Name: Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un In Vivo Camera ingegneria dei tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri la creazione di tessuti vascolarizzati in vivo mediante anastomosi microchirurgica arterovenosa in modelli murini. Questa tecnica avanzata consente la rigenerazione di organi e la riparazione di difetti tessutali con approvvigionamento intrinseco.

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti provenienti NHMRC e Stafford Fox Medical Foundation. Gli autori riconoscono l&#39;assistenza chirurgica di Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos e Amanda Rixon del Medical Sperimentale e l&#39;Unità Chirurgia, Ospedale di St. Vincent, Melbourne. Il supporto è fornito anche dal Dipartimento del Governo dello Stato del Victoria di innovazione, l&#39;industria e il Programma delle infrastrutture di supporto operativi per lo sviluppo regionale.

I protocolli descritti qui sono stati approvati dal Comitato Etico Animal Hospital di Melbourne di San Vincenzo, in Australia, e sono state condotte in stretta aderenza alle linee guida Australian National sanità e ricerca medica del Consiglio. NOTA: due protocolli della camera sono descritti di seguito. I due modelli diversi e loro disegni camera specifici sono illustrati in Figura 1. Sezione (1) è realizzato in policarbonato (per il modello camera di ciclo di ratto artero). È cilindrico con diametro interno 13 mm e altezza 4 mm. Una finestra a un certo punto nel muro consente l&#39;accesso senza ostacoli per il peduncolo. Nel secondo modello (per flusso continuo ratto modello camera peduncolo), la camera è realizzata poliacrilici e è rettangolare (10 x dimensioni 8 x 4 mm 3 interne). Ha due aperture 1,5 mm sui lati opposti per accogliere l&#39;arteria femorale e la vena quanto trasgrediscono la camera. 1. Rat artero-Loop Modello Camera (One Chamber per animale) NOTA: Prima di iniziare l&#39;intervento chirurgico, assicurarsi che tutti gli strumenti siano stati correttamente sterilizzati. Allo stesso modo, assicurano il resto strumenti su asciugamani sterili e sono ad una distanza ragionevole dal campo operatorio per evitare la contaminazione durante la procedura. <ol><li> Preparazione del Animal per la chirurgia <ol><li> Utilizzare ratti peso di almeno 250 g per le grandi dimensioni delle navi per la realizzazione del ciclo artero. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale con il 4% inalazione isoflurano. Corroborare un&#39;adeguata profondità dell&#39;anestesia valutando refrattarietà alla punta-pizzico. Dopo l&#39;anestesia, tenere l&#39;animale adeguatamente anestetizzato durante tutta la procedura con il 2% isoflurano. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina su un blocco riscaldante e applicare il lubrificante sterile per gli occhi per prevenire l&#39;essiccamento durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> L&#39;utilizzo di un rasoio elettrico, la barba sia inguini e rimuovere i capelli con un pezzo di garza umida. </li><li> Preparare i siti chirurgici con clorexidina/ Soluzione di etanolo al 70% e drappeggio l&#39;animale con teli sterili. Somministrare una singola dose di Carprofen (5 mg / kg, per via sottocutanea) come analgesico. </li></ol></li><li> Raccolta di vena femorale Graft <ol><li> Utilizzando una lama # 15, fare un lungo 4 cm incisione cutanea sulla all&#39;inguine sinistro parallelo al legamento inguinale. Ciò espone il cuscinetto adiposo inguinale. </li><li> Tagliare il cuscinetto adiposo circonferenziale con le forbici lasciandola attaccata al suo peduncolo vascolare sulla base dei vasi epigastrici. </li><li> Utilizzando le forbici micro, liberare le aderenze del tessuto connettivo vaporosi tra la parete addominale e vasi femorali sottostanti. </li><li> Posizionare un divaricatore sulla parete addominale e tirare mediale. Ciò espone il legamento inguinale e tutta la lunghezza dei vasi femorali. </li><li> Utilizzando micro pinze e forbici curve sezionare la vena epigastrica e isolarlo dal suo grasso circostante tirando e taglio con delicatezza. Questa vena agisce come un tether nel costruire il ciclo. </li><li> usinG Micro pinze e micro forbici curve aprire la guaina perivascolare che contiene i vasi femorali e dei nervi tutta la strada dal legamento inguinale alla sua distale biforcazione al ramo epigastrica. </li><li> Utilizzando micro pinze, prendere la vena femorale per la sua avventizia e delicatamente separarlo dai tessuti circostanti e di accompagnamento delle arterie. Fare questo con una pinza micro e curve micro forbici rotonde punte tirando il tessuto a parte e taglio attraverso di essa. NOTA: Non afferrare tutto lo spessore della parete venosa come questo potrebbe causare traumi alla intima che lo rende incline alla trombosi. </li><li> rami laterali legare trovato durante la dissezione con 10/0 sutura in nylon o coagulano con un coagulatore bipolare. </li><li> Con la vena femorale completamente libero, legare la sua estremità prossimale e distale con 4/0 punti di sutura in seta. Assicurarsi di ottenere una vena innesto di almeno 10 mm di lunghezza e comprende circa 0.5 cm Lunghezza del ramo epigastrica per essere usato come un tether corda ragazzoper tenere l&#39;anello aperto nella camera. </li><li> Utilizzando pinze micro e micro forbici diritte, tagliare l&#39;avventizia dalla estremità del trapianto tirando e tagliando delicatamente. Questo può essere fatto anche in seguito, prima di anastomosi microchirurgiche. </li><li> Lavare l&#39;innesto della vena con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U / ml di eparina) e lasciare riposare nella soluzione. Chiudere la ferita con funzionamento continuo 4/0 sutura di seta più due o tre ulteriori semplici punti interrotti. </li></ol></li><li> Creazione di arterovenose Loop e l&#39;impianto della Camera <ol><li> Ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.4 in esattamente allo stesso modo sull&#39;arto controlaterale. </li><li> Utilizzando micro pinze, sezionare e isolare sia l&#39;arteria epigastrica e la vena formare il cuscinetto adiposo circostante. Per fare ciò, tirando delicatamente il tessuto lontano da vasi </li><li> Utilizzando micro pinze, prendere l&#39;arteria femorale dal suo avventizia e liberarla dai tessuti circostanti. Fare questo con una pinza