Name: Modellazione Distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti C2C12 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri la modellazione della distrofia miotonica 1 utilizzando mioblasti C2C12 con tecniche di transfezione e transduzione virale. Questo metodo consente di studiare i meccanismi patogenetici e le malattie muscolari.

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Ringraziamo i dottori Tom Cooper del Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan dell'Università del Wisconsin-Madison e Didier Trono dell'Università di Ginevra per i reagenti. Questo lavoro è supportato da un fondo per le startup dell'Università di Houston (YL), da una sovvenzione dell'American Heart Association (YL, 11SDG5260033) e dalla National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12 coltura cellulare <ol><li> Mantenere C2C12 mioblasti di topo in un piatto di 100 mm di mezzo di crescita (media di Dulbecco modificato Eagle (DMEM)) integrato con il 20% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, e 2 mm L-glutammina. Consentono alle cellule C2C12 diversi passaggi a diventare circa il 50 - 60% confluenti. </li><li> Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con soluzione fisiologica 3 ml di temperatura ambiente tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per staccare le cellule. Posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore 3 - 5 min. </li><li> Neutralizzare la tripsina con l&#39;aggiunta di 3 ml di terreno di coltura. Pipettare 6 - 8 volte per sospendere le cellule. Aggiungere 1 ml di cellule sospese in un piatto di 100 mm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. C2C12 cellule Trasfezione / trasduzione e Selezione <ol><li> C2C12 plasmide trasfezione <ol><li> 24 ore prima della trasfezione, pritardate 7,0 x 10 5 cellule C2C12 in un pozzetto di una piastra sei pozzetti per ogni trasfezione. Nota: Questo porta a 50 - 60% di confluenza al momento della transfezione. </li><li> Lasciare che il reagente di trasfezione raggiunga la temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere 2 mg di DNA plasmide (GFP-CUG5 o GFP-CUG200) in 200 ml di pre-riscaldato mezzo privo di siero e vortex brevemente. Aggiungere 6 ml di reagente di trasfezione al mezzo e miscelare immediatamente per 30 secondi usando un vortice. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Cambiare il supporto di cellule C2C12 a 2,5 ml terreni di coltura privo di siero. Aggiungere la miscela di trasfezione di cellule dopo incubazione. Riportare le piastre per un 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. </li><li> Mantenere le cellule in miscela di trasfezione / terreni di crescita senza siero per 4 ore o fino a notte. Cambiare i media indietro ai media di crescita il giorno successivo o quando citotossicità è evidente. Nota: La citotossicità è valutata mediante ispezione microscopica del ceLLS. Osservare i cambiamenti nella morfologia cellulare e il distacco delle cellule. Fino a quando non vi è alcuna citotossicità palese, l&#39;incubazione durante la notte in terreni di crescita privo di siero migliora trasfezione. </li><li> Selezionare le celle 48 ore dopo la trasfezione con l&#39;aggiunta di 1,2-1,6 mg / ml G418 per ~ 10 giorni fino a quando la cultura del controllo (transfettate senza i plasmidi) non ha cellule vive. Modificare i media ogni due giorni con mezzi di crescita integrato con G418. </li><li> Mantenere le cellule resistenti G418 in mezzo di crescita e 5% di CO 2 a 37 ° C per esperimenti successivi. </li></ol></li><li> preparazione Retrovirus e C2C12 retrovirale trasduzione <ol><li> Preparare HEK 293 terreno di coltura DMEM completandolo glucosio con il 10% di siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina. <ol><li> Circa 24 ore prima della trasfezione, piatto 4,0 x 10 cellule di packaging HEK 293 basati su 6 ecotropic in un 100 mm Piastra (80% di confluenza a trasfezione) cmezzo di coltura cellulare ontaining. </li></ol></li><li> Lasciare che il reagente di trasfezione raggiunga la temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Mescolare 15 mcg plasmide DNA (pMSCV-Puro o pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml di terreno di coltura privo di siero. brevemente Vortex. Aggiungere 30 ml di reagente di trasfezione dal punto 2.2.2 in / tubo di terreno di coltura privo di siero del DNA, e mescolare bene con vortex. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere trasfezione miscela goccia a goccia per le cellule di confezionamento ecotropic HEK 293-based. Mescolare delicatamente i piatti e li tornare al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. Dopo 24 ore, cambiare i mezzi di comunicazione per mezzo di crescita fresco 10 ml di pre-riscaldato. </li><li> Raccogliere il surnatante (contenente retrovirus) 48 ore dopo la trasfezione con una pipetta e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml di nuovi media caldi alla piastra e restituirlo al incubatrice. Mantenere il surnatante a 4 ° C. Nota: Il supporto viene aggiunto delicatamente per tegli lato del pozzo in modo da non disturbare il monostrato cellulare. </li><li> Raccolto il secondo lotto di surnatante 60 ore dopo la trasfezione e piscina con il surnatante da 2.2.5. Centrifugare a 500 xg, a 4 ° C per 7 minuti per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Utilizzare retrovirus di trasdurre cellule C2C12 a questo punto procedendo al punto 2.2.9 o aliquotare e conservare il surnatante a -20 ° C per un uso futuro. </li><li> Scongelare il retrovirus da 2.2.7 a temperatura ambiente, se un titolo congelato è qui utilizzato. Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. </li><li> Piastra cellule C2C12 lo stesso giorno di trasduzione puntando 30 - 40% di confluenza. <ol><li> Eliminare il mezzo di crescita e lavare le cellule C2C12 con temperatura ambiente 3 ml di PBS. Rimuovere la PBS, aggiungere 500 microlitri 0,25% tripsina-EDTA e incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore 3 - 5 min. </li><li> Neutralizzare la tripsina con l&#39;aggiunta di 3 ml med crescitaIUM. Pipettare 6 - 8 volte per sospendere le cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e aggiungere 8,0 x 10 5 cellule C2C12 ad una piastra 60 mm. </li></ol></li><li> Aggiungere 0,5 ml retrovirus di infettare un piatto 60 mm di cellule in 3 ml di mezzi di crescita. Riportare la piastra per l&#39;incubatore. </li><li> Sostituire con 3 supporti ml freschi integrato con selezione antibiotica (puromicina 1 - 3 mg / ml) 48 ore dopo l&#39;infezione. Sostituire 3 ml di mezzo con antibiotici ogni giorno per ~ 5 giorni fino a quando la cultura del controllo C2C12 non trasdotte spegne. </li></ol></li><li> preparazione lentivirus e C2C12 lentiviral trasduzione Nota: eseguire tutte le procedure lentivirus legati a livello di biosicurezza 2 mobile e seguire le linee guida di sicurezza biologica. I rifiuti liquidi contenenti il ​​virus devono essere disinfettati prima dello smaltimento. <ol><li> Piatto 4,0 x 10 6 cellule 293T in un piatto 100 mm (~ 80% di confluenza al giorno di trasfezione) con HEK 293 terreno di coltura cellulare (DMEM alti livelli di glucosio, integrato con il 10% del fetosiero bovino, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 2 mM L-glutammina) 24 ore prima della transfezione. </li><li> Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Mescolare i vettori lentivirali di confezionamento (4 mg pMD2.G e 6 mcg psPAX2) insieme con 8 mg di trasferimento vettori lentivirali (Celf1 shRNA o strapazzate controllo shRNA) in 1 ml di siero mezzo di coltura cellulare gratuito. brevemente Vortex. </li><li> Aggiungere 36 ml di pre-riscaldato reagente di trasfezione al tubo DNA / DMEM e mescolare bene dal vortice. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Rimuovere le cellule 293T dal termostato e aggiungere la miscela di trasfezione alla piastra. Agitare delicatamente la piastra e tornare di nuovo al 5% di CO 2, 37 ° C incubatore. Dopo 24 ore, sostituire la miscela di trasfezione con 10 ml di terreno di coltura fresco. </li><li> Raccogliere il surnatante contenente lentivirus 48 ore dopo la trasfezione e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml nuovi media caldi alla piastra e restituirloper incubatrice. Conservare il surnatante a 4 ° C. </li><li> Raccogliere il secondo lotto di surnatante 60 ore dopo la trasfezione e combinarlo con il surnatante da 2.3.5. brevemente Centrifugare a 500 xg, a 4 ° C per 7 minuti. </li><li> Trasferire il surnatante in un tubo da 50 ml centrifuga fresca. Se si utilizza il virus fresco, procedere al punto 2.3.9. Per l&#39;uso futuro, negozio di virus contenenti surnatante a -20 ° C in aliquote di 10 ml. </li><li> Scongelare il virus da 2.3.7 a temperatura ambiente prima dell&#39;uso, se si utilizza un magazzino congelato. Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. </li><li> cellule piastra C2C12-CUG200 (ottenuti nella sezione 2.1), come descritto nella 2.2.9 lo stesso giorno di trasduzione. Nota: Obiettivo per 30 - 40% di confluenza. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di virus di infettare una piastra 60 mm C2C12-CUG200 e riportare la piastra per l&#39;incubatore. </li><li> Sostituire il terreno di coltura con mezzi freschi integrati con l&#39;antibiotico selezione (puromicina 1 - 3 mg / ml) 72 ore dopo la trasduzione.Aggiornare mezzi di coltura di tutti i giorni con l&#39;antibiotico selezione di ~ 5 giorni fino a quando tutta la cultura di controllo C2C12-CUG200 non trasdotte spegne. </li><li> Utilizzare Western Blot per verificare atterramento Celf1 in cellule trasfettate GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 cellule Differenziazione <ol><li> Piastra 2 x 10 6 cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2,5 ml terreni di crescita 24 h prima apertura di differenziazione. Nota: la densità di placcatura può essere regolata in modo che la piena confluenza viene raggiunto in 24 ore. <ol><li> Lavare le cellule confluenti con PBS e aggiungere 2,5 ml di terreno di differenziamento basso siero (modificato mezzo di Eagle integrato con 2% di siero equino, 100 U / ml penicillina Dulbecco, 100 ug / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1 pM insulina) . Sostituire la media ogni due giorni. Nota: Mantenere magazzino insulina congelati e aggiungerlo ai media ad ogni cambio medio. </li></ol></li><li> Durante la differenziazione C2C12, raccogliere campioni per quanquantita- RT-PCR (vedi sezione 4) presso i seguenti punti di tempo: Day0, 1, 2, 4 e 6. Processo per la cultura immunocolorazione al giorno 6-8 (vedi sezione 5). </li></ol> 4. RNA Isolamento e RT-PCR quantitativa <ol><li> Utilizzare il protocollo del produttore per l&#39;isolamento di RNA. Dopo l&#39;isolamento, risospendere il pellet di RNA in 30 acqua priva di RNasi ml e pipettare su e giù parecchie volte. Nota: I campioni possono procedere alla RT-PCR quantitativa o possono essere conservati a -80 ° C. </li><li> Utilizzare un kit RT qPCR per RT-PCR quantitativa 10 e seguire le istruzioni del produttore. Preparare la miscela di reazione in base alla tabella 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume (ml) </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> tampone di reazione 2x </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> Primer forward </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> primer reverse </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Trascrittasi inversa e RNase Inhibitor </td><td> 0.1 </td><td> 0,25 U / ml </td></tr><tr><td> Modello </td><td> 1 </td><td> 100 ng RNA totale </td></tr><tr><td> acqua libera RNase </td><td> 7.4 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Mix totale </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. RT-PCR Master Mix Preparazione <ol start="3"><li> Eseguire un 20 microlitri reazione RT-qPCR con profilo termico Tabella 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> fase di trascrizione inversa </td><td> 30 min, 48 ° C </td></tr><tr><td> polimero DNAAttivazione ase / trascrittasi inversa inattivazione </td><td> 10 min, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 cicli </td><td> 15 sec, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 min, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella profilo termico 2. RT-PCR quantitativa 5. immunocolorazione <ol><li> Fissare la coltura monostrato in 2.5 ml preparato fresco 4% paraformaldeide / PBS a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Permeabilize i campioni in 2.5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire i campioni ad una camera umidificata. Bloccare i campioni in 2,5 ml di tampone di bloccaggio (tensioattivo non ionico 0,1% / PBS, 10% siero di capra normale) per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Scartare tampone bloccante e applicare 800 microlitri anticorpo primario contro catena pesante della miosina diluito in tampone di bloccaggio (1: 100). Incubare in una camera umidificata notte a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la piastra 