Name: Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Impara a monitorare il priming dei neutrofili in animali vivi utilizzando reporter fluorescenti e imaging intravitale. Questo metodo combina tecniche avanzate per studiare le risposte immunitarie in modelli di malattie rare.

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Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali dell&#39;Università di Toledo. 1. Fenotipizzazione di pIL1-DsRed Mice NOTA: Offspring sono generati da allevamento topi pIL1-DsRed eterozigoti con topi wild-type (WT) C57BL6. Da tre a quattro settimane di età cuccioli sono considerati pronti per fenotipizzazione. Sanguinamento sottomandibolare di topi segue un protocollo stabilito con piccole modifiche 23. <ol><li> Isolamento dei globuli bianchi dal sangue intero di mouse Pups <ol><li> Aggiungere 20 ml di eparina a ciascuna provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Acquisire un cucciolo dalla gabbia. Registrare il tag di identificazione del cucciolo. Non è necessario per anestetizzare i cuccioli prima raccolta di sangue dalla vena sottomandibolare. </li><li> Tenere cucciolo dal collo collottola e perforare la vena sottomandibolare in thsacchetto guancia e con una lancetta 5 mm. Applicare la forza sufficiente per creare una piccola puntura, in modo che gocce di sangue trasudano dal punto di penetrazione. Usare un ago nuovo per ogni cucciolo. </li><li> Raccogliere 3 - 5 gocce di sangue per cuccioli in una provetta contenente eparina. Pulire il sito di puntura e applicare una pressione per facilitare l&#39;emostasi. </li><li> Mettere cucciolo in nuova gabbia e osservare per 30 minuti prima di tornare alla gabbia alla struttura degli animali. </li><li> Raccogliere il sangue da topi adulti di un fenotipo noto come controlli positivi e negativi. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi ad ogni provetta, tubi vortex, e incubare per 5 - 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Aggiungere lentamente 400 - 500 ml di siero fetale bovino (FBS) sotto le sospensioni di cellule in ogni tubo. Un&#39;interfaccia chiara può essere osservata tra la sospensione cellulare di livello superiore e quella inferiore strato di FBS. </li><li> tubi tappo e centrifugare i campioni a 1500 g per 5 min. </li><li> Ripetere i punti 1.1.7 - 1.1.9 alla pellicciather rimuovere i globuli rossi. Non ripetere se lisi è sufficiente la prima volta. Il pellet dovrebbe essere difficile discernere dopo centrifugazione. </li></ol></li><li> Lipopolisaccaride (LPS) Stimolazione e cultura <ol><li> Risospendere le cellule in 200 ml di completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad un tubo di citometria a flusso. </li><li> Fare LPS soluzione di lavoro mescolando 10 ml di soluzione madre LPS (1 mg / ml) con 990 ml di completo RPMI 1640 medium. </li><li> Aggiungere 20 ml di 10 mg / LPS ml di soluzione di lavoro per 200 ml di sospensione cellulare. </li><li> Tubi Cap liberamente e incubare campioni per 4 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Flusso Analisi Citometria <ol><li> Aprire il programma di acquisizione dati per la citometria a flusso. Impostare template di acquisizione prima di assaggiare acquisizione. </li><li> Fare clic sullo