Name: Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Impara a isolare e fenotipizzare cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale e midollo osseo di mini-pig per studi di medicina rigenerativa e immunomodulazione.

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Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario fornito dal programma BioGreen 21 di nuova generazione (n. PJ007969), l'Amministrazione per lo Sviluppo Rurale e la Fondazione Nazionale per la Ricerca (sovvenzione n. NRF-2015R1D1A1A01056639) della Repubblica di Corea.

Gli esperimenti sugli animali sono stati autorizzati dal Centro animali per Biomedica sperimentazione a Gyeongsang National University. 1. I preparativi per la Procedura di animali <ol><li> Preparare l&#39;adulto cavie di sesso femminile per la raccolta non invasiva delle cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo e nel liquido sinoviale. Eseguire l&#39;esame clinico delle cavie un giorno prima anestesia e la raccolta del campione. <ol><li> Fornire animali clinicamente normali per gli esami fisici, che comprendono la temperatura corporea, frequenza respiratoria, e la frequenza cardiaca, e per l&#39;osservazione del comportamento e ematologiche status dei maiali, usando completi test emocromo. Nota: gli intervalli dei parametri per maialino clinicamente sani sono 11-29 / min per il tasso di respirazione, 68-98 / min per la frequenza cardiaca, e 37-38 ° C per la temperatura corporea. </li></ol></li><li> Rimuovere tutte le lenzuola commestibile dalla gabbia durante il periodo di digiuno preoperatorio di 6-12 ore PRIOr per la somministrazione di anestesia per cavie giovani e adulti, 3 ore di digiuno deve essere osservato per i neonati. Fornire acqua potabile fino al momento dell&#39;anestesia. </li></ol> 2. Preparazione degli animali per anestesia <ol><li> Medicare le cavie prima della somministrazione di anestesia con acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), e atropina (0,04 mg / kg). <ol><li> Iniettare tutti i farmaci per via intramuscolare (IM) utilizzando un ago G 21 con una lunghezza di almeno 30 mm per maialino adulti. Eseguire l&#39;iniezione IM 1-3 cm dietro l&#39;orecchio nel muscolo cervicale laterale o nel muscolo della coscia. Nota: eseguire tutte le procedure, senza suscitare la paura o stress negli animali o che richiedono un trasporto sicuro per iniettare in modo sicuro la premedicazione. </li></ol></li><li> Mettere i maialino in una posizione dorso-reclinata. </li><li> Quindici minuti dopo la somministrazione della premedicazione, avviare l&#39;anestesia utilizzando 1,5% isoflurano Adminministrato per inalazione. <ol><li> Continuare l&#39;inalazione di isoflurano (1,5%) attraverso un tubo endotracheale, seguita da un aumento della concentrazione di 2,5%, con l&#39;ossigeno (1,5 L / min) come gas di trasporto. </li></ol></li><li> Monitorare costantemente la frequenza cardiaca, la temperatura corporea, e percutanea saturazione di ossigeno nel sangue (SpO2) dei maialino durante l&#39;anestesia. Utilizzare una coperta acqua circolante ad una temperatura di 38 - 39 ° C per mantenere la temperatura corporea. Applicare una pomata oftalmica per proteggere gli occhi dalla disidratazione durante l&#39;anestesia. </li><li> Seguire la classificazione di Guedel per valutare la profondità dell&#39;anestesia 13. </li></ol> 3. Preparazione cellulare isolamento e la coltivazione <ol><li> Per coltivare le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo e nel liquido sinoviale, preparare 500 ml di terreno avanzato Dulbecco Modified Eagle (ADMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml di crescita dei fibroblasti di base factoR (bFGF), e il 1,0% di penicillina-streptomicina (10.000 UI e 10.000 mg / ml, rispettivamente, Pen-Strep). <ol><li> Incubare la ADMEM a 38,5 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2 in un incubatore CO 2. </li></ol></li><li> Preparare 500 ml di tampone fosfato salina Dulbecco (DPBS) secondo le istruzioni del produttore per l&#39;isolamento delle cellule e lavaggio. </li></ol> 4. Raccolta di midollo osseo dal mini-pig <ol><li> Selezionare un&#39;area di circa 15 x 15 cm di grandezza sulla cresta iliaca (figura 1), e rimuovere i capelli da questa area utilizzando rasoi di sicurezza sterilizzati o tagliaunghie elettrici. Una volta che la cavia è posizionato, alternativamente fregare il sito procedura per tre volte con i seguenti agenti di sterilizzazione: povidone iodio e il 70% di etanolo. Dopo la zona è completamente asciutto, applicare teli sterili. </li><li> Pre-coat la siringa 10 ml con 100 U / ml di eparina da risciacquo con 3 - 4 ml di eparina prima ejecting l&#39;agente