micro e curvo mic rotonda punteforbici ro tirando il tessuto a parte e taglio attraverso di essa. Legare o coagulare i suoi rami laterali. </li><li> Legare l&#39;arteria femorale e la vena distale alla nascita dei vasi epigastrici utilizzano 4/0 di seta di sutura. </li><li> Posizionare un morsetto prossimalmente su ciascuna arteria femorale e la vena. Utilizzando un forte dritto micro forbice, fare una trasversale pulito tagliato in ogni distale nave alla nascita dei rami epigastrico. Posizionare un contrasto di fondo di plastica sterile sotto i vasi. </li><li> Lavare le navi energicamente con abbondante soluzione salina eparinizzata finché tutto il sangue viene rimosso dal lume. </li><li> Portare l&#39;innesto della vena nel campo operatorio e rimuovere eventuali avventizia esubero dalle estremità delle navi di cui al punto 1.2.10, se necessario. </li><li> Eseguire entrambe le anastomosi microchirurgiche con 10/0 sutura in nylon. Anastomose l&#39;estremità prossimale della vena graft alla vena femorale e l&#39;estremità distale all&#39;arteria femorale. Questo permetterà al sangue di fluire fROM arterioso al lato venoso senza resistenza dalle valvole all&#39;interno del trapianto vena. NOTA: Assicurarsi che i vasi femorali e della vena trapianto resto nella loro posizione naturale, senza colpi di scena. </li><li> Controllare eventuali perdite in entrambi i siti anastomosi. Risolvere piccole perdite, che sembrano non pulsante il sangue che esce dal sito anastomotico, mettendo un piccolo pezzo di grasso sulla parte superiore e delicatamente compressione per 5-10 min. Grandi perdite pulsanti che rapidamente inondano l&#39;intero campo avranno bisogno di punti di sutura aggiuntivi. </li><li> Controllare la pervietà del ciclo artero-venosa. occlusione Gentle dell&#39;arteria femorale dovrebbe rendere termoretraibile mentre la stessa nella vena femorale dovrebbe engorge esso. </li><li> Posizionare la base della camera di ingegneria dei tessuti sotto il ciclo arterovenosa con quest&#39;ultimo riposo nella sua posizione naturale senza torsioni o piegature. </li><li> Fissare la base della camera al legamento inguinale e sottostante fascia muscolare con 6/0 punti di sutura in nylon. </li><li> Mettere il coperchio sopra ilbase in modo che i vasi femorali entrano nella camera attraverso una tacca (finestra nel lato della camera). Quando si chiude il coperchio, assicurarsi che cattura i rami epigastrico, tra la base e il coperchio della camera, che agiscono come pastoie di tenere l&#39;anello artero-venosa in posizione. </li><li> Chiudere la ferita con funzionamento continuo 4/0 sutura di seta più due o tre ulteriori semplici punti interrotti. </li><li> Lasciare che l&#39;animale per recuperare da anestesia su un blocco di riscaldamento. </li><li> Non lasciare l&#39;animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Allo stesso modo, non restituiscono un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. 24 ore più tardi, somministrare un&#39;altra dose singola di Carprofen (5 mg / kg, per via sottocutanea) come analgesico. </li><li> Trattare la ferita con attualità pomata antibiotica per 5 giorni. Se la ferita è aperta, anestetizzare l&#39;animale come al punto 1.1.2 tramite 1.1.5 e chiudere la ferita come in 1.3.14. Monitorare la salute di animali al giorno. Eutanasia l&#39;animale con una dose letale di iniezione lethabarb intraperitoneale (163 mg / kg a 0,25 ml per 23 ago G) se l&#39;animale mostra più di segni moderati di inacitivity, scarso appetito, perdita di peso e perdita di colore. </li></ol></li></ol> 2. flusso continuo Pedicle Camera (due camere per animale) <ol><li> Preparazione del Animal per la chirurgia <ol><li> Ripetere i passaggi 1.1.1 tramite 1.1.4. Due camere possono essere impiantati in entrambe le regioni all&#39;inguine di un singolo topo. </li></ol></li><li> Isolamento di vasi femorali e inserimento di sezione <ol><li> Ripetere i passaggi 1.2.1 tramite 1.2.8. </li><li> Con entrambi arteria e vena completamente liberata tessuti circostanti e loro rami ligato, portare la camera nel campo operatorio. </li><li> Mettere ciascuno dei vasi femorali intatte sulla corrispondente feritoia della base della camera assicurandosi che non vi siano torsioni o curvature. </li><li> Chiudere la camera da attaching il coperchio alla base. Chiudere la ferita utilizzando funzionamento continuo 4/0 sutura seta più di due o tre ulteriori semplici punti interrotti e permettere all&#39;animale di recuperare come precedentemente descritto. </li></ol></li></ol> 3. Raccolta delle Camere e la lavorazione dei tessuti <ol><li> Una volta punti di tempo dell&#39;esperimento (4-6 settimane post-impianto) vengono raggiunti, anestetizzare l&#39;animale come al punto 1.1.2 e 1.1.3 ripetere i passaggi attraverso 1.1.5. </li><li> Aprire la ferita con una lama # 15 e tagliare i tessuti con le forbici finché la camera è completamente esposto. </li><li> Esporre i vasi femorali prossimale al costrutto e di prova per la pervietà vascolare: occlude delicatamente il vaso con due microforceps, poi il latte il sangue in una direzione distale e, infine, rilasciare il forcipe prossimali. Se la nave si riempie di sangue nuovo, ciò conferma la pervietà. Legare i vasi femorali prossimalmente nel caso del ciclo artero ed entrambi prossimale e distale nel caso di the flow-through configurazione e rimuovere le camere con il tessuto contenente in blocco. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, eutanasia l&#39;animale con una dose letale di iniezione lethobarb intraperitoneale (163 mg / kg in 0,25 ml per 23 ago G). </li><li> Fissare tessuti in paraformaldeide 4% a temperatura ambiente per 24 ore. Tessuti dividere in più sezioni trasversali (1-2 mm di spessore) e incorporare in cera di paraffina o composto ottimale temperatura di taglio per le sezioni di paraffina (5 micron) o sezioni congelate (10 micron), rispettivamente. 3,4,8,17,22, 24 </li><li> Eseguire routine di colorazione istologica come ematossilina ed eosina esaminare la morfologia generale dei tessuti. Eseguire la colorazione immunoistochimica con anticorpi specifici per identificare il tipo cellulare di interesse, 3,4,8,17,22,24,29 per T immunostaining esempio, la troponina cardiaca per cardiomiociti. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi in gioco.