strumento Dot-Plot nella palette degli strumenti. Disegnare un foscatter rward (FSC) vs lato scatter plot (SSC). Impostare i parametri di tensione FSC e SSC a scala lineare. </li><li> Selezionare i valori limite più bassi di FSC e SSC consentite dal citometro. Applicare le soglie di 200 e 50 per FSC e SSC, rispettivamente. </li><li> All&#39;interno del FSC vs SSC plot, disegnare un G1 cancello che comprende monociti, granulociti e cellule dendritiche, ed esclude detriti, globuli rossi e linfociti. </li><li> Fare clic sullo strumento Istogramma nella palette degli strumenti. Disegnare un istogramma FL2 (canale fluorescenza rossa). Utilizzare un campione di controllo negativo per impostare la linea di base dei segnali FL2 e un campione di controllo positivo per disegnare una porta per includere tutti gli eventi positivi DsRed. </li><li> Sul pannello Fluidics controllo del citometro, impostare la modalità fluido &quot;RUN&quot; e la portata di &quot;HI&quot; (circa 60 microlitri / min). Acquisire 10.000 eventi per ciascun campione. </li><li> Determinare pup fenotipo misurando la percentuale di cellule positive DsRed dalla porta G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. L&#39;induzione di infiammazione della pelle in pIL1-DsRed Mice <ol><li> Anestetizzare mouse intraperitoneale (ip) iniezione di un cocktail anestetico contenente 100 mg / kg ketamina, 10 mg / kg xylazina, e 1 mg / kg acepromazine. topi anestetizzati adeguatamente non mostrano posteriore ritiro zampa a pizzico punta. </li><li> Applicare la crema depilazione alla superficie dorsale di entrambe le orecchie del mouse. Attendere 30 sec a 1 min. Pulire la superficie orecchio con cotone bagnato di acqua e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Misurare lo spessore orecchio con micrometro e sostituire il mouse in una gabbia separata. Osservare fino al recupero dall&#39;anestesia (~ 15 - 30 min). Per risolvere infiammazione cutanea indotta dal prodotto epilazione, permettono mouse per riposare per 3 giorni prima di ulteriori sperimentazioni viene effettuata. </li><li> Preparare 1,25% (w / v) OX sciogliendo 16,7 mg di OX in 1 ml di acetone e mescolando 750 ml di soluzione / acetone OX con 250 ml di olio di oliva. Preparare la soluzione veicolo mescolando 750 ml di acetone con 250 &amp;# 181; l di olio d&#39;oliva. </li><li> Re-anestetizzare il mouse mediante iniezione ip di cocktail anestetico (2.1). Misurare lo spessore dell&#39;orecchio come prima. </li><li> Applicare 12,5 ml di 1,25% OX su ciascun lato dell&#39;orecchio destro. Applicare 12,5 ml di acetone / oliva soluzione veicolo olio su ciascun lato del orecchio sinistro. </li><li> Tenere il mouse separato dalla gabbia compagni fino alla completa guarigione per evitare insulto alle sue orecchie da altri topi, quindi sostituire il mouse nella sua gabbia originale e tornare alla struttura alloggiativa degli animali. NOTA: la rimozione dei capelli può provocare l&#39;infiammazione della pelle minore seguito dal cambiamento di spessore dell&#39;orecchio. Questa infiammazione minore sarà risolta 3 giorni più tardi confermata da spessore orecchio normale. Dopo l&#39;applicazione topica per 24 ore, le orecchie OX-trattati mostrano una significativa (p &lt;0.01) gonfiore soluzione veicolo rispetto orecchie solo trattati. </li></ol> 3. Etichettatura dei neutrofili in pIL1-DsRed Mice NOTA: In etichettatura vivo di neutrofili da una bassa dose di fluorescence-coniugato specifico per neutrofili mAb segue un protocollo sviluppato di recente 19. Iniezioni di retro-orbitale vengono eseguiti secondo un protocollo stabilito con alcune modifiche 24. <ol><li> Preparare la soluzione di lavoro anti-Ly6G mAb diluendo 10 ml di 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647 coniugato anti-Ly6G monoclonale (clone 1A8) in 90 ml di tampone fosfato (PBS). </li><li> Trasferire 100 ml di soluzione di lavoro anti-Ly6G monoclonale (50 mg / ml) in un U-100 di insulina siringa con l&#39;ago calibro 28. </li><li> Anestetizzare un adulto pIL1-DsRed topo mediante iniezione ip del cocktail anestetico descritto in precedenza (2.1). Posizionare l&#39;addome del mouse anestetizzato giù su una tavola di lavoro pulito. </li><li> Applicare leggera pressione verso il basso dorsale pelle e ventrale un occhio mouse per sporgere parzialmente bulbo oculare dalla presa. </li><li> posizionare accuratamente l&#39;ago, smussare giù, con un angolo di circa 30 ° al canto mediale nel retro-orbitaleseno. NOTA: L&#39;operatore può sentire la pressione, la penetrazione e resistenza sollevato una volta gli inserti ago nel seno. </li><li> Lentamente e senza intoppi iniettare 100 ml di anti-Ly6G mAb soluzione (5 mg mAb / mouse / iniezione) nel mouse di lavoro. Rimuovere rapidamente l&#39;ago. Una piccola quantità di sanguinamento suggerisce una iniezione di successo. </li><li> Applicare immediatamente 1,25% OX e la soluzione veicolo sul orecchio sinistro destro del mouse e. </li><li> Dopo 8 ore, somministrare 100 ml di soluzione preparata di recente anti-Ly6G monoclonale di lavoro (5 mcg mAb / mouse / iniezione) tramite iniezione retro-orbitale nello stesso mouse. </li><li> Per visualizzare i vasi sanguigni, immediatamente prima di imaging, somministrare 100 ml di 30 mg / ml di fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata destrano (150 kDa) mediante iniezione retro-orbitale. </li></ol> 4. Imaging intravitale di neutrofili adescamento in Pil-1-DsRed Mice <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezione ip di cocktail anestetico (2.1).0; Applicare una pomata veterinario per gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia per l&#39;imaging. <ol><li> Preparare 1 ml metà dose cocktail anestetico diluendo 500 ml di cocktail anestetico originale con un volume uguale di PBS. </li><li> Trasferimento mezza dose cocktail anestetico per 1 ml siringa con un ago calibro 27 farfalla. </li><li> Inserire l&#39;ago della farfalla in addome del mouse per via intraperitoneale e fissare l&#39;ala farfalla per l&#39;addome con nastro adesivo. </li></ol></li><li> Collocare un vetrino di vetro al centro del palcoscenico imaging. Nastro i bordi del vetrino per tenerlo in posizione. </li><li> Mettere una goccia di PBS sulla superficie ventrale dell&#39;orecchio del mouse nonché sul vetrino. </li><li> Posizione anestetizzato del mouse con il suo orecchio sopra il vetrino. Montare la punta di un orecchio, lato dorsale verso il basso, dal sandwiching l&#39;orecchio tra il vetrino e