Name: Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dellartrite reumatoide pazienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte da sinoviociti fibroblasti di pazienti con artrite reumatoide usando un sistema lentivirale senza cellule feeder. Questo protocollo facilita lo studio della patologia articolare.

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Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca finanziato dai Centri Coreani per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (HI13D2188).

Etica Dichiarazione: Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell&#39;Università Cattolica di Corea (KC12TISI0861). 1. Isolamento sinoviociti ed espansione <ol><li> Isolamento sinoviociti <ol><li> Sterilizzare due paia di forbici chirurgiche e un paio di pinze. </li><li> Trasferire il tessuto sinoviale ad un piatto 100 mm e lavare con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Tagliare i residui di tessuto grasso e ossa giallastre. Trasferire il tessuto tagliato per un pozzo di un 6-pozzetti e aggiungere 5 ml di terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) con il 20% di siero fetale bovino (FBS). </li><li> Tagliare i tessuti con le forbici finché i pezzi sono abbastanza piccole da penetrare in una pipetta monouso. </li><li> Trasferire il supporto tissutale contenente in una provetta conica da 50 ml. Raccogliere il materiale rimanente aggiungendo 5 ml di DMEM con 20% FBS a 6 pozzetti e poi trasferire al tubo. &lt;/ Li&gt; <li> collagenasi disgelo sul ghiaccio. Aggiungere collagenasi ad una concentrazione finale di 0,01% e sigillare il tubo con parafilm. Incubare a bagnomaria a 37 ° C con agitazione per 4 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, riempire il tubo con DMEM con 20% FBS, finché il volume totale è 50 ml e centrifugare a 300 xg, RT per 10 min. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 40 ml di media per risospendere il pellet. </li><li> Ripetere i passaggi 1.1.10-1.1.11. </li><li> Risospendere il pellet in 25 ml di DMEM con 20% FBS e aspettare che i grandi ciuffi di tessuto a depositarsi sul fondo. </li><li> Trasferire il supernatante in un piatto 100 mm e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 14 giorni. </li></ol></li><li> Sinoviociti mantenimento e l&#39;espansione <ol><li> Eliminare i supporti utilizzati dalla piastra e lavare le cellule con 5 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 2 min. </li><li> Toccare il piatto delicatamente e transfer le cellule in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le cellule a 250 xg, RT per 2 min. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 30 ml di DMEM con 20% FBS. </li><li> Trasferire le cellule a 3 x 100 mm piatti, senza lasciare alcun materiale residuo visibile. </li><li> Sostituire il supporto con mezzi freschi ogni 3 d. Dividere le cellule a 80% di confluenza con 1 ml di PBS / 1 mM EDTA. Mantenere fino a passaggio 3 prima dell&#39;uso. Dividere ogni piatto di cellule in 3 piatti in ogni frazione. NOTA: Dopo aver raggiunto il passaggio 3, cellule che non stanno per essere utilizzato immediatamente possono essere congelati. </li></ol></li></ol> 2. Riprogrammazione FLSS Utilizzando Lentivirus-codificano fattori di Yamanaka <ol><li> Trasduzione (D0) <ol><li> Seed 3 × 10 4 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti in terreni di crescita (500 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina). Incubare le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Il giorno seguente, togliere un flaconcino di lentivirus contenente 4 Yamanaka fattori: Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc dal freezer e scongelare a 4 ° C. Nota: Lentivirus è stato prodotto mediante il procedimento descritto nel precedente studio 11. </li><li> Mentre lo scongelamento il virus, cambiare i mezzi di comunicazione a supporto della crescita FLS (20% FBS più antibiotici in DMEM) contenente 10 mg / ml di bromuro hexadimethrine e acido ascorbico 50 mg / ml. </li><li> Dopo aver cambiato i media, aggiungere 30 ml di lentivirus alle cellule e mescolare delicatamente. Per migliorare l&#39;infezione, centrifugare la piastra a 680 xg, 35 ° C per 30 min. </li><li> Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol></li><li> Manutenzione fino riprogrammazione è visibile <ol><li> Per 3 giorni, sostituire il supporto giornaliero con i media la crescita FLS contenente 0,1 mm butirrato di sodio e acido ascorbico 50 mg / ml. </li><li> Il giorno successivo, sostituire il supporto con una miscela di mezzi di crescita FLS esupporti COPSI (rapporto 1: 1) contenente 0,1 mM di butirrato di sodio e acido ascorbico 50 mg / ml. Nota: I componenti del supporto IPSC è dato nella lista materiali / attrezzature. </li></ol></li><li> Dividere le celle di Colony Formazione <ol><li> Preparare un 6-pozzetti vitronectina rivestite. <ol><li> Aggiungere 60 ml vitronectina a 6 ml di PBS senza Ca 2+ e Mg 2+. Mettere 2 ml di miscela in ciascun pozzetto ed incubare a RT per almeno 1 ora. Nota: La concentrazione di lavoro del vitronectina è di 5 mg / ml. </li></ol></li><li> In D5, lavare le