Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l'imaging Fisiologicamente parametri importanti In Vivo
26 settembre 2016
Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.
L'obiettivo generale del Rapid Scan Electron Paramagnetic Imaging, o RSEPRI, è quello di fornire informazioni quantitative sulla concentrazione di ossigeno, il pH, lo stato redox e la concentrazione di molecole di segnalazione utili per la ricerca biomedica. L'EPRI è uno strumento che può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nella ricerca sul cancro riguardanti l'ambiente tumorale. Il vantaggio principale dell'imaging EPR a scansione rapida è che è possibile acquisire più informazioni in un tempo molto più rapido, con una più ampia varietà di molecole della sonda rispetto all'imaging EPR a onda continua o CW.
Le molecole sensibili allo stato redox o al pH sono un buon esempio di dove l'EPRI a scansione rapida brilla davvero. Iniziare questa procedura con il calcolo delle condizioni sperimentali a scansione rapida come determinato nel protocollo di testo. Un elemento importante della scansione rapida consiste nel comprendere la dipendenza del segnale dalla larghezza di banda del risonatore e dalle condizioni sperimentali come la frequenza di scansione, l'ampiezza di scansione.
Per ottimizzare davvero l'esperimento è necessario comprendere tutti e tre. Il driver della bobina a scansione rapida ha due amplificatori. Quando si seleziona un condensatore, la scatola del condensatore deve essere bilanciata con una capacità uguale su ciascun lato della scatola.
Le due parti sono in serie. Svitare il coperchio superiore della scatola del condensatore e inserire condensatori su entrambi i lati uguali al valore determinato. Riposizionare la parte superiore della scatola del condensatore e avvitarla per assicurarsi che rimanga accesa.
Utilizzando il pannello frontale del driver della bobina risonante, regolare la frequenza di uscita fino a quando la forma d'onda sinusoidale non raggiunge l'ampiezza massima. Per preparare i radicali, rimuovere N-15 PDT dal congelatore e lasciare che il contenitore raggiunga la temperatura ambiente. Pesate 1,4 milligrammi di N-15 PDT utilizzando una bilancia analitica.
Aggiungere 1,4 milligrammi di N-15 PDT a 15 millilitri di acqua deionizzata per una concentrazione finale di 0,5 millimolari. Quindi, combina 50 milligrammi di BMPO con cinque millilitri di acqua in un tubo di irradiazione al quarzo da 16 millimetri. Aggiungere 100 microlitri di perossido di idrogeno da 300 millimolari.
Irradiare la miscela nel tubo di irradiazione al quarzo da 16 millimetri con una lampada a raggi ultravioletti da 450 watt a media pressione per cinque minuti. Utilizzando una pipetta di trasferimento in vetro, trasferire due virgola cinque millilitri della soluzione irradiata di BMPO-OH dal tubo di irradiazione al quarzo e in un lato di una provetta per campioni di quarzo da 16 millimetri con un divisore di tre millimetri. Trasferire i restanti due virgola cinque millilitri di BMPO-OH irradiato nell'altro lato della provetta per campioni di quarzo con il divisore.
Un secondo passo critico è comprendere la curva di saturazione della potenza. All'aumentare della velocità di scansione, si accede a potenze più elevate e ampiezze del segnale maggiori prima che il segnale si saturi. Larghezze di segnale maggiori sono un altro modo per ridurre il tempo di acquisizione.
Per prima cosa, sintonizzare il risonatore con un campione acquoso del radicale nitrossido inserendo il campione da 15 millilitri di 0,5 millimolari di N-15 PDT in acqua in un tubo di risonanza paramagnetica elettronica al quarzo da 16 millimetri. Inserire il tubo di quarzo nel lato di rilevamento della risonanza paramagnetica elettronica a scansione rapida cross-loop o del risonatore RSEPR. Modificare la frequenza della sorgente dello strumento fino a quando non corrisponde alla frequenza del lato di rilevamento che contiene il campione.
Ora, cambia la frequenza del lato di eccitazione in modo che corrisponda alle frequenze della sorgente dell'esperimento e del lato di rilevamento del risonatore. Modificare la frequenza del lato di eccitazione ruotando un condensatore variabile all'interno della cavità del risonatore. Per impostare la console degli strumenti e il magnete principale, accendi lo spettrometro e scegli un esperimento che registri i dati transitori con il tempo in ascissa.