un vetrino, tenuto anche in luogo tramite nastro. </li><li> Accendere un multi-laser confocale microscopio a fluorescenza e tutta la relativa equipment. Spegnere luci della stanza per minimizzare l&#39;esposizione della luce ambiente. </li><li> Aprire il software di acquisizione immagini. Selezionare i canali laser per la rilevazione di coloranti fluorescenti nel menu Dye List. </li><li> Regolare il fuoco sulla pelle infiammata orecchio per l&#39;osservazione dei segnali verdi dai vasi sanguigni e segnali rossi delle cellule + DsRed attraverso oculare. </li><li> Eseguire una scansione veloce con velocità di scansione di 2 ms / pixel e una risoluzione di 512 × 512 pixel. Selezionare un pseudocolori per ogni canale nel menu Live View. Regolare la manopola di messa a fuoco per impostare la fine e iniziare posizione di scansione. </li><li> Eseguire scansioni lente con velocità di scansione di 4-8 msec / pixel e risoluzione di 800 × 800 o 1.024 × 1.024 pixel. Regolare l&#39;alta tensione, guadagno e offset su ciascun canale per massimizzare l&#39;intensità dei segnali evitando saturazione (pixel rossi). Ci dovrebbe essere solo pochi pixel rossi in ogni canale. </li><li> Creare set di immagini tridimensionali mediante la scansione di thla pelle e l&#39;orecchio a partire superficialmente nello strato corneo e procedendo verso il basso con x, y, z volumi di 317 micron × 317 micron × 30 micron (obiettivo 40X), 635 micron × 635 micron × 30 micron (obiettivo 20X), o 1.270 micron × 1.270 micron × 50 micron (obiettivo 10X) a 2 micron z-passi. NOTA: Lo strato corneo è lo strato più esterno dell&#39;epidermide e può essere facilmente localizzati sulla forte segnale di autofluorescenza. </li><li> In esperimenti di imaging time-lapse, registrare le immagini tridimensionali ogni 2 o 4 min per un massimo di 8 ore. </li><li> A intermittenza, come il mouse comincia a recuperare dall&#39;anestesia, ha osservato basata sull&#39;osservazione di baffi spasmi, somministrare 5 - 10 ml di mezza dose di anestesia cocktail con ago a farfalla. NOTA: Siate prudenti della dose di anestesia - sovradosaggio può causare la morte del mouse. In alternativa, anestesia per inalazione in un vaso potrebbe essere applicato al mouse per anestesia breve termine econo potrebbe essere utilizzata per l&#39;imaging a lungo termine. </li><li> Rimuovere il mouse anestetizzato dalla fase in cui l&#39;imaging è completa. Staccare il nastro e rimuovere ago a farfalla dal ventre del mouse. Ritorna il mouse in una gabbia separata nella struttura stabulazione degli animali. NOTA: Per l&#39;imaging a breve termine (&lt;1 ora), i topi riprendersi completamente dall&#39;anestesia rapidamente in 1-3 ore. Per l&#39;imaging a lungo termine (~ 8 ore), i topi recuperare lentamente, con un tipico periodo di recupero di 12 - 16 ore. Così, la somministrazione orale di acqua è raccomandato almeno diverse volte durante il periodo di recupero per evitare una grave disidratazione. </li><li> Processo set di dati di imaging, monitorare le singole cellule, generare percorsi migratori, e calcolare la direzionalità e la velocità di migrazione delle cellule utilizzando immagine software di analisi 25. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) confo...