cellule con PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 min. </li><li> Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg, RT per 2 min. </li><li> Dividere le celle a 3 diversi rapporti (1: 3, 1: 6 e 1: 9) per ottenere diversi confluencies. Aggiungere 900 ml di media per il pellet e risospendere. Aggiungere 300, 150, e 100 microlitri della miscela di cellule per pozzetto di una 6-pozzetti per ottenere un rapporto di 1: 3, 1: 6 e 1: 9, rispettivamente. </li><li> Sostituire il supporto giornaliero con i media IPSC fino all&#39;apparizione di colonie. Le colonie vengono visualizzati dopo circa D18. Nota: In questa fase, le colonie IPSC coesistere con il FLSS non riprogrammato. </li></ol></li><li> Colony raccolta <ol><li> Preparare una piastra vitronectin rivestita 48 pozzetti aggiungendo 500 microlitri vitronectin ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li><li> Posizionare il microscopio su una panchina pulita, e rimuovere la piastra da 6 pozzetti dal termostato. </li><li> Rimuovere la soluzione vitronectin dalla piastra 48 pozzetti e aggiungere 500 microlitri mezzi IPSC integrato con 10mM Rho-associata, coiled-coil contenente proteina chinasi (ROCK) inibitore. </li><li> Utilizzando una punta 10p pipetta, tagliare intorno alla colonia. Trasferire la colonia scelto per un pozzetto della piastra a 48 pozzetti. </li><li> Dopo la raccolta diverse colonie, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Mantenere le cellule fino a quando le colonie sono grandi enough per il trasferimento. Nota: Noi di solito rovesciato le cellule quando la colonia esce dal campo visibile del microscopio, se visti a ingrandimento 100X. </li></ol></li></ol> 3. immunofluorescenza colorazione <ol><li> Preparazione delle cellule <ol><li> Posizionare un vetro di copertura sterile, 18 millimetri in un 12-pozzetti. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS raffreddare e risciacquare il vetro di copertura. </li><li> Sostituire con 1 ml di una soluzione 10 mg / ml vitronectina. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li><li> Scartare la soluzione vitronectina e iPSCs piastra in 12 pozzetti vitronectina rivestite e cultura per 7 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2, cambiando i media giornaliera. </li></ol></li><li> La colorazione delle cellule <ol><li> Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS una volta. </li><li> Fissare le cellule in 0,4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT. </li><li> Permeabilize le cellule con 0,1% Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la permeabilizzazionesoluzione e blocco con PBS contenente 2% di albumina di siero bovino (BSA) per 30 minuti a RT. </li><li> Diluire gli anticorpi in PBS contenente 2% BSA in base alla tabella 1. Incubare le cellule con gli anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo secondario (diluito 1: 200) e incubare le cellule per 1 ora a RT, evitando la luce. </li><li> Trattare le cellule con 1 ml / ml DAPI per 10 min. </li><li> Posizionare il vetro coperchio sulla parte superiore del vetrino con antifade reagente e incubare a temperatura ambiente per 24 ore, evitando la luce. </li><li> Verifica un&#39;espressione con un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol> 4. in tempo reale Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) <ol><li> Estrarre mRNA dal pellet cellulare utilizzando il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione 11. </li><li> Amplificare cDNA da 2 mg di mRNA totale utilizzando la trascrizione inversa 11. </li><li> Miscelare i componenti necessari per la PCR usando 2 ml di cDNA TEMpiatto 11. </li><li> Eseguire la RT-PCR e verificare i risultati di elettroforesi su gel 11. </li></ol> 5. fosfatasi alcalina (AP) La colorazione <ol><li> IPSCs di coltura per 5-7 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2 prima della colorazione. </li><li> Aspirare media e fissare le cellule con 4% PFA per 1 min. </li><li> Eliminare il fissativo e lavare le cellule con tampone di lavaggio 1X. </li><li> Preparare i reagenti per AP colorazione. Mescolare i reagenti nelle seguenti proporzioni: Fast Red Violet: soluzione di fosfato naftolo AS-BI: acqua = 2: 1: 1. </li><li> Incubare le cellule con la soluzione colorante a temperatura ambiente per 15 min, evitando la luce. </li><li> Eliminare la soluzione colorante e lavare le cellule con tampone di risciacquo. </li><li> Coprire le cellule con PBS per prevenire l&#39;essiccazione e verificare espressione utilizzando un microscopio campo chiaro. </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Prima della scoperta di iPSCs, gli scienziati hanno utilizzato principalmente CES per studiare la biologia delle cellule staminali e di altre linee cellulari attraverso la differenziazione. Tuttavia, CES provengono dalla massa interna della blastocisti, che è un embrione in fase iniziale. Per isolare CES, la distruzione della blastocisti è inevitabile, sollevando questioni etiche che sono impossibili da superare. Inoltre, anche se i CES hanno caratteristiche di staminalità e pluripotenza, non possono essere ottenuti da ...