3 times (10 min ciascuna) con 2,5 ml di tampone di lavaggio (0,1% polisorbato 20 / PBS) il giorno 2. </li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio e applicare 800 microlitri anticorpo secondario (goat anti-topo IgG, 1: 500 diluito in PBS). Incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare due volte (10 minuti ciascuno) con tampone di 2,5 ml di lavaggio. </li><li> Incubare con 800 microlitri DAPI (1 ug / ml, diluito in acqua distillata deionizzata H 2 O) per 5 min. </li><li> Lavare con 2,5 ml di tampone di lavaggio ancora per 10 min. </li><li> Modificare il buffer di lavaggio a 2,5 ml di PBS e utilizzare un microscopio a fluorescenza per catturare le immagini. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Linea cellulare C2C12 è stata utilizzata come modello per lo studio miogenesi 11-14. Queste cellule mantengono uno sguardo fibroblasti-like, proliferano rapidamente in supporti contenenti il 20% di siero fetale bovino e prontamente si differenziano nel supporto contenente 2% di siero equino 15. La rapida crescita e la differenziazione sono caratteristiche vantaggiose in un modello cellulare miogenesi. Qui, dimostriamo l&#39;uso di plasmide, retrovirale, e vettori lentivirali per introdurre cDNA, 3&...

La distrofia miotonica (DM) è una malattia autosomica dominante che colpisce di più sistemi, i muscoli più considerevolmente cardiaco e scheletrico 1. Ci sono due sottotipi di questa malattia, DM1 e DM2. DM1 è più comune e ha una manifestazione più grave di DM2 2. La mutazione genetica sottostante DM1 è una espansione della tripletta ripetizioni CUG situato nella regione 3 &#39;non tradotta (UTR) del DM gene della proteina chinasi (DMPK) 3. Il numero CUG repeat in individui sani varia da 5 a 37. Al contrario, aumenta di più di 50, e, a volte fino a migliaia di pazienti DM1 4. Di conseguenza, RNA-binding proteins, come muscleblind-simile 1 (MBNL1), CUGBP, e Elav-come la famiglia 1 (Celf1), sono misregulated. A causa del sequestro sulle ripetizioni CUG espanse, MBNL1 perde la sua capacità di regolare splicing alternativo 5. Celf1, invece, viene up-regolata 6,7. Sovraespressione di Celf1 è associata a perdita di massa muscolaree la debolezza, che non sono attribuiti alla perdita di funzione MBNL1. Modelli animali che simulano le alterazioni DM1, comprese l&#39;DMPK 3&#39;-UTR espansione CUG, perdita di MBNL1, e sovraespressione di Celf1, sono state stabilite. Tuttavia, la modellazione DM1 nei mioblasti offre una valida alternativa, soprattutto per sezionare gli eventi cellulari e molecolari DM1-correlati. Linea di cellule mioblasti C2C12 è stato isolato dal muscolo C3H topo feriti e ampiamente usato per studiare miogenico 8,9 differenziazione. C2C12 rapidamente proliferano in siero fetale bovino (FBS) -contenenti media e facilmente subiscono differenziazione quando FBS è esaurito. Tuttavia, utilizzando questo modello di differenziazione dei mioblasti presenta due sfide: C2C12 sono spesso resistenti al gene trasfezione / trasduzione virale; e lievi variazioni nella gestione delle cellule e differenziazione procedura può portare a notevoli cambiamenti in formazione myotube. Il nostro laboratorio utilizza abitualmente mioblasti C2C12 come ACmodello ell e ha sviluppato protocolli in grado di fornire in modo efficace i geni di plasmide trasfezione, trasduzione retrovirale, e lentivirale trasduzione nella linea cellulare C2C12 10. Nel video, dimostriamo le procedure ottimizzate per transfecting / trasduzione C2C12 cellule e mantenere la coerenza di differenziazione nella creazione di modelli di mioblasti DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>per terreno di coltura</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>per terreno di coltura</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>per terreno di coltura</td></tr><tr><td>Insulina da pancreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>per terreno di derivazione</td></tr><tr><td>siero equino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>per mezzo di differenziazione</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; reagente di trasfezione HD</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>per trasfezione</td></tr><tr><td>G418 solfato&nbsp;</td><td>Biotecnologia dell'oro&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>per la selezione resistente