I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi 1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono &quot;innescato&quot; da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all&#39;arrivo in un sito di infiammazione 2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate in vitro 3,4; Tuttavia, il monitoraggio dinamico del processo in vivo non è stato possibile finora. Recentemente, l&#39;imaging intravitale è diventata una tecnica importante per la visualizzazione e quantificare le dinamiche cellulari di processi biologici degli organismi viventi. IntraviImaging tal può essere effettuato tramite convenzionale eccitazione microscopia one-photon (ad esempio, confocale) o multiphoton microscopia avvicina 5. Nel corso del tempo, sostanziali miglioramenti sono stati raggiunti in questa tecnica che consente una maggiore risoluzione delle immagini, una maggiore profondità delle immagini, riduzione fotodanneggiamento del tessuto, e una maggiore 6,7 stabilizzazione delle immagini. Data la sua capacità unica di consentire la visualizzazione dinamica di migrazione cellulare e l&#39;interazione con il tempo, la microscopia intravitale è stato ampiamente applicato a diverse aree di studio in immunologia 8. l&#39;imaging intravitale consente immunologi di comprendere e contestualizzare le risposte immunitarie, sia a livello cellulare e molecolare in modelli animali vivere meglio. I recenti progressi nella transgenici e knock-in topi reporter hanno fornito strumenti utili per il monitoraggio dei comportamenti dinamici di neutrofili negli animali viventi. Il lisozima M promotore-driven maggiore proteina fluorescente verde knock-ini topi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la motilità dei neutrofili, monociti e macrofagi durante i vari processi infiammatori tra cui stravaso, infezione batterica, e l&#39;infiammazione sterile 9-15. Inoltre, i topi transgenici che esprimono una fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia biosensore citoplasmatica sono stati impiegati nello studio delle attività di neutrofili mitogeno chinasi extracellulare-regolamentato e la proteina chinasi A all&#39;interno dell&#39;intestino infiammato 16. Un modello murino con alta specificità per l&#39;espressione di fluorescenza nei neutrofili è il mouse Catchup knock-in, che produce Cre ricombinasi, nonche la tdTomato proteina fluorescente, che si è accoppiata espressione di linfociti antigene 6G (Ly6G) 17. Visualizzazione dei neutrofili Ly6G-deficienti attraverso questo modello ha dimostrato che queste cellule esercitano funzionalità normale in una varietà di contesti infiammatori vivo sterili o infettive. topi transgenici che esprimono la DsRed fluorescente protein gene sotto il controllo del mouse interleuikin-1β (IL-1β) promotore (pIL1-DsRed) sono stati utilizzati per visualizzare i comportamenti motilità delle cellule che producono IL-1b - ritenuto includere neutrofili, monociti infiammatori e macrofagi attivati ​​- emergente in pelle infiammata 18. In vivo etichettatura può servire come un approccio alternativo per tracciare i comportamenti cellulari e molecolari di neutrofili nei tessuti infiammati. Dopo l&#39;iniezione endovenosa di basse dosi di fluorescente anti- Gr-1-anticorpo monoclonale (mAb), la cascata reclutamento di Gr-1 + neutrofili è stata visualizzata in lesioni cutanee topo con infezioni da Staphylococcus aureus 19. Somministrazione in vivo di coniugati contenenti streptavidina coniugati 705 nm punti quantici e biotinilato anti-Ly6G mAb etichetta specificamente neutrofili circolanti 20. Inoltre, endocitosi di tali coniugati in neutrophIL vescicole permette il monitoraggio del trasporto delle vescicole ad alta velocità nei neutrofili migrano nell&#39;interstizio. In vivo etichettatura con anticorpi fluorescenza coniugato contro P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e chemochine (CXC motivo) recettore 2 (CXCR2) in un modello infiammatoria TNF-indotta ha chiarito i meccanismi di regolazione in gioco durante l&#39;infiammazione precoce 21. neutrofili polarizzati sporgono uropodi PSGL-1-arricchito di interagire con CD62L presenti sulle piastrine attivate, con la conseguente ridistribuzione di CD11b e CXCR2, recettori che guidano la migrazione dei neutrofili e avviano l&#39;infiammazione. IL-1β è uno dei geni di firma che è elevata in neutrofili innescato 22. In topi reporter pIL1-DsRed, segnali di fluorescenza DsRed (es., L&#39;attivazione del promotore di IL-1β) correlano positivamente con IL-1β mRNA espressione e la produzione di proteine ​​di IL-1β. &lt;sup&gt; 18 per monitorare il processo di neutrofili adescamento, un metodo di microscopia intravitale è stato sviluppato coinvolgendo l&#39;induzione di infiammazione della pelle con oxazolone (OX) nel modello murino pIL1-DsRed seguente etichettatura in vivo dei neutrofili con fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb. Attraverso questo modello, è possibile studiare il comportamento e la funzione dei neutrofili innescato in modelli animali di varie malattie e disturbi.