Le cellule staminali pluripotenti sono la piattaforma di prossima generazione in vari campi clinici e biologici. Sono uno strumento promettente che può essere utilizzato in modelli di malattia, screening di farmaci, e la terapia medica rigenerativa. Umani cellule staminali embrionali (hESC) sono stati utilizzati principalmente per studiare e comprendere le cellule pluripotenti. Tuttavia, isolato dalla distruzione della blastocisti umana, hESC sono associati a diverse preoccupazioni etiche. Nel 2007, il dottor Shinya Yamanaka e il suo team invertito il processo di programmazione delle cellule e hanno sviluppato le cellule staminali adulte da cellule somatiche umane 1,2. Pertanto, a differenza di hESC, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) possono essere generati da cellule somatiche mature, evitando gli ostacoli etici. Di solito, iPSCs vengono generati con la consegna di quattro geni esogeni: Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questi fattori Yamanaka sono originariamente forniti con sistemi lentivirali e retrovirali. I primi iPSCs sono stati ottenuti da topo somatica cells 3. Successivamente, la tecnica è stata applicata ai fibroblasti dermici umani 1,2. Studi successivi hanno generato con successo iPSCs da varie fonti, come ad esempio urina 4, il sangue 5,6, i cheratinociti 7, e diversi altri tipi di cellule. Tuttavia, ci sono alcune cellule somatiche che non sono stati utilizzati nella riprogrammazione, e lo screening delle capacità riprogrammazione dei vari tipi di cellule provenienti da tessuti specifici in stato di malattia, è ancora necessaria. L&#39;artrite reumatoide (AR) è una malattia che può colpire tutte le articolazioni e portare a condizioni autoimmuni in altri organi. RA colpisce circa l&#39;1% degli adulti nel mondo sviluppato. Si tratta di una malattia piuttosto comune e la sua incidenza aumenta ogni anno 8. Tuttavia, RA è difficile da individuare nelle fasi iniziali e oncebone distruzione si verifica non esiste alcun trattamento in grado di recuperare il danno. Inoltre, l&#39;efficacia dei farmaci differisce da paziente a paziente, ed è difficile prevedere il medicoine che è richiesto. Pertanto, è necessario lo sviluppo di un metodo di screening droga, ed è richiesto un materiale cella che può riflettere le condizioni di RA. Sinoviociti fibroblasto-simili (FLSS) sono un partecipante cellulare attivo nella patogenesi di RA 9,10. FLSS esiste nel rivestimento intimale sinoviale tra la capsula articolare e la cavità, che viene indicato anche come sinovia. Sostenendo la struttura comune e fornendo nutrienti alla cartilagine circostante, FLSS di solito giocano un ruolo cruciale nella funzione e la manutenzione delle articolazioni. Tuttavia, FLSS in AR hanno un fenotipo invasivo. RA FLSS hanno un fenotipo cancro-come, eventualmente distruggendo l&#39;osso circostante dalla proliferazione infinita 10. Con questa caratteristica unica, FLSS può essere utilizzato come materiale promettente che può riflettere la pathobiology di RA. Eppure, queste cellule sono raramente prodotte, ei fenotipi cellulari alterano le cellule passano attraverso diversi passaggi in vitro </eM&gt; condizioni. Pertanto, può essere complicato da usare RA FLSS come uno strumento che può rappresentare la condizione del paziente. Teoricamente, RA iPSCs paziente-derivati ​​(RA-iPSCs) possono diventare uno strumento ideale per lo screening di farmaci e ulteriori ricerche. IPSCs generati hanno la capacità di auto-rinnovamento e possono essere mantenuti e ampliati in vitro. Con pluripotenza, queste cellule possono essere differenziate in maturi condrociti e osteociti lignaggi, che possono contribuire materiale cellulare per la ricerca specifica in AR e altre malattie delle ossa legate 11. In questo studio, abbiamo dimostrato come isolare ed espandere FLSS da una sinovia rimosso chirurgicamente, e come generare RA-iPSCs da FLSS utilizzando lentivirus contenenti fattori di Yamanaka.