Ingegneria della microcircolazione è attualmente in fase di studio essenzialmente attraverso due approcci. La prima comporta lo sviluppo di una rete vascolare altamente interconnessa all&#39;interno del costrutto in vitro in modo che quando impiantato, capillari dal letto vascolare ospitante collegano con quelli del trapiantato costruire attraverso un processo chiamato inosculation, garantendo così la consegna di nutrienti non solo la periferia ma anche al nucleo. 21,32,33 Questo è chiamato pre-vasco...

Fabbricazione del tessuto vascolarizzato funzionale utilizzando un approccio di ingegneria dei tessuti è un paradigma emergente nel campo della medicina rigenerativa. 1,2 Molti approcci di ingegnerizzare tessuti nuovi e sani per la sostituzione di tessuto danneggiato o organi difettosi sono stati sviluppati, 3-6 sperimentalmente in modelli animali di piccole dimensioni con promettente potenziale clinico. 7,8 Tuttavia, vascolarizzazione rimane una delle grandi sfide per l&#39;ingegneria dei tessuti che limitano il potenziale per crescere tessuti di dimensioni clinicamente rilevante. 9 Gli attuali approcci per vascolarizzano tessuto seguire sia una via estrinseca in cui i nuovi vasi crescono da letto vascolare destinatario e invadono tutto il tessuto impiantato costruisce 10 o un percorso di vascolarizzazione intrinseca dove il sistema vascolare cresce e si espande in sintonia con il tessuto di recente sviluppo. 11 L&#39;approccio estrinseca coinvolge tradizionalmente le cellule di semina su una impalcaturain vitro e impiantare il costrutto completo nella animale vivente con l&#39;aspettativa che i nutrienti, in precedenza forniti da terreni di coltura, sarà acquistato dalla circolazione. 12,13 Il concetto è semplice come crescita interna vascolare è troppo lento e solo gli impianti molto sottili (&lt; di spessore 1-2 mm) rimane valida. Fornire sostanze nutritive e ossigeno per mezzo di una vascolarizzazione sufficiente e rapida è al centro di tutti i tentativi riusciti a crescere sostituti tissutale più complesse e più grandi, come ossa, muscoli, grasso e gli organi solidi. 14,15 vascolarizzazione intrinseca offre il potenziale per costrutti più grandi per lo sviluppo dalla crescita di tessuto progressiva compatibile con la sua espansione apporto di sangue. Un disegno è l&#39;impianto in vivo in una camera di un peduncolo vascolare con o senza un ponteggio seminato cellule. 5,6 Questo ha aperto la strada a nuove procedure per la generazione di tessuti intrinsecamente vascolarizzati spessi. 16,17 &lt;/ P&gt; Più recentemente, sono state sviluppate strategie di pre-vascolarizzano innesti di tessuto, prima dell&#39;impianto. Queste reti dei vasi sanguigni incorporate hanno lo scopo di inosculate con vasi di accoglienza presso l&#39;impianto consentono la rapida fornitura di un apporto di sangue completo per migliorare la sopravvivenza di tutte le parti di un innesto di tessuto spesso trapiantato. 18 Siamo stati pionieri di un vascolarizzato vivo modello in ingegneria dei tessuti nei piccoli animali che coinvolge una via sottocutanea impiantato semirigido camera chiusa contenente un peduncolo vascolare perfusione e biomateriali cellulari contenenti. La camera crea un ambiente ischemico che stimola sprouting angiogenico dai vasi impiantati. 3 Il peduncolo vascolare può essere un ciclo arterovenosa ricostruite o un&#39;arteria flusso continuo intatta e vena. 3-6,19 This vascolari germogli peduncolari un funzionamento ed estesa artero rete -capillary-venosa che collega sia l&#39;arteeriole e venoso si conclude con il peduncolo vascolare. 3,20, inoltre, la circostante camera di supporto cava protegge il tessuto in via di sviluppo da potenzialmente deformare forze meccaniche e prolunga l&#39;unità ischemico per migliorare la vascolarizzazione. 3,21,22 Se il peduncolo nave è semplicemente impiantato in tessuto normale e non all&#39;interno dello spazio protetto della camera, germinazione angiogenico cessa lungo la stessa timeline come una ferita normale e nessun nuovo tessuto si accumulano intorno al peduncolo. Gli investigatori hanno utilizzato questa configurazione in vivo per produrre costrutti di tessuto tridimensionali funzionali vascolarizzati con vascolarizzazione di sostegno e di dimensioni clinicamente rilevante. 4,23 Inoltre, i costrutti di tessuto vascolarizzate ingegnerizzati con il suo peduncolo vascolare intatto possono essere raccolti per il successivo trapianto presso il sito della lesione . 24,25 Uno scenario più clinicamente fattibile sarebbe la creazione della camera presso il sito definitivo per la ricostruzione sale come il petto. Così, questa de novo tessuto approccio ingegneristico potrebbe avere potenziale clinico di fornire una nuova fonte di tessuto bersaglio funzionale per la chirurgia ricostruttiva. 26-28 Il seguente protocollo fornirà una guida generale per costruire un vascolarizzati camera di ingegneria tissutale in vivo nel ratto, che potrebbe essere adattato in diversi modelli animali e impiegato per esaminare i processi complicati dell&#39;angiogenesi, produzione della matrice, e la migrazione e la differenziazione cellulare.