<table><tbody><tr><td>Eparina sodica</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Church & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-topo Anticorpo Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina U-100 con ago da 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Set per infusione a farfalla (ago da 27 G)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalimetro</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intravitale di neutrofili adescamento utilizzando il-1b promoter-driven dsred topi reporter

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L&#39;adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l&#39;esistenza e l&#39;importanza di neutrofili adescamento durante l&#39;infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed - usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili - ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l&#39;imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l&#39;imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l&#39;esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.

Proiezione di topi pIL1-DsRed è effettuata sulla base del segnale di fluorescenza fenotipica DsRed prodotto dai loro leucociti del sangue periferico mediante citometria a flusso. Stimolazione LPS è nota per indurre la produzione di IL-1β in cellule mieloidi, tra cui i neutrofili, monociti e cellule dendritiche 26-28. Così, leucociti isolati vengono incubate con LPS per 4 ore prima di citometria a flusso di analisi. Avanti, gating è fissato per viene misurata in questa popolazi...

Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di presentare una tecnologia per il monitoraggio del processo di priming dei neutrofili negli animali viventi. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dell'immunologia, come la visualizzazione del comportamento e della funzione di priming dei neutrofili in modelli animali delle malattie e dei disturbi più rari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina tre metodologie consolidate, tra cui i reporter fluorescenti nella marcatura virale e nell'imaging intravitale.Alleva topi eterozigoti pIL1-DsRed con C57Black wild-type sei topi. A tre o quattro settimane, fenotipizzano i loro cuccioli. Per ogni cucciolo, preparare una provetta da 1,5 millilitri con 20 microlitri di eparina.Per raccogliere il sangue, tieni un cucciolo per la collottola e perfora la vena sottomandibolare nella tasca guanciale usando una lancetta da 5 millimetri. È necessaria solo una piccola foratura. Raccogli da tre a cinque gocce di sangue per tubo.Dopo aver effettuato la raccolta, assicurati di fermare l'emorragia e osserva gli animali per 30 minuti prima di riportarli alla struttura per animali. A ciascuna provetta del campione, aggiungere 500 microlitri di tampone per la lisi dei globuli rossi. Quindi, agitare i tubi e incubarli per cinque-10 minuti sul ghiaccio.Dopo l'incubazione, aggiungere lentamente da 400 a 500 microlitri di siero fetale bovino sotto le sospensioni cellulari in ciascuna provetta. Dovrebbe formarsi un'interfaccia chiara tra gli strati. Quindi, centrifugare i campioni a 1.500 Gs per cinque minuti per raccogliere i pellet cellulari.Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di terreno RPMI-1640 completo. Quindi, trasferire ciascuna sospensione in una provetta per citometria a flusso e aggiungere 20 microlitri di soluzione di lavoro LPS appena preparata in ciascuna provetta. Incubare i campioni per quattro ore prima di eseguire la citometria a flusso.Per iniziare, anestetizzare il topo con un'iniezione intraparetoneale di un cocktail anestetico e confermare un'adeguata sedazione con un test di pizzicamento delle dita. Quindi, applica la crema depilatoria sulla superficie dorsale di entrambe le orecchie, asciugala entro un minuto e lava la pelle con acqua. Misurare lo spessore dell'orecchio in cui sono state effettuate le applicazioni utilizzando un micrometro.Successivamente, rimetti il topo nella sua gabbia dopo che si è ripreso dall'anestesia e lascia riposare il topo per almeno tre giorni prima di ulteriori test. Dopo tre giorni, anestetizzare il topo e misurare nuovamente lo spessore dell'orecchio per assicurarsi che non sia irritato. Quindi, applicare 12,5 microlitri di oxazolone all'1,25% su ciascun lato dell'orecchio destro e applicare 12,5 microlitri della soluzione di acetone olio d'oliva su ciascun lato dell'orecchio sinistro.Come sempre, osservare il topo riprendersi dall'anestesia. 24 ore dopo, misurare nuovamente lo spessore dell'orecchio in anestesia per assicurarsi che si sia verificata l'infiammazione cutanea indotta dall'oxazolone. Per iniziare, trasferire 100 microlitri di anticorpo monocolonale anti-lisi XG in una siringa da insulina U100 con un ago calibro 28.Successivamente, anestetizzare un topo trattato come descritto in precedenza. Con l'addome del topo rivolto verso il basso, applicare una leggera pressione verso il basso sulla pelle dorsale e ventrale su un occhio per sporgere parzialmente il bulbo oculare. Quindi, posizionare con cura l'ago, smussarlo verso il basso, a circa 30 gradi rispetto al canto mediale e inserire con cautela l'ago nel seno retroorbitale.La pressione di penetrazione verrà alleviata quando l'ago entra nel seno. Quindi, espellere il contenuto e rimuovere rapidamente l'ago. Una piccola quantità di sanguinamento suggerisce il successo dell'iniezione.Ora, applicare immediatamente l'oxazolone all'1,25% e la soluzione del veicolo sulle orecchie del mouse destra e sinistra come prima. Otto ore dopo, somministrare una seconda dose dello stesso anticorpo in ciascun topo. Inoltre, per visualizzare i vasi sanguigni, somministrare retroorbitalmente 100 microlitri di fitc destrano.Per questa procedura, anestetizzare prima il topo come prima. Quindi, applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'imaging. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetti di vetro al centro di un tavolino di imaging e fissare i bordi del vetrino coprioggetti con del nastro adesivo.Inoltre, aggiungi una goccia di PVS al vetrino coprioggetti. Ora, posiziona l'orecchio del topo sopra il vetrino coprioggetti, con la parte dorsale rivolta verso il basso. Quindi, inumidisci la superficie ventrale dell'orecchio del topo con una goccia di PVS.Quindi, montare la punta dell'orecchio con un vetrino sulla parte superiore e fissare il vetrino con del nastro adesivo. Ora, accendi un microscopio confocale a fluorescenza multi laser e la relativa attrezzatura. Spegni le luci della stanza per ridurre al minimo l'esposizione alla luce ambientale.Quindi, registra immagini tridimensionali utilizzando il microscopio confocale. Per gli esperimenti di imaging time lapse, registra immagini tridimensionali ogni due o quattro minuti per un massimo di otto ore. Per tutto il tempo, fai attenzione ai baffi che si contraggono, il che indica che il topo sta iniziando a riprendersi dall'anestesia.In tali situazioni, somministrare da cinque a 10 microlitri di mezza dose di cocktail anestetico tramite un ago a farfalla. pIL-1-DsI topi rossi sono stati sottoposti a screening per la fluorescenza fenotipica DsRed prodotta nei leucociti del sangue periferico tramite citometria a flusso. Le cellule mieloidi circolanti di topi wild-type esprimono minimamente DsRed, mentre le stesse cellule di topi pIL1-DsRed esprimono segnali DsRed distinguibili.L'attivazione del promotore beta di IL-1 è un marcatore del priming dei neutrofili e può essere meglio visualizzata nei topi viventi pIL-1DsRed. Successivamente, un sensibilizzante della pelle, l'oxazolone, è stato applicato localmente all'orecchio destro. Successivamente, i neutrofili sono stati marcati prima e dopo una seconda applicazione del sensibilizzante oxazolone tramite iniezione retroorbitale.Allo stesso modo, il destrano fitc è stato iniettato per localizzare i vasi sanguigni. Molte cellule doppie marcate sono state trovate nello spazio extravascolare, che rappresentano neutrofili innescati. Un piccolo numero di cellule è stato marcato solo dall'anticorpo liso XG, che probabilmente erano neutrofili a riposo.Inoltre, è stata osservata una piccola popolazione di cellule DsRed positive, che possono comprendere monociti infiammatori e macrofagi attivati. I percorsi migratori cellulari sono stati tracciati per confrontare le due popolazioni di neutrofili. Entrambe le popolazioni di neutrofili hanno mostrato una migrazione casuale una volta entrati nello spazio extracellulare.È interessante notare che i neutrofili putativamente innescati hanno mostrato una velocità significativamente più elevata rispetto alle loro controparti putativamente a riposo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia. Due esplorano il comportamento e la funzione di molte cellule immunitarie in vari stati infiammatori che coinvolgono diverse cellule t.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare il processo dinamico del priming dei neutrofili negli animali viventi.

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Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.

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Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Questo video mostra l'imaging in vivo per studiare le dinamiche di reclutamento dei neutrofili in un sito di infezione in un topo transgenico immunocompromesso con neutrofili che esprimono GFP. Comporta l'iniezione di batteri luminescenti per causare un'infezione. Ciò porta al reclutamento di neutrofili nel sito di infezione, il cui tracciamento viene effettuato mediante imaging.

Monitoraggio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili e della carica batterica nel sito di infezione in un modello murino

Questo video dimostra una tecnica in vivo per valutare un antigene di prova inducendo un'infiammazione cutanea in un modello murino. L'antigene del test, un aptene in una soluzione di olio/acetone, viene applicato localmente sulla pelle dell'orecchio del topo e l'infiammazione della pelle viene valutata dopo un periodo adeguato.

Una tecnica per valutare la risposta immunitaria contro un antigene inducendo l'infiammazione della pelle

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell'orecchio di topi anestetizzati.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

Impara a monitorare il priming dei neutrofili in animali vivi utilizzando reporter fluorescenti e imaging intravitale. Questo metodo combina tecniche avanzate per studiare le risposte immunitarie in modelli di malattie rare.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

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