Name: Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Scopri il sequenziamento mirato dell'RNA per arricchire trascritti specifici e analizzare espressione genica, mutazioni e fusioni. Questo metodo personalizzabile offre un approccio rapido ed economico per studi di biologia molecolare.

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Ringraziamo in modo speciale Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto ed Eric Samorodnitsky per il supporto tecnico. Ringraziamo anche Jenny Badillo per il suo supporto amministrativo al nostro team. Ringraziamo l'Ohio Supercomputer Center (OSC) per aver fornito spazio su disco, capacità di elaborazione e supporto per eseguire le nostre analisi. Ringraziamo il Comprehensive Cancer Center (CCC) dell'Ohio State University Wexner Medical Center per il loro supporto amministrativo a questo lavoro. S.R. e il team sono supportati dall'American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), dal Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, dall'NHGRI (UM1HG006508-01A1), dalla Fore Cancer Research Foundation, dall'American Lung Association e dalla Pelotonia.

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<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
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<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
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<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
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S.R. riceve finanziamenti da Novartis e Ariad Pharmaceuticals per la conduzione di studi clinici. I familiari stretti di S.R. possiedono azioni di Johnson and Johnson.

RNA-Seq Capture è una strategia intermedia tra RNA-Seq e microarray approcci per la valutazione di una parte selezionata del trascrittoma. I vantaggi di cattura comprendono la riduzione dei costi, tempi di consegna rapidi su un sequencer desktop, throughput elevato, e la rilevazione di alterazioni genomiche. Il metodo può essere adattato per caratterizzare non codificanti RNAs 23, rilevare singolo nucleotide varianti 4-6, esaminare RNA splicing, e per identificare fusioni geniche o riarrangiamenti ...

Il sequenziamento dell'intero trascrittoma o RNA (RNAseq) è un metodo di sequenziamento imparziale per valutare tutti i prodotti a base di RNA. L'obiettivo dell'RNAseq mirato (cattura) è una valutazione mirata di trascritti selezionati con maggiore sensibilità, intervallo dinamico, costo o scala ridotti e maggiore produttività rispetto all'RNAseq standard. Analogamente all'RNAseq standard, gli approcci di arricchimento mirato possono essere utilizzati per valutare l'espressione genica, più specie di RNA come mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, altri RNA non codificanti2, fusioni geniche3 e mutazioni4-6.
La cattura comporta l'ibridazione di oligonucleotidi complementari per arricchire le librerie di cDNA per il sequenziamento. Il razionale per la cattura dell'RNAseq è simile agli approcci di microarray in cui oligonucleotidi o sonde complementari vengono ibridati in campioni e quindi misurati per l'abbondanza relativa. Per le tecnologie di microarray, l'espressione si basa sul segnale relativo misurato per i trascritti che si legano a queste sonde. I microarray sono quindi limitati dalla portata, dal potenziale rumore di fondo dovuto al legame non specifico e dall'ibridazione incrociata delle sonde. Inoltre, gli array hanno un intervallo dinamico limitato per trascritti bassi e altamente espressi rispetto a RNAseq1. I microarray sono ampiamente utilizzati grazie al loro costo ridotto e all'elevata capacità di produzione rispetto all'RNAseq. 
Qui, dimostriamo un metodo per la cattura di RNAseq che offre una via di mezzo tra RNAseq e approcci di microarray per valutare il trascrittoma. RNAseq Capture ha un throughput intermedio, una maggiore gamma dinamica e sensibilità ed è scalato per tempi di consegna rapidi sui sequenziatori desktop. RNAseq Capture richiede anche risorse computazionali ridotte in termini di spazio di archiviazione ed elaborazione dei dati.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo per Biologia Molecolare</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v2 (300- cicli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di RNA totale a filamenti TruSeq con RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo bloccante universale - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo bloccante universale - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo bloccante universale - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - Perle di purificazione PCR&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidina</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT DNA umano, grado fluorimetrico, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Provette per saggi&nbsp;</td><td>Life Technologies</td> Kit di test Qubit<td>® Q32856</td><td></td></tr><tr><td>dDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; Kit di ibridazione e lavaggio EZ&nbsp; (24 o 96 reazioni)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 o 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit&reg; 2.0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x soluzione TE)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Termociclatore con 96&ndash; Modulo di Ricezione Veloce</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Kit di Ibridazione e Lavaggio Roche</td><td>Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Trascrizione Inversa 200 U/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Scala RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per campioni RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 SIDE EACH</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Dry Bath</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagenti</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirati rna sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica alterazioni