anti-coagulante. Nota: Eseguire questo passaggio per evitare la coagulazione nella siringa durante l&#39;aspirazione del midollo osseo. </li><li> Estrarre un minimo di 5 ml di midollo osseo da dell&#39;osso iliaco cresta della cavia in anestesia, usando un estrattore midollo osseo (3,0 × 100 mm) saldamente attaccato alla eparina pre-rivestite 10 ml siringa. </li></ol> 5. L&#39;isolamento di cellule estratte dal midollo osseo e coltivazione in vitro <ol><li> Isolare le cellule del midollo osseo estratta. <ol><li> Diluire il midollo osseo estratta con un volume uguale di DPBS in una provetta conica da 15 ml a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 3 ml di media densità centrifugazione (Ficoll-Paque) al tubo da 15 ml. </li><li> Diluire uno strato 4 ml di midollo osseo con DPBS, che è posto sul supporto centrifugazione densità senza mescolare e centrifugare a 400 g per 40 min a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere lo strato di cellule mononucleate(MNC) dal buffy coat tra i due strati contenenti il ​​plasma (strato superiore) e dei media densità di centrifugazione (strato inferiore), e trasferire i multinazionali in un tubo da 15 ml. </li><li> Diluire i PTM trasferiti con 7 - 8 ml di DPBS e centrifugare a 500 xg per 10 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare le cellule due volte con DPBS. </li><li> Sospendere il pellet di cellule in 2 ml di ADMEM e trasferirlo ad un piatto di coltura tissutale da 35 mm. Incubare la piastra di coltura a 38,5 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. </li></ol></li><li> Nella coltivazione in vitro di cellule isolate da midollo osseo. <ol><li> Dopo 48 ore, aspirare il terreno con le cellule che non sono collegati al piatto, e sostituire 2 ml di ADMEM e incubare a 38,5 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. Cambiare la media ogni tre giorni. </li><li> A 70 - 80% di confluenza, lavare le cellule con DPBS, loro dissociarsi con 1 ml di 0,25%tripsina / EDTA, e incubare a 37 ° C per 3 - 5 minuti fino a quando le cellule si staccano. </li><li> Raccogliere le cellule con 10 ml di ADMEM, trasferirli in un tubo da 15 ml, e centrifugate a 300 g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante. </li><li> Sospendere le cellule raccolte in 1 ml di ADMEM fresco e contarli con un emocitometro. </li><li> Collocare le cellule in un 5 - 7,5 x 10 5 / 25T pallone contenente 4 ml di ADMEM e incubare a 38,5 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. Cambiare la media ogni tre giorni. </li></ol></li></ol> 6. Raccolta di liquido sinoviale dei mini-pig <ol><li> Simile alla procedura per l&#39;aspirazione del midollo osseo, selezionare un&#39;area appropriata di circa 15 x 10 cm (lunghezza / larghezza) oltre l&#39;articolazione femorale, e rimuovere i capelli usando rasoi di sicurezza sterilizzati o tagliaunghie elettrici, seguire da procedure di sanificazione (passo 4.1). </li><li> Inserire una siringa da 3 ml con un 23 Gago nel giunto dopo che i punti di riferimento palpazione (rotula e tibia CREST). <ol><li> Applicare leggera aspirazione alle siringhe per l&#39;aspirazione del liquido sinoviale nelle articolazioni. Il volume approssimativo di liquido sinoviale raccolto da un giunto è di 0,5 - 1 ml, ma questo varia a seconda delle dimensioni della cavia e il giunto. Lavare con DPBS nella cavità sinoviale se il volume raccolta di liquido sinoviale è troppo piccolo. </li><li> ritirare immediatamente la siringa per evitare la contaminazione con il sangue. </li></ol></li></ol> 7. L&#39;isolamento delle cellule dalla raccolta liquido sinoviale e coltivazione in vitro <ol><li> Isolare le cellule dal liquido sinoviale aspirato. <ol><li> Diluire il liquido sinoviale aspirato con un volume uguale di DPBS in un tubo da 15 ml a temperatura ambiente. </li><li> Per rimuovere i detriti, filtrare il liquido sinoviale diluito con un 40 micron colino cella di nylon. </li><li> Aggiungere 10 ml di DPBS per il tubo contenente il filtrato sinovialefluida e centrifugare a 400 xg per 10 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare le cellule due volte con DPBS. </li><li> Sospendere il pellet di cellule in 2 ml di ADMEM, collocare le celle di un 2 - piatto di coltura tissutale 3 x 10 5 cellule / 35 mm 2 ml di ADMEM, e incubare a 38,5 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2 . </li></ol></li><li> Ripetere il passaggio 5.2 per la coltivazione in vitro di isolati MSC liquido derivato sinoviale. </li></ol> 8. post-procedura di cura dei mini-pig <ol><li> Se necessario, chiudere la pelle al sito di iniezione estrattore midollo osseo con una sutura singola utilizzando una cucitrice pelle, dopo la raccolta