Name: Stripe Assay per studiare lattività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dellippocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara lo stripe assay per studiare l'attività attrattiva o repulsiva di molecole guida usando neuroni dell'ippocampo dissociati. Questo metodo permette di analizzare molti neuroni contemporaneamente.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 e 26670090 a S.Y.).

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso Hamamatsu University School of Medicine. 1. Preparazione di matrici <ol><li> Far bollire 4-8 matrici di silicone in un forno a microonde o su un piatto caldo per 5 minuti e permettere loro di asciugare completamente per 1 ora sotto flusso laminare (lato a strisce in alto). Nota: Le seguenti procedure devono essere eseguite in condizioni di flusso laminare. </li><li> Soffiare aria compressa o usare nastro adesivo trasparente per rimuovere la polvere dal lato righe delle matrici. Mantenere il lato strisce pulito in modo che possa aderire saldamente alla superficie della piastra. </li><li> Posizionare con cura le matrici sulle stoviglie di plastica 6 cm premendo con un dito (una matrice per ogni piatto; lato striscia verso il basso). Evitare che le bolle d&#39;aria tra la matrice e il piatto. Segnare la posizione delle strisce sul lato inferiore del piatto cultura. </li><li> Se la matrice non riesce a collegare, ripetere dal punto 1.2. </li></ol>2. Stripe Generazione e laminina Coating per la Cultura Neuron <ol><li> Preparare fluorescente proteina ricombinante (25 ml ciascuno per iniezione [passo 2.2] o 100 ml ciascuno per il metodo di posizionamento [punto 2.2.1]) mescolando la proteina Fc-tag (10-50 mg / ml) e un dye fluorescente anticorpo coniugato anti-umano Fc (da 1 a 3 rapporto: 30-150 mcg / ml) in tampone fosfato (PBS). Poi, incubare la miscela per 30 minuti a RT. </li><li> Utilizzando una siringa 22-G, iniettare 25 ml di proteina ricombinante preparato nel passaggio precedente (2.1) attraverso il piccolo foro sul lato della matrice (frecce in figura 1A, 1C e 1E). <ol><li> In alternativa, posizionare 100 microlitri della proteina ricombinante nella fessura superiore della matrice e aspirare circa metà della soluzione dal piccolo foro (frecce in figura 1A, 1C e 1E), in modo che la proteina ricombinante rimane nelle regioni strisce. </li></ol></li><li> Incubare il piatto per 30 min a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare. </li><li> Mettere 300 ml di PBS nella feritoia superiore (Figura 1B) e aspirare dal piccolo foro situato sul lato della matrice (frecce in figura 1A, C ed E) per rimuovere le proteine ​​ricombinanti separati. Non aspirare il PBS completamente, perché le proteine ​​si asciugheranno. Ripetere questa operazione due volte. (3 volte totale) </li><li> Rimuovere con attenzione la matrice e collocare immediatamente ~ 100 ml di proteina di controllo (10-50 mg / ml; Fc) per coprire l&#39;intera area a righe, creando un rivestimento alternativo. Poi, incubare il piatto per 30 minuti a 37 ° C in incubatore di coltura cellulare. </li><li> Dopo aver lavato la superficie piatto tre volte con PBS, cappotto con ~ 100 ml di 20 mg / ml in PBS laminina. Nota: laminina devono essere scongelati in ghiaccio per evitare la solidificazione. </li><li> Incubare il piatto per 1 ha 37 ° C in incubatore di coltura cellulare. </li><li> Lavare la superficie piatto tre volte con PBS e aggiungere la cultura medium. Porre la capsula rivestita con mezzo di coltura in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Coltura neuroni dell&#39;ippocampo da E15.5 embrioni di topo <ol><li> Euthanize madre tramite dislocazione cervicale e isolare tre E15.5 embrioni. </li><li> Tagliare la pelle e il cranio sagittalmente sulla linea mediana della testa con le forbici, e rimuovere il cervello utilizzando un cucchiaino. Trasferire il cervello attenzione ad un 60 mm Petri contenente 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). </li><li> Usando un bisturi, tagliare gli emisferi, tra cui corteccia, ippocampo e striato (Figura 2A). Poi, sezionare la regione dell&#39;ippocampo rimuovendo accuratamente le meningi, e trasferire i tessuti ippocampali sezionato in un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 2 ml di soluzione HBSS, su ghiaccio (Figura 2B-C). Raccogliere 6 ippocampi da 3 embrioni nel tubo, che sono sufficienti per la coltura di neuroni in 8 piatti. </li><li> Sostituire la Hsoluzione BSS con soluzione di tripsina / EDTA (2 ml) e incubare il tubo a 37 ° C per 15 minuti in un bagno d&#39;acqua. Nota: Aspirare HBSS senza centrifugazione e non decantare la soluzione HBSS inclinando il tubo. </li><li> Neutralizzare l&#39;attività tripsina aggiungendo 500 ml di siero bovino fetale (FBS). </li><li> Centrifugare la miscela a 100 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 2 ml di mezzo di coltura. Ripetere questo passaggio ancora una volta. </li><li> Preparare la ippocampi su e giù per 10 volte in terreno di coltura con una punta di 1.000 ml, con un grande foro (cut-punta) per dissociare il tessuto. </li><li> Passare a un normale (non tagliato) punta da 1.000 ml e seminare il dissociato tessuto su e giù per ottenere una cella singola sospensione. </li><li> Separare le singole cellule facendoli passare attraverso un colino cella di rete 80-100 micron. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare singola filtrata a 150 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il Pellet (neuroni) in 2 ml di mezzo di coltura. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro con trypan colorazione blu per determinare la densità e la vitalità. Poi, piastra 10.000 neuroni in 150 ml di terreno di coltura per ogni insieme di sospensione stripes.The deve essere posizionato con attenzione per coprire l&#39;intera regione della banda. </li></ol> 4. Visualizzazione di corpi cellulari e degli assoni mediante immunofluorescenza colorazione con un anticorpo anti-Tau1 <ol><li> Dopo 24 h di coltura, aspirare il terreno senza disturbare le cellule aderenti, e fissare i neuroni con pre-riscaldato paraformaldeide 4% (PFA) / 4% di saccarosio / PBS a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Se lo si desidera, utilizzare una penna idrorepellente per disegnare un cerchio intorno alla regione strisce per diminuire la quantità di anticorpo necessaria. </li><li> Permeabilize i neuroni con 0.3% Triton X-100 / PBS per 5 min. </li><li> Incubare le neuroni con soluzione bloccante contenente 3% di siero asino e 0,1% Triton X-100 per30 min seguita da incubazione con un anticorpo anti-Tau1 (1: 200) in 1% di siero asino / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Incubare i neuroni con un anticorpo anti-topo IgG fluoroforo coniugato in 1% di siero albumina bovina (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS per 30 min. </li><li> Lavare la superficie della piastra 3 volte con PBS. Coprire la regione a righe con una x 18 mm vetro di copertura 18 millimetri con 50 ml di soluzione antifade. evitare bolle d&#39;aria, che interferiscono con l&#39;imaging. </li><li> Ottenere immagini fluorescenti con un microscopio a fluorescenza utilizzando il sistema appropriato, ad esempio, x10 lente obiettivo, set di filtri per GFP e RFP, e tempo di esposizione 1.000 msec (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un test che utilizza la banda proteina ricombinante e neuroni dissociato dal ippocampo E15.5 mouse. Questo test permette l&#39;osservazione efficiente delle risposte repulsive, attraenti, o neutri di neuroni ad una proteina ricombinante di interesse collocato in un motivo a righe. Un importante vantaggio di questo protocollo è il metodo semplice per generare le strisce, in cui la proteina è stampato direttamente sulla superficie di un piatto di plastica, rispetto al metodo tradizionale che ric...