ai farmaci</td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>per la selezione resistente</td></tr><tr><td>ai farmaci NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzetti</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>per western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>per western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>per western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>per western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Banca di ibridomi dello sviluppo</td><td>MF 20</td><td>Ab primario per immunocolorazione</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-topo, Texas Red-X coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secondario Ab per immunocolorazione</td></tr><tr><td>One step qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>per qRT-PCR</td></tr><tr><td>Reagente di isolamento TriPure</td><td>Roche</td> 11667165001 <td>per l'isolamento dell'RNA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CUG-BP1 (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primario Ab western blot</td></tr><tr><td>Actina Anticorpo</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>capra policlonale IgG per il controllo del carico</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>cellule per la preparazione del retrovirus</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>vettore retrovirale vuoto per la preparazione del retrovirus</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>house-constructed</td><td>non disponibile</td><td>vettore retrovirale codificante Celf1Flag, utilizzato nella preparazione del retrovirus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>regalo di Didier Trono</td><td>non disponibile</td><td>per la preparazione del lentivirus</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>regalo di Didier Trono</td><td>non disponibile</td><td>per la preparazione di lentivirus</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>regalo di M.S. Mahadevan</td><td>non disponibile</td><td>dettagli in riferimento 10&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>regalo da M.S. Mahadevan</td><td>non disponibile</td><td>dettagli nel riferimento 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritone X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>della paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>per immunocolorazione</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>per immunocolorazione</td></tr></tbody></table>

modellazione distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti c2c12

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

La distrofia miotonica 1 (DM1) è una comune forma di distrofia muscolare. Anche se diversi modelli animali sono stati stabiliti per DM1, modelli cellulari mioblasti sono ancora importanti perché offrono una valida alternativa cellulare per studiare gli eventi cellulari e molecolari. Anche se le cellule mioblasti C2C12 sono stati ampiamente utilizzati per studiare miogenesi, resistenza alla trasfezione del gene, o trasduzione virale, ostacola la ricerca nelle cellule C2C12. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato che include le procedure di manutenzione quotidiana, trasfezione e trasduzione per introdurre geni in mioblasti C2C12 e l&#39;induzione della differenziazione dei miociti. Collettivamente, queste procedure consentono migliori efficienze di trasfezione / trasduzione, come pure risultati differenziazione coerenti. Il protocollo descritto nello stabilire modelli cellulari mioblasti DM1 beneficerebbero lo studio della distrofia miotonica, nonché altre malattie muscolari.

C2C12 sono state trasfettate con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Dopo la selezione farmaco-resistenza, sono stati stabiliti piscine stabili, che può essere visualizzato mediante espressione GFP (Figura 1A). Formazione myotube nei mioblasti differenziati è stato rilevato dal catena pesante della miosina immunocolorazione 10 (Figura 1B). La quantificazione di myotube formazione ha dimostrato che gli indici di fusione sono stati diminuiti da 35,4 ± 4,1% a...

In questo protocollo, vi presentiamo le procedure nella creazione di modelli miotonici mioblasti distrofia 1, tra cui ottimizzato manutenzione C2C12 cellule, geni trasfezione / trasduzione, e la differenziazione dei miociti.