<table><tbody><tr><td>Piastra da 100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Provetta cornica da 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Provetta cornica da 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso da 10 ml</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso da 5 ml</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS Materiali di isolamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiche</tr><tr><td>Pinza</td><td></td><td></td><td></td>chirurgica</tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>iPSC Generation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>iPSC media ingredient (500 ml)</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>iPSC media ingredient (Conc.: 543 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>iPSC media ingrediente&nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Integratore multimediale per transfferina</td><td>umana Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC (Conc.: 10.7 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Ingrediente base del terreno FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC&nbsp; (Conc.: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Insulina umana</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>iPSC media ingrediente (Conc.: 20 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>TGF umano&beta; 1</td> ingrediente del terreno <td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC (Conc.: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>iPSC ingrediente del terreno (Conc.: 64 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Polibrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ROCK</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Controllo della qualità Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Vetro di copertura</td><td>superiore</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldiide (PFA)</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Klf4 Abcam</td><td></td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo</td><td>Sonda molecolare</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpo</td><td>Sonda molecolare</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonda molecolare</td> <td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento in oro prolungato</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino, rivestito</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Kit di sintesi del cDNA del primo filamento</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polimerasi</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>stella di carico</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) marcatore a scala del DNA</td><td>Enzimiche</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da giunti dell&#39;artrite reumatoide pazienti

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

cellule somatiche maturi possono essere invertiti in uno stato di cellule staminali pluripotenti, come usando un insieme definito di fattori di riprogrammazione. Numerosi studi hanno generato indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) da vari tipi di cellule somatiche da trasduzione quattro fattori di trascrizione Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Lo studio di iPSCs rimane all&#39;avanguardia della ricerca biologica e clinica. In particolare, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati come strumento pionieristica per lo studio della malattia pathobiology, poiché iPSCs possono essere indotte dal tessuto di ogni individuo. L&#39;artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria cronica, classificati per la distruzione della cartilagine e struttura ossea nelle articolazioni. iperplasia sinoviale è uno dei motivi principali o sintomi che portano a questi risultati in RA. Sinoviociti fibroblasti-like (FLSS) sono le principali cellule del componente della membrana sinoviale iperplastica. FLSS nel giunto senza limiti proliferano, alla fine invadere il cartil adiacenteetà e osso. Attualmente, la membrana sinoviale iperplastica può essere rimosso solo da un intervento chirurgico. La sinovia rimosso viene utilizzato per la ricerca RA come un materiale che riflette la condizione infiammatoria dell&#39;articolazione. Come un giocatore importante nella patogenesi della RA, FLSS può essere utilizzato come materiale per generare e studiare le iPSCs di pazienti affetti da AR. In questo studio, abbiamo usato il FLSS di un paziente RA per generare iPSCs. Utilizzando un sistema lentivirale, abbiamo scoperto che FLSS può generare RA paziente-specifici IPSC. I iPSCs generati da FLSS possono essere ulteriormente utilizzati come strumento per studiare la fisiopatologia della RA in futuro.

