Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte-Uso sinoviociti fibroblasti-come isolato da Giunti dell'artrite reumatoide pazienti

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte, o IPC, da sinoviociti simili a fibroblasti isolati dal tessuto sinoviale di un'articolazione infiammata da artrite reumatoide. Attualmente, le iPSC possono essere generate da varie cellule primarie umane. Abbiamo generato con successo iPSC da sinoviociti simili a fibroblasti umani, che sono le cellule patologiche chiave delle articolazioni reumatoidi.

Questo può aiutare a indagare la patologia dell'artrite reumatoide. Questo periodico può aiutare a rispondere a domande chiave sulla degenerazione delle IPSC, utilizzando RA-FLS. Inizia posizionando il tessuto sinoviale in un piatto da 100 millimetri e lavando il tessuto con 5 millilitri di PBS integrato con antibiotici.

Rimuovere il tessuto adiposo giallastro e i residui ossei. Quindi trasferire il tessuto tagliato in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente 5 millilitri di DMEM integrato con FBS e utilizzare le forbici per tritare il tessuto fino a quando i pezzi non sono abbastanza piccoli da penetrare in un puntale di pipetta usa e getta. Trasferire il terreno in una provetta conica da 50 millilitri, quindi aggiungere 5 millilitri di DMEM fresco più FBS al pozzetto per raccogliere il tessuto rimanente e trasferire l'intero contenuto del pozzetto nella provetta.

Successivamente, aggiungere la collagenasi scongelata con ghiaccio a una concentrazione finale dello 0,01% nella provetta e sigillare la provetta con parafilm per l'incubazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo quattro ore, riempire la provetta con DMEM fresco più FBS fino a un volume finale di 50 millilitri e raccogliere i frammenti di tessuto mediante centrifugazione. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, quindi risospendere le cellule in 40 millilitri di terreno fresco per un'altra centrifugazione.

Risospendere il secondo pellet in 25 millimetri di DMEM fresco più FBS e lasciare che i grossi grumi di tessuto si depositino. Quindi trasferire il surnatante in un nuovo piatto da 100 millimetri e incubare i sinoviociti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 14 giorni. Per espandere la coltura dei sinoviociti, scartare il terreno utilizzato e lavare le cellule in 5 millilitri di PBS.

Rimuovere il PBS e dissociare le cellule con 1 millilitro di EDTA nell'incubatore per colture cellulari per 2 minuti. Al termine dell'incubazione, picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule aderenti rimanenti e trasferire la sospensione cellulare risultante in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet in 30 millilitri di DMEM e FBS e dividere le celle in 3 nuove piastre da 100 millimetri.

Nutrire i sinoviociti con terreno fresco ogni 3 giorni, dividendo le cellule in 3 nuove colture all'80% di confluenza come appena dimostrato. Il giorno zero della trasduzione, vedere da 3 x 10 al 4° FLS per pozzetto su una piastra a 6 pozzetti in terreno di crescita fresco per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius al 5% di CO2. Il giorno successivo, scongelare 1 fiala di Lenti-virus contenente 4 fattori Yamanaka a 4 gradi Celsius e sostituire il terreno di coltura FLS con terreno di crescita FLS integrato con bromuro di esadimetrina e acido ascorbico.

Quando il contenuto della fiala si è scongelato, aggiungere 30 microlitri di lenti-virus alle cellule e mescolare delicatamente per distribuire uniformemente il virus. Per migliorare l'infezione, centrifugare la piastra e rimettere le cellule nell'incubatrice, sostituendo il terreno ogni giorno con un terreno di crescita FLS fresco contenente butirrato di sodio e acido ascorbico per 3 giorni. Il 4° giorno, sostituire il terreno con una miscela di terreno FLS growth e iPSC contenente butirrato di sodio e acido ascorbico.

Il giorno 5 aggiungere 60 microlitri di vitronectina a 6 millilitri di PBS senza calcio e magnesio e rivestire 3 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 2 millilitri di soluzione ciascuno per almeno un'ora a temperatura ambiente. Mentre la vitronectina si sta solidificando, lavare le cellule trasdotte con PBS e staccarle con EDTA come dimostrato. Dopo aver raccolto le celle dissociate mediante centrifugazione, risospendere il pellet in 900 microlitri di terreno fresco.

Rimuovere la vitronectina in eccesso dai pozzetti e aggiungere 300, 150 e 100 microlitri di cellule nei singoli pozzetti. Quindi rimetti le cellule nell'incubatrice, sostituendo il terreno ogni giorno con un terreno iPSC fresco fino alla comparsa delle colonie. Per prelevare le colonie, aggiungere prima 500 microlitri di terreno iPCS, integrato con inibitore ROCK, a ciascun pozzetto di una piastra da 48 pozzetti rivestita di vitronectina.

Quindi, posizionare le colture FLS sotto un microscopio da dissezione su un banco pulito e utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per tagliare intorno a una colonia di interesse. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, trasferire la colonia prelevata in 1 pozzetto della piastra da 48 pozzetti. Quando tutte le colonie sono state raccolte, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari fino a quando le colonie non sono abbastanza grandi per il trasferimento.

Dividere le cellule quando le colonie sono fuori dal campo visibile del microscopio, come visto a un ingrandimento 100X. In questa immagine, si può osservare la morfologia della FLS isolata dopo una coltura iniziale di 14 giorni. Le cellule presentano le caratteristiche dei fibroblasti in generale con un'espressione simile dei marcatori fibrotici vimentina e fibronectina, nonché una bassa espressione del marcatore sinoviocitario simile ai macrofagi CD-68.8 a 11 giorni dopo la trasduzione lenti-virale del fattore Yamanaka, iniziano a comparire piccole colonie che possono essere raccolte e amplificate per 5-10 passaggi.

Queste artrite reumatoide esprimono fosfatasi alcalina delle iPSC, indicando che rimangono indifferenziate. Le cellule esprimono anche marcatori pluripotenti, come confermato dalla RT-PCR e dall'analisi in immunofluorescenza. Le iPCS per l'artrite reumatoide mostrano un pattern cromosomico normale di 44+XY come determinato dal cariotipo.

Inoltre, 12 settimane dopo l'iniezione nei topi SCID, l'iPSC dell'artrite reumatoide ha formato un teratoma, che mostra diversi fenotipi tissutali. Con la loro differenziazione dello strato germinale confermata dalla colorazione immunofluorescente. Una volta padroneggiate, le iPSC possono essere generate da FLS con sinovia.

Dopo aver visto il video, dovresti avere una migliore comprensione di come isolare dal tessuto sinoviale e come indurre la riprogrammazione utilizzandoli. Queste iPSC derivate da RAF-FLS possono essere utili per studiare la rigenerazione o lo screening di farmaci in reumatologia. Una volta stabilite queste iPSC, è possibile generare vari tipi di cellule o organi bersaglio.

Che potrebbe essere utile per studiare la malattia o altre applicazioni future, come l'editing genetico e così via.