<table><tbody><tr><td>Lama da bisturi 1 15</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td></td></tr><tr><td>Pinza adson a denti 1</td><td>Braun</td><td>BD527R</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per ago 1</td><td>Braun</td><td>BM201R</td><td></td></tr><tr><td>Coagulatore bipolare 1&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>US335</td><td></td></tr><tr><td>Pinza microchirurgica per ago B-15-8,3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00763</td><td></td></tr><tr><td>Pinza microdilatatore D-5a,2</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00125</td><td></td></tr><tr><td>Pinza microchirurgica da orafo JF-5</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00108</td><td></td></tr><tr><td>Forbici microchirurgiche - dritte SAS-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00098</td><td></td></tr><tr><td>Forbici microchirurgiche - curve SDC-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00090</td><td></td></tr><tr><td>2 Morsetti singoli B-3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00400</td><td></td></tr><tr><td>2 Suture in nylon 10/0</td><td>S &amp;amp; T</td><td>03199</td><td></td></tr><tr><td>1 Sutura in nylon 6/0</td><td>Braun</td><td>G2095469</td><td></td></tr><tr><td>2 Suture in seta 4/0</td><td>Braun</td><td>C0760145</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaine 1%</td><td>Dealmed</td><td>150733</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Eparina sodica</td><td>Dealmed</td><td>272301</td><td>5.000 UI/ml</td></tr><tr><td>Ringer lattato</td><td>Baxter</td><td>JB2323</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>1 Camera a forma di cupola per ingegneria tissutale</td><td>realizzata su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Camera a flusso continuo</td><td>realizzata su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettina I, Griffonia Simplicifolia&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1105</td><td>1,67 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Anticorpo contro la troponina T</td><td>Abcam</td><td>Ab8295</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Anticorpo specifico per l'uomo contro Ku80</td><td>Abcam</td><td>Ab80592</td><td>0,06 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Anticorpo contro la desmina</td><td>Dako</td><td>M0760</td><td>2,55 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Colorante Cell Tracker CM-DiI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-7000</td><td>3 mg/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cellule</td></tr><tr><td>Lethabarb (pentobarbitone sodico)</td><td><a href="www.virbac.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Virbac Animal Health</a></td><td>LETHA450</td><td>325 mg/ml</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante flessibile</td><td><a href="http://www.redzoneheating.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Redzone Heating</a></td><td>RZ/Medium</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria dei tessuti da parte intrinseca vascolarizzazione in un<em&gt; in vivo</em&gt; camera ingegneria dei tessuti