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNA-Seq) è un metodo versatile che può essere utilizzato per rilevare e caratterizzare l&#39;espressione genica, mutazioni, fusioni geniche e RNA non codificanti. Standard RNA-Seq richiede 30-100.000.000 sequenziamento legge e può includere più prodotti di RNA, come mRNA e RNA non codificanti. Dimostriamo come mirato RNA-Seq (cattura) permette uno studio focalizzato su prodotti di RNA selezionati usando un sequencer desktop. cattura RNA-Seq può caratterizzare le trascrizioni non annotate, bassi, o transitoriamente espressi che potrebbero altrimenti essere perse con metodi tradizionali RNA-Seq. Qui si descrive l&#39;estrazione di RNA da linee cellulari, l&#39;esaurimento di RNA ribosomiale, la sintesi del DNA, preparazione di librerie di codice a barre, l&#39;ibridazione e la cattura di trascrizioni mirate e sequenziamento multiplex su un sequencer desktop. Abbiamo inoltre delineare la pipeline analisi computazionale, che comprende la valutazione di controllo della qualità, l&#39;allineamento, la rilevazione di fusione, l&#39;espressione genica quantificazione e identificazione dei singoli NUCvarianti leotide. Questo test permette di sequenziamento mirato trascrizione per caratterizzare l&#39;espressione genica, fusioni geniche e mutazioni.

A evidenziando schematica passaggi chiave nel RNA-Seq Capture è mostrato in Figura 1. Quattro linee di cellule di cancro con mutazioni note sono stati usati per dimostrare l&#39;efficacia della tecnica RNA-Seq Capture (K562 con ABL1 fusione, LC2 con la fusione RET, EOL1 con PDGFRalpha fusion e RT 4 con la fusione FGFR3). I quattro campioni sono stati raggruppati insieme e sequenziato con 2x 100 bp si legge su un sequencer desktop, che ...

Descriviamo un metodo mirato basato sul sequenziamento dell'RNA che include la preparazione di librerie di cDNA indicizzate, l'ibridazione e la cattura con sonde personalizzate e l'analisi dei dati per interrogare i trascritti selezionati per l'espressione genica, le mutazioni e le fusioni geniche. L'RNAseq mirato consente una valutazione rapida ed economica di trascritti selezionati su un sequenziatore desktop.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

L'obiettivo generale di questo saggio è arricchire i trascritti bersaglio per il sequenziamento di nuova generazione. Questo saggio di sequenziamento dell'RNA mirato è un procedimento articolato in più fasi che inizia con l'eliminazione dell'RNA ribosomiale dall'RNA totale, seguita da frammentazione chimica e sintesi del DNA complementare, preparazione di librerie con codici a barre, ibridazione e cattura dei trascritti mirati, sequenziamento multiplex e termina con l'analisi dei dati. Questo video illustrerà le procedure di ibridazione, cattura del bersaglio e amplificazione PCR post-cattura per quattro campioni.Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia molecolare, come l'identificazione di fusioni geniche, variazioni del singolo nucleotide, espressione genica relativa e splicing alternativo che coinvolgono trascritti mirati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere personalizzata per qualsiasi gene di interesse. Per iniziare la procedura di ibridazione, prelevare dal congelatore a 20 gradi Celsius e scongelare sul ghiaccio i seguenti componenti: sonde idratate personalizzate, DNA Cot-1, oligonucleotidi bloccanti u

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Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Qui, descriviamo un in situ di ibridazione test che consente la rivelazione sensibile e specifica delle sequenze più breve 50 nucleotidi con risoluzione del singolo-nucleotide a livello di singola cellula. L'analisi, che possono essere eseguita manualmente o automaticamente, può abilitare la visualizzazione delle varianti di splicing, brevi sequenze e mutazioni all'interno del contesto del tessuto.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.

Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi

Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.

Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire knockout genici che sono embrionali letali in vivo in tumori derivati da modelli murini geneticamente modificati e quindi valutare l'effetto che il knockout ha sulla crescita, proliferazione, sopravvivenza, migrazione, invasione e trascrittoma in vitro e in vivo.

Definizione delle funzioni geniche nella tumorigenesi mediante ablazione ex vivo di alleli floxed in cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Scopri il sequenziamento mirato dell'RNA per arricchire trascritti specifici e analizzare espressione genica, mutazioni e fusioni. Questo metodo personalizzabile offre un approccio rapido ed economico per studi di biologia molecolare.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

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