione delle abbondanze geniche in per grammo di sedimento di peso umido ha portato a 2,5 volte 10 al settimo e 7,1 volte 10 al settimo per le diluizioni 10 a meno uno e 10 a meno due, rispettivamente. La diluizione di 10 a meno tre Cp era maggiore del cutoff NTC. In questo caso, il 10 al due negativo è stato selezionato come diluizione ottimale del modello.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'RNA può essere rapidamente degradato, quindi è importante tenere il campione sul ghiaccio e utilizzare guanti per evitare la contaminazione con RNasi tutto il tempo. Non dimenticate che stiamo lavorando con fenolo:cloroformio e alcol isamicile, e questo può essere estremamente pericoloso. E precauzioni come indossare camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi e lavorare sotto un cappuccio chimico dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre DNA e RNA e quantificare le abbondanze di geni e trascritti nei sedimenti costieri marini. Ricordate che questa procedura può essere facilmente utilizzata per estrarre DNA e RNA e per quantificare una serie di bersagli genetici dalla maggior parte dei campioni ambientali, compreso il suolo.