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Nella chirurgia ricostruttiva, vi è una necessità clinica di un&#39;alternativa ai metodi attuali di ricostruzione autologo che sono complessi, costosi e commercio un difetto per un altro. L&#39;ingegneria dei tessuti mantiene la promessa di affrontare questa crescente domanda. Tuttavia, la maggior parte delle strategie di ingegneria tissutale non riescono a generare sostituti stabili e funzionali dei tessuti a causa della scarsa vascolarizzazione. Questo documento si concentra su una ingegneria dei tessuti modello in vivo della camera di vascolarizzazione intrinseca in cui un&#39;arteria perfusione e una vena o come un ciclo artero o di una configurazione peduncolo a flusso continuo è diretto all&#39;interno di una camera cava protetta. In questo sistema camerale basato germinazione angiogenica verifica dai vasi arterovenose e questo sistema attrae migrazione cellulare endogena ischemica e infiammatoria motore che riempie progressivamente spazio della camera con tessuto fibro-vascolare. cellula esogena / matrice impianto al momento della costruzione della camera migliora sur cellularevivenza e determina la specificità dei tessuti ingegnerizzati che si sviluppano. I nostri studi hanno dimostrato che questo modello camera può generare con successo diversi tessuti come grasso, muscolo cardiaco, fegato e altri. Tuttavia, sono necessarie modifiche e perfezionamenti per garantire tessuto bersaglio formazione è coerente e riproducibile. Questo articolo descrive un protocollo standardizzato per la realizzazione di due differenti modelli a camera ingegneria tissutale vascolarizzate in vivo.

La creazione microchirurgico di camere ingegneria tissutale è stata eseguita come descritto nel protocollo di cui sopra. I tessuti generati all&#39;interno delle camere possono essere esaminate istologicamente come descritto nel passaggio protocollo 3. Vari tipi di tessuto sono stati progettati con successo utilizzando la camera vascolarizzata in vivo (Figura 2). Questi includono tessuto cardiaco con cardiomiociti neonatali di ratto (Figura 2A),...

