Stripe Assay per studiare l'attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell'ippocampo
19 giugno 2016
Le molecole di guida degli assoni regolano la migrazione neuronale e la navigazione mirata dei coni di crescita. Presentiamo un metodo potente, il saggio a strisce, per valutare la capacità delle molecole guida di attrarre o respingere i neuroni. In questo protocollo, dimostriamo il saggio a strisce mostrando la capacità di FLRT2 di respingere i neuroni ippocampali in coltura.
L'obiettivo generale del saggio a strisce è valutare la capacità di proteine specifiche, come le molecole guida, di attrarre o respingere i neuroni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della guida assonica, ad esempio in che modo i neuroni possono migrare o estendere i propri assoni in risposta all'ambiente cellulare esterno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che un elevato numero di neuroni può essere visualizzato in un singolo esperimento e molti coni di crescita possono essere analizzati contemporaneamente.
Come preparazione, far bollire quattro-otto matrici di silicone in acqua per cinque minuti. Lasciarle asciugare completamente all'aria sotto una cappa a flusso laminare con i lati a strisce rivolti verso l'alto. Questo richiede circa un'ora.
Continuare a lavorare sotto cappa. Utilizzare aria compressa o nastro adesivo per rimuovere qualsiasi polvere dal lato striato delle matrici. Quindi posizionare con attenzione ciascuna matrice in una piastra di plastica da sei centimetri separata, con il lato striato rivolto verso il basso.
Con un dito, premere con fermezza ciascuna matrice. Evitare di intrappolare bolle d'aria tra la matrice e la piastra. Se la matrice non si attacca, ripetere il procedimento.
Dopo averli fissati, segnare la posizione delle strisce sul lato inferiore della piastra per colture. Preparare le proteine ricombinanti marcate con fluorocromo in PBS. Preparare 25 microlitri per ogni piastra a strisce.
Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, per ogni piastra, caricare una siringa da 22 gauge con 25 microlitri di proteina diluita e iniettarla attraverso il piccolo foro sul lato della matrice. Evitare l'introduzione di bolle d'aria nelle matrici, poiché potrebbero interferire con il legame delle proteine alle rispettive piastre.
Ora, incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, aggiungere 300 microlitri di PBS nella fessura superiore di ciascuna matrice. Quindi aspirare il PBS da un piccolo foro situato sul lato di ciascuna matrice per rimuovere tutte le proteine ricombinanti non legate.
Non aspirare completamente il PBS perché le proteine si seccherebbero. Eseguire questo risciacquo con il PBS un totale di tre volte. Successivamente, rimuovere con attenzione la matrice da ogni piastra.
Quindi aggiungere immediatamente circa 100 microlitri di proteina controllata su tutta l'area striata, creando un rivestimento alternato su ogni piastra. Successivamente, incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, in ghiaccio, scongelare la laminina e il PBS a 20 microgrammi per millilitro.
Dopo 30 minuti, lavare le piastre tre volte con PBS. Successivamente, ricoprire ogni piastra con circa 100 microlitri di laminina fredda e rimettere le piastre nell'incubatore per un'ulteriore ora. Un'ora dopo, lavare nuovamente le piastre tre volte con PBS.
Dopo il terzo lavaggio, aggiungere circa 150 microlitri di mezzo di coltura a ogni piastra. Quindi incubare le piastre in un incubatore con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino al loro utilizzo successivo. Dopo l'eutanasia di un topo donatore E15,5, tagliare la pelle e il cranio in senso sagittale lungo la linea mediana della testa con forbici chirurgiche ed estrarre il cervello utilizzando una micro spatola.
Trasferire con attenzione il cervello in una piastra di Petri da 60 millilitri contenente tre millilitri di HBSS. All'interno della piastra, utilizzare un bisturi per asportare gli emisferi, inclusi la corteccia, l'ippocampo e il corpo striato. Successivamente, dissezionare le regioni ippocampali rimuovendo con cura le meningi.