Eseguire una curva di saturazione di potenza su un campione standard di radicali nitrossido nelle stesse condizioni sperimentali che verranno utilizzate per esaminare i radicali sensibili al pH o allo stato redox. Una volta configurato il sistema, i gradienti vengono applicati manualmente o tramite un programma per computer per l'esperimento di imaging. L'intensità del segnale EPR è direttamente proporzionale al campo a microonde nel risonatore che fa sì che lo spin passi da un livello di energia all'altro.
Questo campo a microonde è chiamato B1. B1 è proporzionale alla radice quadrata della potenza delle microonde. Poiché la potenza delle microonde viene quadruplicata, la B1 viene raddoppiata. In questa cifra la potenza è quadruplicata da otto a 32 milliwatt e il B1 è raddoppiato da 18 a 36 milliGauss.
Una curva di saturazione di potenza può essere costruita tracciando l'ampiezza relativa in funzione della radice quadrata della potenza delle microonde o, se l'efficienza del risonatore è nota, B1. La regione di questa curva che è lineare mostra la regione di potenza in cui il segnale EPR non è saturo o distorto. Uno dei vantaggi di un esperimento a scansione rapida è che l'intervallo di potenza lineare è esteso, rappresentato dai punti colorati, rispetto al normale esperimento CW rappresentato dai punti neri. Qui è mostrata un'immagine spaziale spettrale bidimensionale di fantocci costituiti da un addotto BMPO-OH separato da tre millimetri a una concentrazione di cinque micromolari.
Una fetta dell'immagine mostra la forma spettrale a 250 megahertz. Questa immagine mostra il radicale nitranil N-14 che può essere utilizzato per intrappolare l'ossido nitrico in vivo in un fantoccio, dove una parete spessa un punto di cinque millimetri separa due camere del campione. La forma spettrale a 250 megahertz è mostrata qui.
L'immagine bidimensionale dei radicali triarilmetilici sensibili al pH riflette la differenza nelle caratteristiche spettrali quando il pH del tampone fosfato è uguale a sette virgola zero, o il pH è uguale a sette virgola quattro. Questa immagine mostra il dinitrossido N-15 in un fantoccio a due compartimenti con un distanziatore da 10 millimetri. Inizialmente, entrambi i compartimenti contengono una sonda da 0,5 millimolari.
L'aggiunta di glutatione al dinitrossido rompe la regione del linker ridotto e produce due mononitrossidi, un cambiamento che si riflette nell'immagine bidimensionale. Lo sviluppo dell'EPR a scansione rapida è un cambiamento di paradigma totale nella nostra capacità di studiare molecole con elettroni spaiati. Oggi avete visto la sua applicazione all'EPR in vivo, ma ha anche meravigliose possibilità per studi a bassa temperatura di composti con metalli al loro interno, e molti altri tipi di sistemi.
Per tutti i campioni che abbiamo studiato finora, abbiamo ottenuto miglioramenti nel rapporto segnale/rumore di almeno un ordine di grandezza e talvolta anche di più.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo di risonanza paramagnetica elettronica (RPE) noto come RPE a scansione rapida (RS-EPR) per l'imaging spettrale spaziale 2D. La RPE a scansione rapida offre vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali a onda continua (CW), in particolare nel contesto delle applicazioni di imaging in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immagini biomediche
- Risonanza paramagnetica elettronica
- Ricerca sul cancro
Sfondo
- La scansione rapida di immagini paramagnetiche elettroniche (RSEPRI) fornisce dati quantitativi su diversi parametri biologici.
- È particolarmente utile per valutare gli ambienti tumorali nella ricerca sul cancro.
- La tecnica consente un'acquisizione dei dati più rapida rispetto ai metodi tradizionali.
- Può utilizzare una gamma più ampia di molecole sonda sensibili allo stato redox e al pH.
Scopo dello studio
- Migliorare le tecniche di imaging per la ricerca biomedica.
- Fornire informazioni dettagliate sulla concentrazione di ossigeno, sul pH e sulle molecole di segnalazione.
- Migliorare la comprensione del microambiente tumorale.
Metodi Utilizzati
- Calcolo delle condizioni sperimentali per la scansione rapida.
- Valutazione della dipendenza del segnale dalla larghezza di banda del risonatore.
- Valutazione delle condizioni sperimentali, come l'ampiezza della scansione in frequenza.
- Applicazione della RS-EPR a 250 MHz, con possibilità di utilizzo a altre frequenze.
Risultati principali
- Dimostrazione della superiorità della RS-EPR rispetto alla CW EPR nell'imaging.
- Capacità di acquisire maggiori informazioni in un tempo più breve.
- Imaging riuscito di molecole sensibili allo stato redox e al pH.