Questa è una linea guida per la costruzione di tessuto vascolarizzato in vivo utilizzando un circuito arterovenoso microchirurgico o una configurazione peduncolare a flusso continuo all'interno di una camera di ingegneria tissutale. I tessuti vascolarizzati generati possono essere impiegati per la rigenerazione degli organi e la sostituzione di difetti tissutali, nonché per test farmacologici e modellazione della malattia.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare uno spazio in cui il tessuto possa crescere ed espandersi contemporaneamente allo sviluppo di un'adeguata rete vascolare, portando infine alla generazione di un blocco tridimensionale di tessuto vascularizzato, di grandi dimensioni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ingegneria di tessuti vascularizzati per scopi ricostruttivi, nonché per il trapianto e la riparazione d'organo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto appena generato è intrinsecamente irrorato dalla propria rete vascolare, senza dover dipendere dalla diffusione dall'ambiente circostante per la sopravvivenza.La procedura sarà dimostrata da Sue McKay e Liliana Pepe. Anestetizzare un ratto del peso di almeno 250 grammi e valutare la profondità dell'anestesia mediante una pinzatura del dito del piede. Se il ratto non risponde, mantenere la sedazione utilizzando isoflurano al 2% per tutta la durata della procedura.Successivamente, applicare un unguento a base di solfato di magnesio sugli occhi. Poi, con il ratto in posizione supina, utilizzare rasoi elettrici per depilare l'inguine e rimuovere i peli con una garza inumidita. Quindi, pulire i siti chirurgici con una soluzione di clorexidina contenente etanolo al 70%.Infine, coprire l'animale con asciugamani sterili e procedere con l'intervento chirurgico. Utilizzando una lama numero 15, praticare un'incisione cutanea lunga quattro centimetri nell'inguine sinistro, parallela al legamento inguinale. Successivamente, tagliare circolarmente il cuscinetto adiposo inguinale esposto con le forbici, lasciandolo attaccato al suo peduncolo vascolare, costituito dai vasi epigastrici.Ora, con forbici microchirurgiche, liberare le aderenze del tessuto connettivo sottile tra la parete addominale e i vasi femorali sottostanti. Successivamente, posizionare un retrattore sulla parete addominale e tirarlo medialmente per esporre il legamento inguinale e l'intera lunghezza dei vasi femorali. Poi, utilizzando pinze microchirurgiche e forbici curve, dissezionare la vena epigastrica ed isolarla dal grasso circostante.Questa vena fungerà da ancoraggio. Procedere aprendo la guaina perivascolare contenente i vasi femorali e il nervo. Aprirla completamente dal legamento inguinale fino alla sua biforcazione distale rispetto al ramo epigastrico.A questo punto, e per tutta la durata della procedura, è fondamentale manipolare con delicatezza i vasi femorali. Qualsiasi danno può provocare trombosi e il fallimento dell'intero esperimento. Successivamente, utilizzando pinzette microchirurgiche, afferrare la vena femorale attraverso la sua avventizia e separarla delicatamente dai tessuti circostanti e dall'arteria adiacente.Durante questo passaggio, non afferrare l'intero spessore della parete venosa, poiché ciò potrebbe causare un trauma all'intima, rendendo la vena predisposta alla trombosi. Sempre in questa fase, legare i rami laterali con sutura in nylon 10-0 oppure coagularli mediante un coagulatore bipolare. Una volta completamente liberata, la vena femorale deve essere legata in modo prossimale e distale con suture in seta 4-0, ottenendo un innesto venoso lungo almeno 10 millimetri, che comprenda circa mezzo centimetro di lunghezza del ramo epigastrico.Il ramo funge da cavo di ancoraggio per mantenere aperto il loop nella camera. Successivamente, rimuovere la tonaca avventizia dalle estremità del trapianto. Se necessario, questo passaggio può essere posticipato prima delle anastomosi microchirurgiche.Completare la preparazione della graft venosa lavandola con soluzione salina eparinizzata e lasciandola riposare riempita con soluzione salina eparinizzata. Quindi, chiudere la ferita utilizzando una sutura continua in seta 4-0 e due o tre ulteriori punti semplici interrotti. Per iniziare, esporre il legamento inguinale e l'intera lunghezza del vaso femorale dell'arto controlaterale come precedentemente dimostrato.Quindi, utilizzando pinzette microchirurgiche, dissezionare e isolare sia l'arteria che la vena epigastrica dal tessuto adiposo circostante. Avere delicatezza quando si allontana il tessuto dai vasi. Procedere afferrando l'arteria femorale attraverso la sua avventizia e liberandola dai tessuti circostanti.In questo procedimento, legare o coagulare i rami collaterali dell'arteria. Successivamente, posizionare un morsetto in posizione prossimale su entrambe le arterie e vene femorali. Ora, utilizzando un punto di sutura in seta 4-0, legare l'arteria e la vena femorale in posizione distale rispetto all'emergenza dei vasi epigastrici.Ora posizionare un fondo di contrasto