di midollo osseo. </li><li> Dopo la procedura è completata, somministrare una iniezione intramuscolare dell&#39;enrofloxacina (5 mg / kg) e meloxicam (0,2 mg / kg) per le cavie una volta al giorno per 3 giorni. </li><li> Dopo la procedura è stata completata, disinfettare il midollo osseo e sinoviale sito di raccolta del liquidocon 0,1% di iodio povidone una volta al giorno per 3 giorni. Osservare attentamente ogni giorno per monitorare i segni di complicanze (ad esempio, gonfiore, pus o arrossamento). </li></ol> 9. Fenotipizzazione cellulare in citometria a flusso <ol><li> Quando i MSC sono 70 - 80% confluenti nei passaggi 3 - 5, lavare le cellule con DPBS e trattarli con 1 ml di 0,25% (v / v) Tripsina / EDTA. Poi, incubare a 37 ° C per 3 - 5 minuti fino a quando le cellule si staccano. </li><li> Raccogliere le cellule con 10 ml di DPBS, trasferirli in un tubo da 15 ml, e centrifugate a 300 g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante. </li><li> Per fissare le cellule, sospendere il pellet cellulare in 10 ml di una soluzione di formaldeide 3,7% sé a 4 ° C per un giorno prima dell&#39;analisi. <ol><li> Un giorno dopo il fissaggio, lavare le cellule con DPBS due volte mediante centrifugazione a 300 g per 5 minuti ogni volta. Eliminare il surnatante. </li><li> Sospendere il pellet cellulare in 4 mldi DPBS, che è integrato con 1% (w / v) di siero albumina bovina (BSA), e incubare il pellet per 1 ora a 4 ° C per bloccare non specifici interazioni Fc-mediata. </li><li> Distribuire 500 aliquote microlitri della sospensione cellulare in provette da 1,5 ml. </li><li> Per gli anticorpi non coniugati (CD29 e Vimentin), lavare le cellule per centrifugazione a 300 g per 3 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Sospendere il pellet di cellule in 500 ml di una diluizione 1: 100 di anticorpo primario e incubare per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con 1% di albumina sierica bovina per centrifugazione a 300 g per 5 minuti ogni volta. Eliminare il surnatante. </li><li> Sospendere il pellet di cellule in 500 ml di una diluizione 1: 100 di isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugata anticorpo secondario e incubare per 1 ora al buio a 4 ° C. </li></ol></li><li> Per gli anticorpi FITC-coniugati (Isotipo, CD34, CD44 e CD45), lavare le cellule da centrifugazione a 300 g per 3 min. Eliminare il surnatante. <ol><li> Sospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di 1: 100 di anticorpi FITC-coniugato ed incubare per 1 ora al buio a 4 ° C. </li><li> Per entrambe le condizioni di colorazione, lavare le cellule due volte con DPBS per centrifugazione a 300 g per 5 minuti ogni volta. Eliminare il surnatante. </li><li> Sospendere le cellule in 500 ml di DPBS, trasferirli in un 5 ml tubo a fondo rotondo, e analizzare i risultati utilizzando un citofluorimetro 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).</li>
<li>Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+stem+cells+derived+from+various+mesenchymal+tissues%3A+Superiority+of+synovium+as+a+cell+source%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source.</a> Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).</li>
<li>De Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+can+be+converted+to+smooth+muscle+cells+in+the+cryo-injured+rat+bladder+and+prevent+compensatory+hypertrophy+of+surviving+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells.</a> J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).</li>
<li>Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+subpopulations+of+cells+expressing+mesenchymal+stem+cell+markers+derived+from+human+synovial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes.</a> J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).</li>
<li>Patil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+and+proteomic+profiling+of+human+dental+stem+cells+derived+from+a+single+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor.</a> Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Hatsushika, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra+articular+injection+of+synovial+stem+cells+promotes+meniscal+regeneration+in+a+rabbit+massive+meniscal+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model.</a> J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).</li>
<li>Hagmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+bone+marrow-+and+synovium-derived+mesenchymal+stromal+cells+from+osteoarthritis+patients+on+regulatory+T+cells+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22ClinExpImmunol%22%5BJournal%5D)">The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture.</a> ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).</li>