Guida Axon è il processo attraverso il quale i neuroni appena formati inviano assoni al loro obiettivo durante lo sviluppo del sistema nervoso 1,2. assoni in via di sviluppo portano una struttura altamente mobili al loro punta chiamato il cono di crescita. Il cono di crescita rileva segnali extracellulari per navigare il percorso del assone. Molecole di guida, come ad esempio a fessura, semaphorin, e efrine, possono attrarre o respingere gli assoni a seconda della loro interazione con i recettori idonei e co-recettori presenti sulla assone 1,3,4. I recettori attivati ​​trasferire segnali al cono di crescita che riguardano l&#39;organizzazione del citoscheletro per i movimenti degli assoni e la crescita-cono. Vari metodi sono stati sviluppati per valutare l&#39;azione di molecole attrattivi e repellenti. Chemio-attrattivi e repellenti possono essere somministrati nel mezzo di crescita / cultura con un gradiente di concentrazione (ad es., Camera di Dunn o μ-slides) 5,6, in una zona ad alta concentrazione da micro-pipette (ad es., test di tornitura) 7 o ad una concentrazione omogenea applicazione da bagno (ad es., test di caduta cono di crescita) 8,9. Altri metodi includono un saggio banda o stampa microcontact (μCP), in cui un chemio-attrattivo o repellente è rivestito sulla superficie di una piastra come substrato 10-12. Thestripe saggio è stato originariamente sviluppato da Bonhoeffer e colleghi nel 1987 per analizzare la mappatura topografica del pulcino sistema di retino-tectal 13. Il metodo originale ha richiesto un sistema di vuoto a proteine ​​di rivestimento su membrane Nucleopore policarbonato utilizzando righe e matrici maglie. Nelle versioni successive, le proteine ​​ricombinanti sono stati stampati direttamente sulla superficie di una piastra di coltura in un modello a strisce utilizzando matrici di silicio stretta fessura 14,15. Recentemente, diversi gruppi di ricerca hanno applicato con successo questo test striscia per l&#39;analisi delle attività di orientamento degli assoni molecola 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Qui, vi presentiamo il protocollo dettagliato per un test che misura la striscia di attrazione o repulsione di molecole di guida degli assoni di neuroni dell&#39;ippocampo dissociati. In particolare, questo metodo può essere applicato in laboratorio minimamente attrezzate. Per questo test, alternando strisce di un substrato fluorescente e una proteina di controllo sono generati su un piatto di plastica utilizzando una matrice di silicio con feritoie 90 micron e rivestiti con laminina. Nella nostra dimostrazione, dissociato neuroni dell&#39;ippocampo dei topi E15.5 sono state coltivate su strisce di ectodomain ricombinante di fibronectina e proteine ​​transmembrana-2 (FLRT2) ricchi di leucina e controllare Fc proteine ​​21 alternata. Dopo 24 ore di cultura, sia gli assoni e corpi cellulari dei neuroni sono stati fortemente respinti dalle strisce FLRT2. Colorazione con un anticorpo anti-Tau1 rivelato che ~ 90% dei neuroni sono stati distribuiti sulle regioni Fc rivestite, rispetto a ~ 10% sul FLRT2-Fc, indicando che FLRT2 ha una forte repulsivaFunzione per i neuroni dell&#39;ippocampo 21.