Modellazione Distrofia miotonica 1 nelle cellule dei mioblasti C2C12

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

L'obiettivo generale di queste procedure di mantenimento, trasfezione e transduzione dei mioblasti è quello di stabilire un modello cellulare della distrofia miotonica di tipo 1 per lo studio della distrofia miotonica e di altre malattie muscolari. Questo metodo può contribuire a stabilire modelli cellulari di mioblasti M1 che saranno utili per indagare il meccanismo dettagliato della patogenesi di M1. Questa manipolazione genica articolata dei mioblasti C2C12 permette di modellare eventi patologici genetici e sequenziali in M1. Ventiquattro ore prima della trasfezione, piastrare sette volte 10 alla quinta cellule C2C12 per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.Il giorno successivo, aggiungere due microgrammi del DNA plasmidico di interesse in 200 microlitri di mezzo a temperatura ambiente, privo di siero, e vortexare brevemente la soluzione. Successivamente, aggiungere sei microlitri di reagente di trasfezione a temperatura ambiente al mezzo e vortexare immediatamente la soluzione per 30 secondi. Incubare quindi il mezzo a temperatura ambiente per 30 minuti.Nei ultimi cinque minuti dell'incubazione, sostituire il mezzo in ciascun pozzetto con due virgola cinque millilitri di mezzo di crescita fresco privo di siero e aggiungere 200 µL di miscela di trasfezione a ciascun pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per quattro ore.Quindi esaminare le cellule al microscopio per verificare eventuali modifiche nella loro morfologia e adesione. Se si osserva citotossicità, sostituire il mezzo privo di siero con il mezzo di crescita. 48 ore dopo la trasfezione, aggiungere l'antibiotico selettivo appropriato in fresco mezzo di crescita ogni due giorni per 10 giorni.Fino a quando il controllo trasfettato senza plasmidi non contiene cellule vive. Per preparare il retrovirus, piastrare innanzitutto quattro volte 10 alla sesta cellule HEK293 di imballaggio ecotropiche in una piastra da 100 millimetri contenente mezzo di coltura cellulare. Il giorno successivo, mescolare 15 microgrammi di DNA plasmidico di interesse in un millilitro di mezzo di crescita privo di siero e vortexare brevemente il tubo.Successivamente, aggiungere 30 µL di reagente di trasfezione a temperatura ambiente nel mezzo e vortexare immediatamente la soluzione per 30 secondi. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia alle cellule ecotropiche e agitare delicatamente la piastra. Rimettere la piastra nell'incubatrice per colture cellulari per 24 ore, sostituendo il mezzo il giorno successivo con 10 mL di mezzo di crescita fresco a 37 °C.48 ore dopo la trasfezione, utilizzare una pipetta per trasferire i soprannatanti contenenti il retrovirus in un singolo tubo conico da 50 millilitri per la conservazione notturna a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere 10 millilitri di nuovo mezzo caldo lungo il lato della piastra e reinserire la coltura nell'incubatore. Raccogliere il secondo lotto di retrovirus 60 ore dopo la trasfezione.Unirlo al retrovirus raccolto a 48 ore. Centrifugare il sopranatante per rimuovere eventuali detriti cellulari e trasferire il retrovirus in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare ora ogni pozzetto di una coltura cellulare C2C12 con tre millilitri di PPS a temperatura ambiente, seguiti dall'aggiunta di 500 microlitri di tripsina EDTA allo 0,25% per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la reazione in ogni pozzetto con tre millilitri di mezzo di crescita e pipettare la coltura da sei a otto volte per dissociare le cellule in una sospensione monocellulare. Dopo il conteggio, aggiungere otto volte 10 alla quinta cellule in una piastra da 60 millilitri e aggiungere tre millilitri di mezzo di crescita. Quindi infettare le cellule con zero virgola cinque millilitri di retrovirus e reinserire la piastra nell'incubatore per 48 ore.Dopo due giorni, nutrire le cellule con tre millilitri di mezzo di crescita fresco, integrato ogni giorno con l'antibiotico di selezione appropriato per cinque giorni, fino a quando la coltura controllo C2C12 non trasdotta non contenga più cellule vive. Per la trasduzione lentivirale delle cellule C2C12, in