<li>Lee, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+source-dependent+in+vivo+immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+the+bone+marrow+and+synovial+fluid+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).</li>
<li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+distinction+of+iNOS+and+IDO+function+in+mesenchymal+stem+cell-mediated+immunosuppression+in+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species.</a> Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).</li>
<li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+mesenchymal+stem+cells+in+health+and+early+osteoarthritis%3A+Detection+and+functional+evaluation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level.</a> Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).</li>
<li>Morito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+increase+after+intra-articular+ligament+injury+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans.</a> Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).</li>
<li>Sekiya, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+in+the+knee+with+degenerated+cartilage+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).</li>
<li>John, T., Lerche, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohn%2C+T+%22Anesthesia+and+analgesia+for+veterinary+technicians%22">Anesthesia and analgesia for veterinary technicians</a>. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).</li>
<li>Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+the+pig+solve+the+transplantation+backlog%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Will the pig solve the transplantation backlog.</a> Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).</li>
<li>Millard, A. L., Mueller, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+issues+related+to+porcine+xenograft+exposure+to+human+viruses%3A+Lessons+from+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation.</a> CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).</li>
<li>Ringe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+mesenchymal+stem+cells.+Induction+of+distinct+mesenchymal+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages.</a> Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).</li>
<li>Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perspectives+for+porcine-to-human+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Micro+biol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The perspectives for porcine-to-human xenografts.</a> Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+adult+progenitor+cells+from+swine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow.</a> Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Sekiya, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+in+the+knee+with+degenerated+cartilage+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+chondrogenic+potential+of+fibrous+synovium-+and+adipose+synovium-derived+cells+compared+with+subcutaneous+fat-derived+cells%3A+Distinguishing+properties+of+mesenchymal+stem+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans.</a> Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Maialino sono stati usati per stabilire l&#39;isolamento MSC da midollo osseo e nel liquido sinoviale. Per eliminare varie condizioni fisiologiche, quali l&#39;età, il sesso, e la malattia, maialino da sfondo isogenici donatori sono stati scelti per valutare con precisione la caratterizzazione dipendente fonte delle cellule. I maiali sono noti per essere anatomicamente, fisiologicamente, geneticamente simili agli esseri umani, e in particolare, maialino in grado di produrre organi dimensioni abbinati; Pertanto, essi pos...

Le cellule staminali mesenchimali multipotenti (MSC) possono essere classificate in linee cellulari mesenchimali e le MSC sono state stabilite e isolate da varie fonti di tessuti, come il midollo osseo, i cordoni ombelicali, la placenta, il tessuto adiposo, la pelle dermica, il muscolo scheletrico, i follicoli piliferi, le membrane sinoviali e i denti1-5. Attualmente, l'attenzione è stata rivolta alle MSC di derivazione sinoviale perché queste cellule possono aiutare a trattare le malattie articolari, come la frazione ossea, l'osteoartrite e l'artrite reumatoide (RA) e, grazie al potenziale rigenerativo delle MSC nella cartilagine o nell'osso danneggiati, possono anche aiutare a trattare la modulazione immunitaria o le malattie autoimmuni6-8. La maggior parte delle ricerche sulle MSC derivate da fonti sinoviali ha impiegato MSC dalla membrana sinoviale piuttosto che dal liquido sinoviale2,9; pertanto, la comprensione biologica delle MSC derivate dal liquido sinoviale è limitata.