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide (PFA)</td><td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra anticorpo IgG umano</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Asino anti-topo Anticorpo IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Diluizione 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Tau1</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>Diluizione 1/200</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>È possibile utilizzare mezzi di montaggio alternativi</td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Diluizione 1/50</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugatrice</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm N. 1</td><td></td></tr><tr><td>Penna DAKO</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Si può usare una penna alternativa idrorepellente</td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Piuma</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Pinze n. 5</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Diluizione 1/100</td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>calibro 22, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>IgG umane, frammento Fc</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Thermo neurobasale</td><td> Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Diluizione 1/100</td></tr><tr><td>Piatto di coltura in plastica, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Matrici</td><td></td><td></td> <td>di siliconeDisponibile e acquistabile presso il Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Tip, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo trasparente</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>È possibile utilizzare un nastro adesivo alternativo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td> di coltura <td>neurobasale integrato con B27, GlutaMAX e Penicillina-Streptomicina.</td></tr></tbody></table>

stripe assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Gli assoni in crescita sviluppano una struttura altamente mobile sulla loro punta, chiamata cono di crescita. Il cono di crescita entra in contatto con i segnali ambientali extracellulari per navigare nella crescita assonale. La netrina, la fessura, la semaforina e le efrine sono molecole guida note che possono attrarre o respingere gli assoni dopo essersi legati ai recettori e ai co-recettori sull'assone. I recettori attivati avviano varie molecole di segnalazione nel cono di crescita che alterano la struttura e il movimento del neurone. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per un saggio a strisce per valutare la capacità di una molecola guida di attrarre o respingere i neuroni. In questo metodo, i neuroni ippocampali dissociati da topi E15.5 vengono coltivati su piastre rivestite di laminina lavorate con strisce alternate di ectodominio di fibronectina e proteina transmembrana ricca di leucina-2 (FLRT2) e proteina cristallizzabile del frammento di immunoglobulina G (IgG) di controllo (Fc). Sia gli assoni che i corpi cellulari sono stati fortemente respinti dalle regioni a strisce rivestite di FLRT2 dopo 24 ore di coltura. L'immunocolorazione con tau1 ha mostrato che ~90% dei neuroni erano distribuiti sulle strisce rivestite di Fc rispetto alle strisce rivestite di FLRT2-Fc (~10%). Questo risultato indica che FLRT2 ha un forte effetto repulsivo su questi neuroni. Questo potente metodo è applicabile non solo per i neuroni primari in coltura, ma anche per una varietà di altre cellule, come i neuroblasti.