Trasferire i tessuti ippocampali dissezionati in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente due millilitri di soluzione HBSS su ghiaccio. Sei ippocampi provenienti da tre embrioni sono sufficienti per coltivare neuroni su otto piastre. Dopo aver raccolto tutti i tessuti ippocampali, aspirare l'HBSS e sostituirlo con due millilitri di tripsina-EDTA.
Quindi incubare il tubo per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Successivamente, neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo 500 microlitri di siero bovino fetale. Quindi centrifugare la miscela a 100 G per cinque minuti.
Rimuovere il soprannatante e lavare il pellet con due millilitri di mezzo di coltura. Quindi centrifugare nuovamente la miscela e sostituire il mezzo con altro mezzo. Ora dissociare il tessuto mediante triturazione delicata utilizzando una pipetta da un millilitro con punta tagliata.
Fare passare i tessuti avanti e indietro attraverso la punta del pipettaggio circa 10 volte. Quindi utilizzare una punta da un millilitro non tagliata e ripetere la triturazione per ottenere una sospensione di cellule singole. A questo punto isolare le cellule singole premendo la sospensione attraverso un filtro cellulare a maglia da 80 a 100 micron.
Quindi centrifugare la sospensione filtrata a 150 G per cinque minuti, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di coltura. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 10.000 neuroni in 150 microlitri di mezzo di coltura su ciascuna piastra con strisce preparata. Depositare con attenzione la sospensione in modo da coprire interamente la regione striata.
Neuroni ippocampali dissociati da topi E15.5 sono stati seminati e coltivati per 24 ore su strisce di proteina di controllo FC marcate con fluorocromo, oppure i neuroni sono stati seminati su strisce alternate di FLRT2 FC e FC di controllo non marcate. In entrambi i casi, i neuroni si sono aggregati ed hanno esteso i loro assoni in fasci. Sul controllo FC, i neuroni erano distribuiti uniformemente ed estendevano i loro assoni in direzioni casuali. Al contrario, quando coltivati con strisce di FLRT2 FC, gli assoni evitavano la crescita sulle regioni di FLRT2 FC.
Pertanto, gli assoni in crescita si sono sviluppati principalmente sulle strisce di FC. Un ingrandimento maggiore mostra che gli assoni crescono lungo il confine con le strisce di FC FLRT2, ma non si estendono all'interno del territorio di FLRT2. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare un tappeto striato delle proteine raccomandate e valutare l'attività attrattiva o repulsiva utilizzando neuroni ippocampali dissociati.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se viene effettuata correttamente.
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Panoramica
L'assay delle strisce è un metodo potente utilizzato per valutare la capacità delle molecole di guida degli assoni di attrarre o respingere i neuroni. Questa tecnica consente la visualizzazione di un elevato numero di neuroni e coni di crescita in un singolo esperimento, fornendo informazioni sul processo di migrazione neuronale e sull'allungamento dell'assone.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Sviluppo neuronale
Sfondo
- Le molecole di guida degli assoni svolgono un ruolo cruciale nella migrazione neuronale.
- Comprendere come i neuroni rispondono al loro ambiente è fondamentale per le neuroscienze.
- Il saggio delle strisce consente l'analisi simultanea di più coni di crescita.
- Questo metodo può contribuire a chiarire i meccanismi del comportamento neuronale.
Scopo dello studio
- Valutare gli effetti di specifiche molecole guida sul comportamento neuronale.
- Dimostrare l'utilità del saggio della striscia nella ricerca neuroscientifica.
- Fornire un protocollo per valutare le risposte neuronali ai segnali guida.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di matrici in silicone per il saggio della striscia.
- Bollitura delle matrici per garantire adeguate proprietà superficiali.
- Lasciare asciugare le matrici all'aria in condizioni controllate.
- Visualizzazione delle risposte neuronali a molecole guida.
