Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

L'obiettivo generale di questo saggio è arricchire i trascritti bersaglio per il sequenziamento di nuova generazione. Questo saggio di sequenziamento dell'RNA mirato è un procedimento articolato in più fasi che inizia con l'eliminazione dell'RNA ribosomiale dall'RNA totale, seguita da frammentazione chimica e sintesi del DNA complementare, preparazione di librerie con codici a barre, ibridazione e cattura dei trascritti mirati, sequenziamento multiplex e termina con l'analisi dei dati. Questo video illustrerà le procedure di ibridazione, cattura del bersaglio e amplificazione PCR post-cattura per quattro campioni.

Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia molecolare, come l'identificazione di fusioni geniche, variazioni del singolo nucleotide, espressione genica relativa e splicing alternativo che coinvolgono trascritti mirati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere personalizzata per qualsiasi gene di interesse. Per iniziare la procedura di ibridazione, prelevare dal congelatore a 20 gradi Celsius e scongelare sul ghiaccio i seguenti componenti: sonde idratate personalizzate, DNA Cot-1, oligonucleotidi bloccanti universali e oligonucleotidi bloccanti specifici per adattatori.

In un tubo da 1,5 millilitri a bassa adesione, unire 500 nanogrammi di campioni di DNA, 5 microlitri di DNA Cot-1, un microlitro di oligonucleotidi bloccanti universali, 0,5 microlitri di oligonucleotidi bloccanti specifici per adattatori a sei nucleotidi e 0,5 microlitri di oligonucleotidi bloccanti specifici per adattatori a otto nucleotidi. Posizionare il tubo del campione in un concentratore a vuoto con il coperchio aperto e rivolto in direzione opposta rispetto al senso di rotazione. Asciugare il contenuto a 45 gradi Celsius per 20 minuti, oppure fino a completa evaporazione del liquido.

Successivamente, risospendere il materiale secco in 8,5 microlitri di buffer di ibridazione 2x, 3,4 microlitri del componente di ibridazione A e 1,1 microlitro di acqua priva di nucleasi. Lasciare a riposo per 10 minuti, eseguendo una vortexazione ogni 2,5 minuti. Trasferire il materiale risospeso in una provetta PCR da 0,2 millilitri e incubare in un termociclatore a 95 gradi Celsius per 10 minuti.

Rimuovere il tubo del campione di ibridazione dal termociclatore e aggiungere due microlitri di sonde personalizzate risospese a una concentrazione di 1,5 picomoli per microlitro. Incubare la reazione di ibridazione tutta la notte a 65 gradi Celsius. Il passaggio successivo dopo l'ibridazione multiplexata è il recupero dell'RNA bersaglio mediante microsferette paramagnetiche accoppiate alla streptavidina.

Rimuovere una bottiglia di perle da quattro gradi Celsius ed equilibrarla a temperatura ambiente per 30 minuti. Preparare soluzioni di lavoro 1x di tutti i tamponi necessari. Aliquotare 140 microlitri di tampone di lavaggio 1x in un nuovo tubo da 1,5 millilitro.

Riscaldare questa aliquota di tampone e la quantità totale di tampone stringente 1x a 65 gradi Celsius in un blocco termico per almeno due ore. Aliquotare la quantità appropriata di perle in una provetta da 1,5 millilitri. Posizionare sul supporto per separazione magnetica e scartare il soprannatante.

Aggiungere il tampone di lavaggio delle perle e vortexare per 10 secondi. Posizionare il tubo nel supporto per separazione magnetica per due-cinque minuti o fino a quando il soprannatante non diventa limpido. Scartare il soprannatante.

Ripetere per un totale di due lavaggi. Dopo aver rimosso il buffer di lavaggio delle perline, aggiungere un volume uguale di buffer di lavaggio delle perline rispetto al volume iniziale. Risospendere e trasferire in una provetta PCR da 0,2 millilitri.

Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico per due o cinque minuti oppure fino a quando il sopranatante non diventa limpido. Eliminare il sopranatante. Posizionare il tubo con le perle in un blocco riscaldante miniaturizzato a 65 gradi Celsius.

Trasferire il campione di ibridazione nel tubo contenente le perle, aspirare e dispensare 10 volte con una pipetta per mescolare e incubare a 65 gradi Celsius per 45 minuti. Ogni 15 minuti, vortexare il campione e centrifugare per quattro secondi utilizzando una mini centrifuga da banco a velocità fissa. Al termine dell'incubazione di 45 minuti, rimuovere il tubo di cattura dal blocco termico.

Aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio 1x preriscaldato nel tubo, quindi vortexare per 10 secondi per mescolare. Trasferire la miscela in un tubo da 1,5 millilitro nuovo e a bassa adesione. Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico e attendere due-cinque minuti per la separazione, oppure fino a quando il soprannatante risulta limpido.

Eliminare il soprannatante. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio stringente 1x preriscaldato ed eseguire 10 aspirazioni e dispersioni con la pipetta per mescolare. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti.

Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico e attendere due o tre minuti per la separazione. Rimuovere il soprannatante. Ripetere il lavaggio stringente una volta, per un totale di due lavaggi.

Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1x a temperatura ambiente e vortexare per due minuti per favorire il mescolamento. Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico, attendere da due a cinque minuti per la separazione e rimuovere il soprannatante. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1x a temperatura ambiente e vortexare per un minuto per favorire il mescolamento.

Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico per due a cinque minuti, quindi eliminare il soprannatante. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1x a temperatura ambiente e vortexare per 30 secondi per mescolare. Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico per due a cinque minuti, quindi eliminare il soprannatante.

Infine, rimuovere il tubo dal supporto di separazione magnetica e aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi per risospendere le microsfere. Mescolare accuratamente aspirando e dispensando su e giù per 10 volte. Prima di impostare l'amplificazione PCR post-cattura, rimuovere le microsfere paramagnetiche da quattro gradi Celsius ed equilibrarle a temperatura ambiente per 30 minuti.

Rimuovere la miscela pronta PCR hot start 2x e la miscela di primer PCR dal congelatore a -20 gradi Celsius, scongelare a temperatura ambiente e quindi posizionare sul ghiaccio. Preparare una miscela master per l'amplificazione della libreria unendo 27,5 microlitri di miscela pronta PCR hot start 2x, 2,75 microlitri di primer PCR uno e 2,75 microlitri di primer PCR due. Impostare la reazione in una provetta PCR aggiungendo 20 microlitri di perle con DNA catturato a 30 microlitri della miscela master per l'amplificazione della libreria.

Chiudere correttamente il tubo e agitare al vortex per mescolare. Centrifugare il tubo per quattro secondi utilizzando una centrifuga mini da banco a velocità fissa a sei volte G. Inserire il tubo nel termociclatore ed avviare l'amplificazione PCR utilizzando il seguente programma PCR: una denaturazione iniziale a 98 gradi Celsius per 45 secondi, da 10 a 12 cicli di denaturazione a 98 gradi Celsius per 15 secondi, appaiamento a 65 gradi Celsius per 30 secondi ed allungamento a 72 gradi Celsius per 60 secondi.

Un ultimo ciclo di allungamento a 75 gradi Celsius per 60 secondi, quindi mantenere a quattro gradi Celsius. Al termine della PCR, rimuovere il campione dal termociclatore. Aggiungere 75 microlitri di perle paramagnetiche, mescolare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.

Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico a temperatura ambiente per due o tre minuti, quindi rimuovere il soprannatante. Lavare le perle sul magnete aggiungendo 200 microlitri di etanolo al 80%, incubando per 30 secondi e poi rimuovendo il soprannatante. Ripetere per un totale di due lavaggi.

Dopo aver rimosso il surnatante dal secondo lavaggio con etanolo, incuba a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti per permettere alle perle di asciugarsi, ma non asciugarle eccessivamente fino alla formazione di crepe. Risospendere le perle in 22 microlitri di Tris-EDTA pH 8,0 e lasciare per tre minuti affinché avvenga l'eluizione. Posizionare il campione sul magnete per tre-cinque minuti.

Infine, trasferire 20 microlitri del prodotto eluito in una nuova provetta da 1,5 millilitro a basso legame, assicurandosi che nessuna perla venga trasferita. Un confronto dell'espressione genica tra il metodo di cattura e il sequenziamento dell'RNA non mirato in quattro linee cellulari tumorali ha rivelato che il metodo di cattura arricchisce i geni mirati, mostrati in blu, da 10 a 1000 volte rispetto ai geni non mirati, mostrati in grigio. Inoltre, la percentuale di letture che si allineano alle regioni mirate è aumentata nei libreria di sequenziamento dell'RNA con cattura rispetto a quelle senza cattura.

Una valutazione delle misure di controllo qualità ha mostrato che il metodo di cattura e il sequenziamento RNA non mirato presentano prestazioni equivalenti in termini di allineamento al trascrittoma e dimensione principale dell'inserto. Utilizzando il metodo di cattura, è stata sequenziata una percentuale maggiore di regioni esoniche e una percentuale minore di regioni introniche. Come previsto, il sequenziamento RNA non mirato ha generato oltre 50 volte più letture di sequenziamento totali per campione rispetto al metodo di cattura.

Utilizzando il metodo di cattura, la percentuale di sequenze di RNA ribosomiale presenti in ciascun campione era inferiore. Infine, i confronti delle varianti a singolo nucleotide identificate nelle regioni sovrapposte della sequenza ottenuta con il metodo di cattura e con il sequenziamento dell'RNA, per ciascuna delle quattro linee cellulari, dimostrano una elevata concordanza delle varianze tra il metodo di cattura e il sequenziamento dell'RNA all'interno della regione bersaglio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente durante il recupero dei target ibridati e assicurarsi che la reazione rimanga a 65 gradi centigradi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia molecolare per lo studio di trascritti di interesse in modo ad alto rendimento ed economico.