- Potenziale per applicazioni più ampie nell'imaging in vivo.
Conclusioni
- RS-EPR rappresenta un notevole progresso nelle tecniche di imaging EPR.
- Apre nuove prospettive di ricerca nel campo del cancro e in altri settori biomedici.
- Studi futuri potrebbero ampliare la sua applicazione a diverse frequenze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tomografia EPR con scansione rapida consente una valutazione quantitativa e in tempo reale di parametri fisiologicamente critici come la tensione di ossigeno, il pH, lo stato redox e le molecole di segnalazione reattive in sistemi viventi. Questa capacità supporta la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca oncologica e sulle malattie infiammatorie fornendo letture dirette delle condizioni microambientali che influenzano la risposta terapeutica e la resistenza. La sensibilità migliorata, la risoluzione spaziale e la velocità di acquisizione del metodo aumentano l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici, facilitando decisioni più precoci di tipo go/no-go nella validazione del bersaglio e nell'ottimizzazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando le dinamiche di ossigenazione, pH e redox in modelli pertinenti alle malattie.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative e risolte spazialmente di biomarcatori del microambiente per chiarire l'attività delle vie e l'interazione con i bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico correlando i cambiamenti del segnale della sonda con fenotipi funzionali, migliorando la fiducia nelle relazioni tra bersaglio e malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera immagini spettrali-spaziali standardizzate e riproducibili di molecole reporter radicaliche sensibili a stimoli fisiologici.
- Output quantitativo: Fornisce variazioni del segnale dipendenti dalla concentrazione per ossigeno, pH e specie redox, consentendo analisi di risposta alla dose e profili di inibizione.
- Riutilizzo della piattaforma: Compatibile con diverse molecole sonda (ad esempio BMPO-OH per •OH, nitrilici per NO•, trialchilmetilici per il pH) in molteplici configurazioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Visualizza direttamente l’ipossia tumorale, l’acidosi e lo stress ossidativo, caratteristiche chiave della progressione del cancro e della resistenza alle terapie.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte meccanicistiche della fase di ricerca alla validazione preclinica monitorando gli stessi biomarcatori in diversi modelli.
- Progressione adattata al rischio: Permette il monitoraggio longitudinale dei cambiamenti microambientali per ottimizzare i regimi di somministrazione e le strategie di combinazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'EPR con scansione rapida si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla valutazione dell'efficacia preclinica, in particolare quando la modulazione del microambiente rappresenta un meccanismo d'azione o un fattore di resistenza.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi visualizzando come perturbazioni genetiche o farmacologiche alterino i parametri di ossigeno, pH o redox in modelli cellulari e tessutali.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi per composti che modulano la segnalazione ipossica, le vie antiossidanti o gli enzimi regolatori del pH attraverso spostamenti EPR misurabili.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative e raziometriche dell'intensità del segnale della sonda e della forma spettrale, consentendo confronti tra diverse condizioni e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla rilevanza in vivo mediante l’imaging delle stesse sonde radicaliche in sistemi fittizi e viventi.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come modulo di imaging non distruttivo e plug-and-play, compatibile con le attuali suite di imaging preclinico e adattabile a diverse chimiche delle sonde.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità dei contributi del microambiente al fenotipo.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la produttività grazie a un'acquisizione più rapida e a un rapporto segnale-rumore più elevato rispetto alla EPR in modo continuo (CW-EPR).
- Valore strategico: Migliora la selezione del portafoglio identificando precocemente nello sviluppo i composti che falliscono a causa di interazioni sfavorevoli con il microambiente.
- Impatto sul portafoglio: Permette un'allocazione delle risorse adeguata al rischio, privilegiando gli agenti che esercitano effetti favorevoli sull'ossigenazione tumorale, sulla normalizzazione del pH o sull'equilibrio redox.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in spettroscopia EPR, chimica dei radicali e manipolazione di campioni biologici.
- Necessita dell'accesso a uno spettrometro EPR a scansione rapida dotato di risonatore a croce e capacità di gradiente per l'imaging 2D.
- Richiede standardizzazione nella preparazione delle sonde, nella calibrazione e nei controlli ambientali (temperatura, umidità) tra diversi siti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi di indicatori di radicali (ad esempio sensibili al pH o al potenziale redox) e tipi di tessuto (fantocci, ex vivo, in vivo).
- I limiti pratici includono la stabilità delle sonde, la biodisponibilità e la possibile presenza di segnali di fondo derivanti da radicali endogeni in matrici biologiche complesse.