Risultati principali
- È stato dimostrato che FLRT2 respinge i neuroni ippocampali coltivati.
- Il saggio delle strisce ha dimostrato efficacemente gli effetti repulsivi delle molecole guida.
- Un elevato numero di neuroni è stato analizzato contemporaneamente.
- Il metodo ha fornito chiarimenti significativi sulla navigazione neuronale.
Conclusioni
- Il saggio della striscia è uno strumento prezioso per lo studio dell'orientamento degli assoni.
- Molecole di guida come FLRT2 possono influenzare in modo significativo il comportamento neuronale.
- Questo metodo migliora la nostra comprensione della migrazione neuronale e della navigazione del cono di crescita.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Il saggio a strisce consente la valutazione ad alto rendimento dell'attività delle molecole di guida degli assoni, supportando la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci per lo sviluppo neurologico. Quantificando le risposte neuronali attrattive o repulsive, fornisce un approccio meccanicistico per ridurre i rischi associati ai candidati terapeutici mirati alla migrazione o al pathfinding neuronale. Questo metodo aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando l'attività molecolare al comportamento neuronale funzionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche testando se molecole di guida come FLRT2 inducono effetti repulsivi sugli assoni neuronali.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale delle target mediante analisi quantitativa della distribuzione dei neuroni su strisce rivestite di proteine.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando molecole di guida con forti effetti direzionali sulla crescita neuronale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara substrati striati validati per schermature di composti o proteine coerenti in sistemi neuronali.
- Riproducibilità: Standardizza la presentazione di segnali extracellulari per garantire letture affidabili di attrazione o repulsione tra esperimenti diversi.
- Scalabilità: Permette l'analisi simultanea di numerosi coni di crescita, supportando formati di schermatura a media produttività.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella le risposte neuronali dell'ippocampo applicabili a disturbi neurosviluppativi che coinvolgono difetti nella guida degli assoni.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica confermando gli effetti delle molecole guida su sistemi di neuroni primari.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce indicazioni per i criteri di avanzamento stabilendo soglie ripulsive dipendenti dalla dose o dalla concentrazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio della striscia si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'interazione con il bersaglio alla validazione funzionale, in particolare nei flussi di lavoro orientati alle neuroscienze per la valutazione di modulatori dell'assone.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi determinando se le proteine candidate alterano la traiettoria neuronale o la dinamica del cono di crescita.
- Screening: Fornisce output quantitativi come percentuali di distribuzione delle strisce neuronali, consentendo il confronto della potenza delle molecole di guida.
- Analisi: Offre letture misurabili come l'evitamento dell'assone o l'allineamento al confine, facilitando il confronto statistico tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici utilizzando neuroni ippocampali primari, aumentando la rilevanza fisiologica dei risultati.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per lo screening di diverse molecole di guida o di anticorpi terapeutici mirati alla navigazione neuronale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando direttamente il rivestimento del substrato proteico alla risposta neuronale direzionale.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione attraverso protocolli di preparazione della matrice e di rivestimento proteico, migliorando la coerenza tra esperimenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di prosegui/non-prosegui fornendo letture fenotipiche chiare sull'attrazione o la repulsione assonale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione basata sul rischio di bersagli nei percorsi di guida, in base a dati funzionali sull'evitamento neuronale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissociazione primaria di neuroni e nella preparazione sterile della matrice in flusso laminare.
- Presuppone l'accesso a proteine ricombinanti marcate con fluorocromi e a strumenti per la fabbricazione di matrici in silicone.
- Necessita della standardizzazione dei passaggi di incubazione, lavaggio e rivestimento delle proteine per evitare la formazione irregolare di strisce.
- Richiede considerazioni adattative qualora si estenda l'approccio a tipi cellulari non neuronali o a proteine alternative della matrice extracellulare.
- È limitato dalla necessità di un controllo preciso del microambiente per prevenire l'essiccazione delle proteine o il distacco della matrice durante il saggio.