In questo studio, descriviamo un protocollo per generare iPSCs da FLSS utilizzando un sistema lentivirale. La figura 1A mostra un semplice schema del protocollo di isolamento FLS. Dopo la rimozione chirurgica della membrana sinoviale, il tessuto è stato tagliato in piccoli pezzi con le forbici chirurgiche. Collagenasi inserito isolare le cellule dai ciuffi di tessuto. Le cellule sono state incubate per 14 giorni prima di ulteriori trasformazioni. Figura ...

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali indotte pluripotenti-umani da sinoviociti fibroblasti come derivati ​​da pazienti, utilizzando un sistema lentivirale senza cellule di alimentazione.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell&#39;artrite reumatoide pazienti

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è generare cellule staminali pluripotenti indotte, o IPC, da sinoviociti di tipo fibroblasto isolati dal tessuto sinoviale di un'articolazione infiammata da artrite reumatoide. Attualmente, le cellule staminali pluripotenti indotte possono essere generate da diverse cellule primarie umane. Abbiamo generato con successo cellule staminali pluripotenti indotte da sinoviociti umani di tipo fibroblasto, che rappresentano le cellule patologiche chiave delle articolazioni reumatoidi.Questo può aiutare a studiare la patologia dell'artrite reumatoide. Questo approccio periodico può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla degenerazione delle IPSC, utilizzando RA-FLSs. Iniziare ponendo il tessuto sinoviale in una piastra da 100 millimetri e lavando il tessuto con 5 millilitri di PBS integrato con antibiotici.Rimuovere il tessuto adiposo giallastro e i residui ossei. Trasferire quindi il tessuto tagliato in una pozzetta di una piastra a sei pozzette contenente 5 millilitri di DMEM integrato con FBS e utilizzare le forbici per tritare il tessuto fino a quando i pezzi sono abbastanza piccoli da poter penetrare nella punta di una pipetta monouso. Trasferire il mezzo in un tubo conico da 50 millilitri, quindi aggiungere 5 millilitri di DMEM fresco più FBS nella pozzetta per raccogliere eventuali residui di tessuto e trasferire l'intero contenuto della pozzetta nel tubo.Successivamente, aggiungere la collagenasi scongelata al ghiaccio fino a una concentrazione finale dello 0,01% al tubo e sigillare il tubo con pellicola parafilm per l'incubazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo quattro ore, riempire il tubo con DMEM fresco più siero fetale bovino fino a un volume finale di 50 millilitri e raccogliere i frammenti di tessuto mediante centrifugazione. Rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet, quindi risospendere le cellule in 40 millilitri di mezzo fresco per un'ulteriore centrifugazione.Risospendere il secondo pellet in 25 millilitri di DMEM fresco aggiunto di FBS e lasciare sedimentare i grandi aggregati di tessuto. Trasferire quindi il soprannatante in una nuova piastra da 100 millimetri e incubare i sinoviociti a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 14 giorni. Per espandere la coltura di sinoviociti, scartare il mezzo usato e lavare le cellule con 5 millilitri di PBS.Rimuovere il PBS e dissociare le cellule con 1 millilitro di EDTA nell'incubatore per colture cellulari per 2 minuti. Al termine dell'incubazione, battere delicatamente sulla piastra per staccare le eventuali cellule ancora aderenti e trasferire la sospensione cellulare ottenuta in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in 30 millilitri di DMEM e FBS e suddividere le cellule in 3 nuove piastre da 100 millimetri.Alimentare i sinoviociti con mezzo fresco ogni 3 giorni, suddividendo le cellule in 3 nuove colture al raggiungimento di una confluenza dell'80%, come appena illustrato. Al giorno zero della trasduzione, seminare 3 x 10⁴ FLS per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti con mezzo di crescita fresco, quindi incubare in overnight a 37 gradi Celsius in atmosfera al 5% di CO₂. Il giorno successivo, scongelare una provetta di lentivirus contenente i 4 fattori di Yamanaka a 4 gradi Celsius e sostituire il mezzo di coltura dei FLS con mezzo di crescita per FLS integrato