in plastica sterile sotto i vasi e utilizzare un microbisturi dritto e affilato per tagliare trasversalmente ciascun vaso. Una volta tagliati, lavare accuratamente i vasi con abbondante soluzione salina eparinizzata finché tutto il sangue non è stato rimosso dalla loro cavità. A questo punto, portare l'innesto venoso nel campo operatorio.Posizionare il tratto venoso in modo che l'estremità prossimale del tratto venoso sia pronta per essere anastomizzata alla vena femorale ricevente e l'estremità distale all'arteria femorale ricevente. Ciò permetterà al sangue di fluire dal lato arterioso a quello venoso senza incontrare resistenza dalle valvole interne al tratto venoso. Assicurarsi che i vasi femorali e il tratto venoso siano in posizione naturale, senza torsioni.Utilizzando sutura in nylon 10-0, eseguire l'anastomosi chirurgica su entrambi i lati. Un'anastomosi microchirurgica di buona qualità e atraumatica è fondamentale. Danni all'intima del vaso, dissecazione dei vasi o punti di sutura posizionati in modo errato rendono il sito di anastomosi predisposto alla formazione di trombi.Quindi, verificare la presenza di perdite in entrambi i siti anastomotici. Risolvere le piccole perdite, che appaiono come sangue non pulsante in uscita dal sito anastomotico, posizionando un piccolo pezzo di tessuto adiposo o una spugna sulla parte superiore e comprimendo delicatamente per cinque-dieci minuti. Le perdite pulsanti più ampie, che allagano rapidamente l'intero campo operatorio, richiederanno punti di sutura aggiuntivi.Successivamente, verificare la pervietà del loop arterovenoso. L'occlusione delicata dell'arteria femorale dovrebbe determinarne il restringimento. Al contrario, l'occlusione della vena femorale dovrebbe causare l'ingorgo del loop.Ora posizionare la base della camera di ingegneria tissutale sotto il loop arterovenoso. Assicurarsi che il loop si trovi nella sua posizione naturale, senza torsioni o pieghe. Quindi, con suture in nylon 6-0, fissare la base della camera al legamento inguinale e alla fascia muscolare sottostante.Successivamente, posizionare il coperchio sulla base della camera. Stringere delicatamente i rami epigastrici sotto il coperchio per mantenere il loop in posizione. Quindi, chiudere la ferita utilizzando un punto continuo in seta 4-0, insieme a due o tre punti semplici interrotti aggiuntivi.Infine, permettere all'animale di riprendersi dall'anestesia in una gabbia individuale e somministrare una singola dose di carprofene per via sottocutanea come analgesico. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico come in precedenza. È possibile impiantare due camere in un singolo ratto, una in ogni inguine.Quindi, isolare il vaso femorale come descritto in precedenza. Dopo aver completamente liberato sia l'arteria che la vena dai tessuti circostanti e legato i loro rami, portare la camera nel campo operatorio. Successivamente, posizionare ciascun vaso femorale integro nelle fessure corrispondenti della base della camera.Assicurarsi che nessuno dei due sia torcito o piegato. Successivamente, chiudere la camera fissando il coperchio alla base. Poi chiudere la ferita e lasciare che l'animale si riprenda come descritto in precedenza.La creazione microchirurgica di camere per l'ingegneria tissutale è stata eseguita come descritto. Diversi tipi di tessuto sono stati ingegnerizzati con successo utilizzando la camera vascolarizzata in vivo, tra cui tessuto cardiaco con cardiomiociti di ratto neonati, tessuto muscolare con mioblasti scheletrici di ratto e tessuto adiposo con idrogel derivato dalla matrice extracellulare del tessuto adiposo. Il sistema di stereologia consente una quantificazione imparziale del volume tissutale specifico.Ad esempio, le cellule endoteliali marcate con lectina in sezioni trasversali sono state utilizzate per stimare i volumi vascolari. Dopo l'impianto in vivo di cellule marcate con coloranti fluorescenti, il loro destino può essere monitorato. Ad esempio, cardiomiociti di ratto neonati marcati con il colorante i sono stati rilevati nei costrutti tessutali tre giorni dopo l'impianto.In alternativa, gli anticorpi specifici per specie possono essere utilizzati per identificare le cellule impiantate negli studi di xeno-trapianto. Ad esempio, cellule staminali pluripotenti indotte umane impiantate in ratti immunodepressi potrebbero essere identificate nel tessuto prelevato dalla camera. Una volta acquisita padronanza, la camera a flusso e il loop arterovenoso possono essere impiantati rispettivamente in circa 20 e 90 minuti.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale mantenere in ogni momento le condizioni di sterilità e adottare le misure necessarie in caso di contaminazione. Non dimenticare che un manipolamento delicato dei vasi sanguigni e un'anastomosi microchirurgica atraumatica sono essenziali per garantire il successo. A questo proposito, raccomandiamo vivamente una formazione di base in microchirurgia prima di tentare questa procedura, in particolare per la costruzione del loop arterovenoso.