Il liquido sinoviale è una fonte facilmente accessibile di MSC, che possono essere aspirate durante le diagnosi o i trattamenti dei pazienti e durante le conferme diagnostiche di varie condizioni di artrite che non richiedono procedure invasive, come l'osteoartrite o l'artrite reumatoide. La popolazione di MSC derivate dal liquido sinoviale nella cavità sinoviale è significativamente aumentata nei pazienti artritici rispetto ai pazienti non artritici10-12. Pertanto, il liquido sinoviale è un'ottima fonte di farmaci per le MSC, in particolare per la terapia con cellule staminali autologhe in pazienti con articolazioni infiammate o lesionate. Inoltre, le MSC derivate dal liquido sinoviale hanno una capacità condrogenica, capacità di immunomodulazione e un alto tasso di proliferazione. Questo studio ha stabilito protocolli per l'estrazione del midollo osseo e l'aspirazione del liquido sinoviale da minipig utilizzando metodi non invasivi e per l'espansione in vitro di cellule isolate e l'analisi dei fenotipi cellulari.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' avanzato s modificato Eagle medium (ADMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-023</td><td>MSC terreno di coltura</td></tr><tr><td>Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Terreno di lavaggio cellulare, privo di Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Componente del terreno MSC</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Componente del medio MSC</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Componente del terreno MSC</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF)</td><td>Simga</td><td>F0291</td><td>Componente delle MSC medio</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>Componente delle MSC medie</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reagente di dissociazione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Componente delle MSC medio</td></tr><tr><td>Anticorpo isotipo</td><td>BD Pharmingen</td> BD <td>550616 Controllo dell'isotipo</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD29</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 552369</td><td>Integrina beta-1 Marker MSC</td></tr><tr><td>Anticorpo CD44</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 553133</td><td>Glicoproteina della superficie cellulare Marker MSC</td></tr><tr><td>Anticorpo CD45</td> BD <td>Pharmingen</td><td>BD 340664</td><td>Marcatore delle cellule staminali ematopoietiche</td></tr><tr><td>Anticorpo CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555821</td><td>Marcatore delle cellule staminali ematopoietiche</td></tr><tr><td>Anticorpo CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555595</td><td>Glicoproteina di membrana Thy-1 Marker MSC</td></tr><tr><td>Anticorpo MHC Classe II</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32247</td><td>Marcatore delle cellule presentanti l'antigene</td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>Sigma</td><td>Sigma-S6389</td><td>Filamento intermedio di tipo III Marcatore MSC</td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td>Miscela di 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e nitro blu tetrazolio (NBT)</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Centrifugazione a gradiente di densità</td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 &; m Filtro cellulare in nylon</td></tr><tr><td>Tubo conico in polistirene da 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>351095</td><td>Raccolta dei campioni e isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Piastre da 35 mm</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>Piatto per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Estrattore di midollo osseo</td><td>GmbH Medizintechnologie, Germania</td><td>1145-1W010</td><td>TrokaBone, 3,0 x 100 mm</td></tr><tr><td>Camera per ematocrito</td><td>Marinfeld</td><td>640130</td><td>Camera</td></tr> <tr>per conteggio cellulare<td>Atropina</td><td>Jeil Pharmaceutical Co, Corea</td><td></td> del Sud <td>Atropina solfato Idrato</td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Samu Median, Corea</td><td></td> del Sud <td>Farmaco sedativo e antiemetico pre-anestetico</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Farmaco anestetico e analgesico</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer Healthcare, Germania</td><td></td><td>Anti-biotici</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Over Veterinary Medicine, Argentina</td><td></td><td>Farmaco antinfiammatorio e analgesico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Hana pharm, Corea</td><td></td> del Sud <td>Anestesia inalatoria</td></tr><tr><td>Povidone iodio&nbsp;</td><td>Corea Pharma, Corea</td><td></td> del Sud <td>Agente di sterilizzazione</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Agente