Dissociati neuroni dell&#39;ippocampo di topi E15.5 sono stati placcati e coltivate per 24 h su strisce di fluorescente controllo Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) in alternanza con Fc non etichettati controllo. In entrambi i casi, i neuroni sono stati aggregati e esteso le loro assoni come fasci. Sul controllo strisce Fc / Fc, i neuroni sono stati distribuiti in modo uniforme sulle strisce fluorescente e non etichettati, e hanno esteso i loro as...

Le molecole di guida degli assoni regolano la migrazione neuronale e la navigazione mirata dei coni di crescita. Presentiamo un metodo potente, il saggio a strisce, per valutare la capacità delle molecole guida di attrarre o respingere i neuroni. In questo protocollo, dimostriamo il saggio a strisce mostrando la capacità di FLRT2 di respingere i neuroni ippocampali in coltura.

Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

L'obiettivo generale del saggio a strisce è valutare la capacità di proteine specifiche, come le molecole guida, di attrarre o respingere i neuroni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della guida assonica, ad esempio in che modo i neuroni possono migrare o estendere i propri assoni in risposta all'ambiente cellulare esterno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che un elevato numero di neuroni può essere visualizzato in un singolo esperimento e molti coni di crescita possono essere analizzati contemporaneamente.Come preparazione, far bollire quattro-otto matrici di silicone in acqua per cinque minuti. Lasciarle asciugare completamente all'aria sotto una cappa a flusso laminare con i lati a strisce rivolti verso l'alto. Questo richiede circa un'ora.Continuare a lavorare sotto cappa. Utilizzare aria compressa o nastro adesivo per rimuovere qualsiasi polvere dal lato striato delle matrici. Quindi posizionare con attenzione ciascuna matrice in una piastra di plastica da sei centimetri separata, con il lato striato rivolto verso il basso.Con un dito, premere con fermezza ciascuna matrice. Evitare di intrappolare bolle d'aria tra la matrice e la piastra. Se la matrice non si attacca, ripetere il procedimento.Dopo averli fissati, segnare la posizione delle strisce sul lato inferiore della piastra per colture. Preparare le proteine ricombinanti marcate con fluorocromo in PBS. Preparare 25 microlitri per ogni piastra a strisce.Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, per ogni piastra, caricare una siringa da 22 gauge con 25 microlitri di proteina diluita e iniettarla attraverso il piccolo foro sul lato della matrice. Evitare l'introduzione di bolle d'aria nelle matrici, poiché potrebbero interferire con il legame delle proteine alle rispettive piastre.Ora, incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, aggiungere 300 microlitri di PBS nella fessura superiore di ciascuna matrice. Quindi aspirare il PBS da un piccolo foro situato sul lato di ciascuna matrice per rimuovere tutte le proteine ricombinanti non legate.Non aspirare completamente il PBS perché le proteine si seccherebbero. Eseguire questo risciacquo con il PBS un totale di tre volte. Successivamente, rimuovere con attenzione la matrice da ogni piastra. Quindi aggiungere immediatamente circa 100 microlitri di proteina controllata su tutta l'area striata, creando un rivestimento alternato su ogni piastra. Successivamente, incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, in ghiaccio, scongelare la laminina e il PBS a 20 microgrammi per millilitro.Dopo 30 minuti, lavare le piastre tre volte con PBS. Successivamente, ricoprire ogni piastra con circa 100 microlitri di laminina fredda e rimettere le piastre nell'incubatore per un'ulteriore ora. Un'ora dopo, lavare nuovamente le piastre tre volte con PBS.Dopo il terzo lavaggio, aggiungere circa 150 microlitri di mezzo di coltura a ogni piastra. Quindi incubare le piastre in un incubatore con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino al loro utilizzo successivo. Dopo l'eutanasia di un topo donatore E15,5, tagliare la pelle e il cranio in senso sagittale lungo la linea mediana della testa con forbici chirurgiche ed estrarre il cervello utilizzando una micro spatola.Trasferire con attenzione il cervello in una piastra di Petri da 60 millilitri contenente tre millilitri di HBSS. All'interno della piastra, utilizzare un bisturi per asportare gli emisferi, inclusi la corteccia, l'ippocampo e il corpo striato. Successivamente, dissezionare le regioni ippocampali rimuovendo con cura le meningi.Trasferire i tessuti ippocampali dissezionati in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente due millilitri di soluzione HBSS su ghiaccio. Sei ippocampi provenienti da tre embrioni sono sufficienti per coltivare neuroni su otto piastre. Dopo aver raccolto tutti i tessuti ippocampali, aspirare l'HBSS e sostituirlo con due millilitri di tripsina-EDTA.Quindi incubare il tubo per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Successivamente, neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo 500 microlitri di siero bovino fetale. Quindi centrifugare la miscela a 100 G per cinque minuti.Rimuovere il soprannatante e lavare il pellet con due millilitri di mezzo di coltura. Quindi centrifugare nuovamente la miscela e sostituire il mezzo con altro mezzo. Ora dissociare il tessuto mediante triturazione delicata utilizzando una pipetta da un millilitro con punta tagliata.Fare passare i tessuti avanti e indietro attraverso la punta del pipettaggio circa 10 volte. Quindi utilizzare una punta da un millilitro non tagliata e ripetere la triturazione per ottenere una sospensione di cellule singole. A questo punto isolare le cellule singole premendo la sospensione attraverso un filtro cellulare a maglia da 80 a 100 micron.Quindi centrifugare la sospensione filtrata a 150 G per cinque minuti, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di coltura. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 10.000 neuroni in 150 microlitri di mezzo di coltura su ciascuna piastra con strisce preparata. Depositare con attenzione la sospensione in modo da coprire interamente la regione striata.Neuroni ippocampali dissociati da topi E15.5 sono stati seminati e coltivati per 24 ore su strisce di proteina di controllo FC marcate con fluorocromo, oppure i neuroni sono stati seminati su strisce alternate di FLRT2 FC e FC di controllo non marcate. In entrambi i casi, i neuroni si sono aggregati ed hanno esteso i loro assoni in fasci. Sul controllo FC, i neuroni erano distribuiti uniformemente ed estendevano i loro assoni in direzioni casuali. Al contrario, quando coltivati con strisce di FLRT2 FC, gli assoni evitavano la crescita sulle regioni di FLRT2 FC.Pertanto, gli assoni in crescita si sono sviluppati principalmente sulle strisce di FC. Un ingrandimento maggiore mostra che gli assoni crescono lungo il confine con le strisce di FC FLRT2, ma non si estendono all'interno del territorio di FLRT2. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare un tappeto striato delle proteine raccomandate e valutare l'attività attrattiva o repulsiva utilizzando neuroni ippocampali dissociati.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se viene effettuata correttamente.