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Bioingegneria

Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Qui, descriviamo una metodologia per fornire cordone umano derivati ​​dal sangue umano endoteliali che formano colonie cellule (ECFCs) e dal midollo osseo le cellule staminali mesenchimali (MSCs), inserita in un collagene / fibronectina gel, per via sottocutanea in topi immunodeficienti. Questa cella / gel combinazione genera una rete umana vascolare che collega con la vascolarizzazione del mouse.

Bioingegneria reti umane in topi immunodeficienti microvascolari

Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Un protocollo step-by-step per il collocamento inter-posizionale di ingegneria tessutale Vessels (TEV) nella carotide di una pecora con anastomosi end-to-end e di valutazione digitale in tempo reale in vivo fino al sacrificio degli animali.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

In questo lavoro, presentiamo una tecnica per la rapida fabbricazione di tessuti vascolari viventi mediante coltura diretta di collagene, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. Inoltre, viene descritto un nuovo protocollo per la caratterizzazione meccanica di tessuti vascolari ingegnerizzati.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.

Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

Scopri la creazione di tessuti vascolarizzati in vivo mediante anastomosi microchirurgica arterovenosa in modelli murini. Questa tecnica avanzata consente la rigenerazione di organi e la riparazione di difetti tessutali con approvvigionamento intrinseco.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un

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