di sterilizzazione</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Agente anticoagulante</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Agente di fissazione cellulare</td></tr><tr><td>Unguento oftalmologico&nbsp;</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Ossitetraciclina HCl con polimixina B solfato</td></tr><tr><td>Coperta d'acqua circolante</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td>Sistema di riscaldamento durante e dopo l'anestesia</td></tr><tr><td>Suturatrice</td><td>Covidien, USA</td><td></td><td>Sutura Chiusura cutanea</td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Thermo Forma</td><td>3111</td><td>Attrezzatura per colture cellulari</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analizzatore cellulare</td></tr><tr><td>Minipig</td><td>PWG Genetics Korea, Ltd.</td><td>Maiale in miniatura</td> <td>di tipo T</td></tr></tbody></table>

isolamento e cellular fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state stabilite dopo l'isolamento da varie fonti di tessuto, tra cui il midollo osseo e il liquido sinoviale. Recentemente, è stato riportato che le MSC derivate dal liquido sinoviale hanno un potenziale di differenziazione multi-lineage e caratteristiche immunomodulatorie, il che indica che queste cellule possono essere utilizzate per l'ingegneria tissutale e i trattamenti sistemici. Questo studio presenta un protocollo per l'isolamento semplice e non invasivo di MSC derivate dal midollo osseo e dal liquido sinoviale di maialini per analizzare i marcatori della superficie cellulare per la fenotipizzazione cellulare e la coltura in vitro. Utilizzando maialini di sei mesi sessualmente maturi, il midollo osseo è stato estratto dall'osso della cresta iliaca utilizzando un estrattore di midollo osseo e il liquido sinoviale è stato aspirato dall'articolazione femorotibiale. Le procedure per la raccolta di campioni da entrambe le fonti non erano invasive. Vengono forniti i protocolli per l'isolamento efficace delle MSC da fonti cellulari raccolte e per la creazione di condizioni di coltura in vitro per espandere le MSC stabili dai minipig e l'applicazione di trattamenti autologhi sistemici. Per la fenotipizzazione cellulare, i marcatori della superficie cellulare di entrambe le cellule sono stati analizzati utilizzando la citometria a flusso. Nei risultati, le MSC sono state isolate dal liquido sinoviale dei maialini e hanno dimostrato che le MSC derivate dal liquido sinoviale hanno una morfologia e un fenotipo cellulare simili alle MSC derivate dal midollo osseo. Pertanto, il liquido sinoviale ottenuto in modo non invasivo è una preziosa fonte di MSC.

Istituzione di MSC derivate dal midollo osseo e nel liquido sinoviale di mini-pig MSC sono state isolate con successo dal midollo osseo e delle articolazioni sinoviali articolari delle cavie ed espanse in vitro (Figura 2). Siringa aspirazione del liquido sinoviale è semplice, ed è possibile avere cellule aderenti sufficienti durante la coltivazione in vitro delle cellule prim...

Viene presentato un protocollo che stabilisce cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal liquido sinoviale e dal midollo osseo di maialini e raccolte in modo non invasivo mediante aspirazione a siringa. La fenotipizzazione cellulare è stata eseguita utilizzando la citometria a flusso dopo l'isolamento cellulare e la coltura in vitro di midollo osseo e liquidi sinoviali derivati da MSC.

Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è il prelievo non invasivo di liquido sinoviale e midollo osseo da minimaiali per ottenere cellule staminali mesenchimali da utilizzare in studi di rigenerazione e immunomodulazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della terapia con cellule staminali mesenchimali per applicazioni otorinolaringoiatriche, come ad esempio come stabilire il liquido sinoviale come fonte di cellule staminali mesenchimali e come caratterizzarle in confronto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella capacità di definire efficacemente le proprietà chiave delle cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e dal midollo osseo di minimaiali, che si riveleranno utili per applicazioni cliniche nei pazienti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse malattie articolari, poiché la popolazione di MSC derivati dal liquido sinoviale nella cavità sinoviale è significativamente aumentata nei pazienti atleti. Sebbene questo metodo possa fornire spunti importanti per la medicina rigenerativa, può essere applicato an

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Impara a isolare e fenotipizzare cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale e midollo osseo di mini-pig per studi di medicina rigenerativa e immunomodulazione.

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