Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

L'obiettivo generale di questa procedura è la raccolta non invasiva del liquido sinoviale e del midollo osseo da maialini per raccogliere cellule staminali mesenchimali da utilizzare negli studi di rigenerazione e immunomodulazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia otologica con MSC, come ad esempio come stabilire il liquido sinoviale nelle MSC e come caratterizzarle rispetto alle MSC del midollo osseo. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di stabilire efficacemente le proprietà chiave del liquido sinoviale e delle MSC derivate dal midollo osseo dai maialini, che saranno utili per l'applicazione nei pazienti.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di varie malattie articolari, perché la popolazione delle MSC derivate dal liquido sinoviale nella cavità sinoviale è significativamente aumentata nei pazienti atletici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla medicina rigenerativa, può essere applicato anche ad altri studi come la ricerca sulle malattie autoimmuni. Poiché le MSC dei minipig sono autologhe, l'immunosoppressione potrebbe interessare gli esseri umani.

Oltre agli altri scienziati, a dimostrare la procedura saranno Hyeon-Jeong Lee e Won-Jae Lee del mio livello tre. Per iniziare, orientare un maialino anestetizzato per accedere alla cresta iliaca. Successivamente, depilare una regione di 15 centimetri quadrati sulla cresta iliaca, usando un rasoio o un tagliaunghie.

Quindi, strofinare alternativamente la pelle esposta tre volte con iodio povidone ed etanolo al 70%. Una volta completamente asciugati, applicare teli sterili. Ora, pre-rivestire una siringa da dieci millilitri con eparina, usando un risciacquo da tre a quattro millilitri.

Ciò impedirà al midollo osseo di coagulare durante l'estrazione. Quindi, precisamente sulla cresta dell'osso iliaco, collegare saldamente un estrattore di midollo osseo alla siringa rivestita di eparina ed estrarre almeno cinque millilitri di midollo osseo. Per isolare le cellule dal midollo osseo estratto, diluirlo prima con un volume uguale di DPBS in una provetta conica da 15 millilitri a temperatura ambiente.

Quindi, caricare tre millilitri di terreno di centrifugazione a densità in una seconda provetta conica da 15 millilitri. Quindi, trasferire con cura quattro millilitri di midollo osseo diluito sul mezzo di centrifugazione a densità per creare strati a due soluzioni. Centrifugare ora la provetta a 400 G per 40 minuti a temperatura ambiente.

Le multinazionali desiderate vengono raccolte nello strato bianco centrale. Aspirare solo questo strato. Espellere lo strato di MNC in una provetta conica da 15 millilitri e diluirlo con sette-otto millilitri di DPBS.

Quindi, centrifugare le celle a 500 Gs per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e lavare due volte le celle pallettizzate con dieci millilitri di DPBS, ripetendo il ciclo di centrifugazione precedente. Dopo i due lavaggi, sospendiamo le MNC in due millilitri di ADMEM.

Quindi, caricare le cellule su una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri e incubarle a 38,5 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, aspirare il terreno insieme alle MNC non collegate. Quindi, aggiungere nuovamente due millilitri di ADMEM fresco e continuare l'incubazione, cambiando il terreno ogni tre giorni.

Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, lavare la coltura con DPBS fresco. Quindi, dissociare le cellule, utilizzando un millilitro di tripsina-EDTA allo 0,25% per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Raccogliere le cellule in dieci millilitri di ADMEM e trasferirle in una provetta conica da 15 millilitri.

Quindi, far girare le cellule a 300 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Ora, sospendi le multinazionali raccolte in un millilitro di ADMEM fresco e misura la loro densità. Terminare con la placcatura tra 1/2 e tre quarti di milione di cellule in matracci T25 con quattro millilitri di ADMEM.

Incubare i palloni proprio come le piastre e cambiare il terreno ogni tre giorni. Preparare una sezione di 15x10 centimetri di pelle sopra l'articolazione femorale, come è stato fatto durante la preparazione per i prelievi di midollo osseo. Quindi, palpare le creste della rotula e della tibia sotto la pelle per identificare l'articolazione sinoviale e inserire una siringa da tre millilitri con un ago calibro 23, precisamente nell'articolazione.

Aspirando delicatamente, estrarre tra 1/2 e un millilitro di liquido e ritirare immediatamente l'ago. Se il volume del liquido sinoviale è troppo piccolo, sciacquare la cavità con DPBS per raccogliere il liquido sinoviale con DPBS. Il volume di DPBS da utilizzare varia con le dimensioni della cavità sinoviale.

Il volume ottimale di liquido sinoviale è limitato in un'articolazione sana. Il volume varia con le dimensioni e le condizioni patologiche della sua articolazione. Per isolare le cellule dal liquido sinoviale, diluire il fluido con un volume uguale di DPBS in una provetta conica da 15 millilitri a temperatura ambiente.

Successivamente, spostiamo i detriti filtrando la diluizione attraverso un filtro a celle di nylon da 40 micron. Quindi, aggiungere altri dieci millilitri di DPBS e centrifugare la sospensione a 400 Gs per dieci minuti a temperatura ambiente. Quindi, scartare il surnatante e lavare le cellule due volte, usando DPBS.

Sospendiamo il pallet in celle lavate in due millilitri di ADMEM. Quindi, procedere con la coltura delle cellule come è stato dimostrato con le MSC. Le MSC sono state isolate con successo dal midollo osseo e dalle articolazioni sinoviali dei maialini e ampliate in vitro.

La morfologia delle MSC derivate dal liquido sinoviale è simile a quella delle MSC derivate dal midollo osseo: entrambe hanno una forma a fuso fibroblastico e sono aderenti in modo omogeneo. Le MSC hanno mostrato un'espressione positiva per la colorazione con fosfatasi alcalina dopo il completamento della terza sottocoltura. Successivamente, sono stati analizzati i marcatori di superficie in entrambe le colture.

Come previsto, entrambi i tipi di MSC esprimevano significativamente CD29, CD44 e Vimentina. Al contrario, l'espressione di CD34 e CD45 era negativa e bassa. Questi risultati sono stati identici a quelli ottenuti attraverso le MSC distintive, comprese le cellule isolate dal liquido sinoviale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come aspirare in modo non invasivo il liquido sinoviale e il midollo osseo al fine di isolare le loro MSC dai maialini e come eseguire il confronto e la fenotipizzazione di queste MSC. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordarsi di individuare il punto obiettivo sulla cresta iliaca e sulla sinoviale, determinato da un'attenta palpazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come nei modelli di osteoartrite o artrite reumatoide, per rispondere a ulteriori domande, come se non solo le MSC del midollo ma anche le MSC del liquido sinoviale abbiano una capacità dello stesso tipo per l'iniziazione della cartilagine o dell'osso e le immunosoppressioni.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha avanzato la terapia autologa delle malattie articolari aiutando a caratterizzare le MSC derivate da articolazioni attaccate o infiammate in pazienti con artrite.