con bromuro di esadimetrina e acido ascorbico.Una volta scongelato il contenuto della provetta, aggiungere 30 microlitri di lentivirus alle cellule e mescolare delicatamente per distribuire in modo omogeneo il virus. Per migliorare l'infezione, centrifugare la piastra e rimettere le cellule nell'incubatore, sostituendo il mezzo ogni giorno con mezzo di crescita FLS fresco contenente butirrato di sodio e acido ascorbico per 3 giorni. Al quarto giorno, sostituire il mezzo con una miscela di mezzo di crescita FLS e mezzo iPSC contenente butirrato di sodio e acido ascorbico.Al giorno 5 aggiungere 60 microlitri di vitronettina a 6 millilitri di PBS senza calcio e magnesio e ricoprire 3 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 2 millilitri di soluzione ciascuno per almeno un'ora a temperatura ambiente. Mentre la vitronettina si deposita, lavare le cellule transdotte con PBS e staccarle con EDTA come illustrato. Dopo aver raccolto le cellule dissociate mediante centrifugazione, risospendere il pellet in 900 microlitri di mezzo fresco.Rimuovere l'eccesso di vitronectina dai pozzetti e aggiungere 300, 150 e 100 microlitri di cellule in pozzetti singoli. Successivamente, reinserire le cellule nell'incubatore, sostituendo il mezzo giornalmente con mezzo iPSC fresco fino a quando non compaiono le colonie. Per il prelievo delle colonie, aggiungere prima 500 microlitri di mezzo iPSC, integrato con inibitore ROCK, in ciascun pozzetto di una piastra da 48 pozzetti rivestita con vitronectina.Quindi, posizionare le colture di FLS sotto un microscopio stereoscopico su un banco pulito ed utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per tagliare attorno a una colonia di interesse. Utilizzando una punta di pipetta da 200 microlitri, trasferire la colonia selezionata in 1 pozzetto della piastra a 48 pozzetti. Una volta raccolte tutte le colonie, posizionare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari fino a quando le colonie saranno abbastanza grandi da poter essere trasferite.Dividere le cellule quando le colonie escono dal campo visivo del microscopio, osservato a un ingrandimento di 100X. In questa immagine, è possibile osservare la morfologia dei FLS isolati dopo una coltura iniziale di 14 giorni. Le cellule mostrano le caratteristiche tipiche dei fibroblasti in generale, con un'espressione simile dei marcatori fibrotici vimentina e fibronectina, nonché una bassa espressione del marcatore delle sinoviociti di tipo macrofagico CD-68. Da 8 a 11 giorni dopo la trasduzione lentivirale con i fattori di Yamanaka, iniziano ad apparire piccole colonie che possono essere selezionate e amplificate per 5-10 passaggi.Queste iPSC dell'artrite reumatoide esprimono fosfatasi alcalina, indicando che rimangono indifferenziate. Le cellule esprimono inoltre marcatori di pluripotenza, come confermato dall'analisi di RT-PCR e di immunofluorescenza. Le iPSC dell'artrite reumatoide mostrano un profilo cromosomico normale di 44+XY, determinato mediante cariotipizzazione.Inoltre, 12 settimane dopo l'iniezione in topi SCID, le iPSC dell'artrite reumatoide hanno formato teratomi, che mostrano fenotipi tissutali diversi. La differenziazione nei diversi strati germinativi è stata confermata mediante colorazione immunofluorescente. Una volta acquisita la tecnica, le iPSC possono essere generate da FLS con il sinovio.Dopo aver visto il video, dovresti avere una migliore comprensione di come isolare i tessuti sinoviali e di come indurre il riprogrammazione utilizzandoli. Queste iPSC derivate da RAF-FLS possono essere utili per lo studio della rigenerazione o per lo screening di farmaci in reumatologia. Una volta stabilite queste iPSC, possono essere generate varie tipologie di cellule o organi bersaglio.che potrebbe essere utile per lo studio della malattia o per altre applicazioni future, come la modifica genica e così via.

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Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dellartrite reumatoide pazienti (Video) | JoVE Journal

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell'artrite reumatoide pazienti

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