una cappa di sicurezza di livello due, seminare quattro volte 10 alla sesta cellule 293T in una piastra da 100 millimetri con mezzo di coltura per cellule HEK293.Il giorno successivo, mescolare i vettori di impacchettamento lentivirali con otto microgrammi del vettore di trasferimento lentivirale appropriato, in un millilitro di mezzo di coltura cellulare senza siero. Vortexare brevemente la miscela e aggiungere 36 microlitri di reagente di trasfezione preriscaldato. Quindi vortexare il mezzo per altri 30 secondi e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.Al termine dell'incubazione, aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule 293T, agitare delicatamente la piastra e riposizionare le cellule nell'incubatore. Dopo 24 ore, sostituire la miscela di trasfezione con 10 millilitri di mezzo di coltura fresco. Dopo 48 ore, trasferire il surnatante contenente il lentivirus in un tubo conico da 50 millilitri per la conservazione a quattro gradi Celsius e aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco e caldo alla piastra.Dopo 60 ore, raccogliere il secondo lotto di supernatante insieme al lentivirus raccolto a 48 ore e centrifugare il virus per rimuovere eventuali detriti cellulari. Quindi aggiungere 0,5 mL di lentivirus a una coltura di cellule C2C12 CUG200 al 30-40% di confluenza, seminate in una piastra da 60 mm, come appena illustrato. A 72 ore dalla trasfezione, sostituire il supernatante di lentivirus con mezzo fresco, integrato con l'antibiotico selettivo appropriato.Cambiare il mezzo di coltura ogni giorno per cinque giorni con mezzo fresco integrato con antibiotico selettivo, fino a quando tutte le cellule di controllo C2C12 CUG200 non trasdotte sono morte. Dopo la selezione per resistenza al farmaco, l'espressione di GFP e la formazione di miotubi da mioblasti differenziati possono essere valutate mediante un'analisi manofluorescente. La quantificazione della formazione di miotubi in questo esperimento rappresentativo dimostra che gli indici di fusione e le aree dei miotubi sono significativamente ridotti dall'espansione anomala di CUG e dalle cellule trasfettate con GFP CUG 200.L'aumento della regolazione di Celf1 è inoltre associato all'espansione CUG nella distrofia miotonica di tipo uno. Inoltre, il test di immunoblotting dimostra costantemente un innalzamento dei livelli proteici di Celf1 con l'inibizione dell'espressione di MyoD, MyoG e Mef2C durante la differenziazione. Questo suggerisce che l'espansione CUG induca difetti nei miotubi e un alterato processo di differenziazione dei mioblasti.L'analisi mediante Western blot mostra anche che Celf1 con tag FLAG è presente solo nelle colture transdotte con vettore retrovirale e che la sua espressione è aumentata in queste colture. Effettivamente, la formazione di miotubi è rara nelle cellule che sovraesprimono Celf1 rispetto alle colture di controllo, suggerendo che la sovraespressione di Celf1 compromette gravemente la differenziazione dei mioblasti.Inoltre, il livello di proteina Celf1 endogena e di cellule GFP CUG 200 transdotte con vettore lentivirale selezionato con doppio antibiotico è notevolmente ridotto in presenza di RNA a forcina corta per Celf1. Con il recupero della formazione dei miotubi, si osservano negli stessi colture gli indici di fusione dei miotubi e le aree dei miotubi. Nel frattempo, i risultati della RT-PCR in tempo reale suggeriscono che l'espressione di MyoD, MyoG e Mef2C è significativamente aumentata nelle cellule che esprimono l'RNA a forcina corta per Celf1, sostenendo la possibilità che l'abbattimento di Celf1 ripristini il difetto di differenziazione miocitaria in queste colture.Nel corso di questa procedura, è importante monitorare la densità delle cellule C2C12 per mantenerla al di sotto del 70 percento di confluenza. Dopo la trasfezione cellulare, trattare le cellule con mezzo privo di siero per almeno quattro ore, ma non più di 12 ore. Durante il monitoraggio della citotossicità cellulare.Mediante l'uso della trasfezione di plasmidi e della trasduzione retrovirale e lentivirale, abbiamo stabilito con successo un modello cellulare della distrofia miotonica che potrà giovare alla ricerca su questa e altre malattie muscolari.

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