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Questo video dimostra un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico dei recettori del glutammato nelle colture neuronali primarie dell'ippocampo. Questo approccio consente l'osservazione delle popolazioni di recettori sia nel plasma che nelle membrane interne. La discriminazione tra questi sottogruppi si ottiene marcando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma anticorpi secondari coniugati a diversi...

Una tecnica in vitro per studiare il traffico del recettore del glutammato nei neuroni dell'ippocampo

Questo video mostra un metodo per valutare l'attività proteica utilizzando neuroni ippocampali su zone proteiche modellate. I neuroni mostrano repulsione nelle zone proteiche di prova e attaccamento nelle zone proteiche di controllo, evidenziando gli effetti dell'attività proteica attrattiva o repulsiva.

Valutazione dell'attività attrattiva o repulsiva delle proteine utilizzando i neuroni dell'ippocampo

L'aggiunta di palmitato reversibile alle proteine ​​è un importante regolatore del traffico intracellulare delle proteine. Questo è di particolare interesse in neuroni dove sono palmitoilato molte proteine ​​sinaptiche. Utilizziamo un metodo semplice biochimico per rilevare le proteine ​​palmitoilato in neuroni in coltura, che possono essere adattati per più tipi di cellule e tessuti.

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.

Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

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Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l&#39;attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

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Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

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Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica

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Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

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Stripe Assay per studiare lattività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dellippocampo (Video) | JoVE Journal

Stripe Assay per studiare l'attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell'ippocampo

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