Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un In Vivo Camera ingegneria dei tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare uno spazio in cui il tessuto possa crescere ed espandersi in concomitanza con lo sviluppo di un robusto afflusso di sangue, portando infine alla generazione di un blocco di tessuto vascolarizzato, grande e tridimensionale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ingegneria del tessuto vascolarizzato per scopi ricostruttivi, nonché per la sostituzione e la riparazione di organi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto appena generato è intrinsecamente alimentato dalla propria rete vascolare senza dover fare affidamento sulla diffusione dall'ambiente per la sopravvivenza.

A dimostrare la procedura saranno Sue McKay e Liliana Pepe. Anestetizzare un ratto del peso di almeno 250 grammi e valutare la profondità dell'anestesia usando un pizzico per le dita dei piedi. Se il ratto non risponde, mantenere la sedazione utilizzando isoflurano al 2% durante tutta la procedura.

Quindi, applica un unguento epsomico sugli occhi. Quindi, con il ratto supino, utilizzare rasoi elettrici per radere l'inguine e rimuovere i peli con una garza inumidita. Quindi, pulire i siti chirurgici con una soluzione di clorexidina contenente il 70% di etanolo.

Infine, drappeggiare l'animale con asciugamani sterili e procedere con l'intervento. Utilizzando una lama numero 15, praticare un'incisione cutanea lunga quattro centimetri nell'inguine sinistro parallela al legamento inguinale. Successivamente, tagliare circonferenzialmente con le forbici il cuscinetto adiposo inguinale esposto, lasciandolo attaccato al suo peduncolo vascolare, in base ai vasi epigastrici.

Ora, con le microforbici, libera le aderenze filmose del tessuto connettivo tra la parete addominale e i vasi femorali sottostanti. Quindi, posizionare un divaricatore sulla parete addominale e tirarlo medialmente per esporre il legamento inguinale e l'intera lunghezza dei vasi femorali. Successivamente, utilizzando micro-pinze e forbici curve, sezionare la vena epigastrica e isolarla dal grasso circostante.

Questa vena funzionerà come un legame. Procedere aprendo la guaina perivascolare contenente i vasi femorali e il nervo. Aprilo fino in fondo dal legamento inguinale alla sua biforcazione distale al ramo epigastrico.

A questo punto, e durante l'intera procedura, è fondamentale maneggiare delicatamente i vasi femorali. Il loro danno può provocare trombosi e fallimento dell'intero esperimento. Quindi, utilizzando una micro-pinza, prelevare la vena femorale dalla sua avventizia e separarla delicatamente dai tessuti circostanti e dall'arteria di accompagnamento.

Durante questo passaggio, non afferrare l'intero spessore della parete venosa, che potrebbe causare traumi all'intima, rendendo così la vena soggetta a trombosi. Sempre durante questo passaggio, legare i rami laterali con sutura di nylon 10-0, oppure coagularli con un coagulatore bipolare. Con la vena femorale completamente libera, legarla prossimalmente e distalmente con suture di seta 4-0 per ottenere un innesto venoso lungo almeno 10 millimetri, che includa circa mezzo centimetro di lunghezza del ramo epigastrico.

Il ramo funziona come un cavo di corda per tenere aperto l'anello nella camera. Quindi, taglia l'avventizia dalle estremità dell'innesto. Se necessario, questa fase può essere posticipata a prima delle anastomosi microchirurgiche.

Terminare la preparazione dell'innesto venoso lavandolo con una soluzione salina eparinizzata e lasciandolo riposare caricato con soluzione salina eparinzzata. Quindi, chiudere la ferita utilizzando una sutura di seta 4-0 a corsa continua e due o tre punti interrotti semplici aggiuntivi. Per iniziare, esporre il legamento inguinale e l'intera lunghezza del vaso femorale dell'arto controlaterale come precedentemente dimostrato.

Quindi, utilizzando una micro-pinza, sezionare e isolare sia l'arteria epigastrica che la vena dal cuscinetto adiposo circostante. Sii delicato quando estrai il fazzoletto dai vasi. Continuate prelevando l'arteria femorale dalla sua avventizia e liberandola dai tessuti circostanti.

In questo processo, legare o coagulare i rami laterali dell'arteria. Quindi, posizionare un morsetto prossimalmente sia sull'arteria femorale che sulla vena. Ora, utilizzando la sutura di seta 4-0, legare l'arteria femorale e la vena distalmente all'emergere dei vasi epigastrici.

Ora posiziona uno sfondo di contrasto in plastica sterile sotto i recipienti e usa una microforbice affilata e diritta per tagliare trasversalmente ogni recipiente. Una volta tagliati, sciacquare energicamente i vasi con generose quantità di soluzione salina eparinizzata fino a quando tutto il sangue non è stato rimosso dal lume. Ora portare l'innesto venoso in campo operatorio.

Posizionare l'innesto venoso in modo che l'estremità prossimale dell'innesto venoso sia pronta per essere anastomizzata alla vena femorale ricevente e l'estremità distale all'arteria femorale ricevente. Ciò consentirà al sangue di fluire dal lato arterioso a quello venoso senza resistenza da parte delle valvole all'interno dell'innesto venoso. Assicurarsi che i vasi femorali e l'innesto venoso rimangano nella loro posizione naturale senza torsioni.

Utilizzando una sutura in nylon 10-0, eseguire l'anastomosi chirurgica su entrambi i lati. Una buona anastomosi microchirurgica e atraumatica è fondamentale. Il danneggiamento dell'intima vaso, l'essiccazione dei vasi o i punti di sutura posizionati in modo errato rendono il sito anastomotico soggetto alla formazione di trombi.

Quindi, verificare la presenza di perdite in entrambi i siti anastomotici. Risolvi le piccole perdite, che sembrano sangue non pulsante che fuoriesce dal sito anastomotico, posizionando un piccolo pezzo di grasso o una spugna sopra e comprimendo delicatamente per 5-10 minuti. Le perdite pulsanti più grandi che inondano rapidamente l'intero campo avranno bisogno di punti aggiuntivi.

Successivamente, controlla la pervietà dell'ansa arterovenosa. Una leggera occlusione dell'arteria femorale dovrebbe farla restringere. Al contrario, l'occlusione della vena femorale dovrebbe ingorgare l'ansa.

Posizionare ora la base della camera di ingegneria tissutale sotto l'ansa arterovenosa. Assicurati che l'anello poggi nella sua posizione naturale senza torsioni o attorcigliamenti. Quindi, con punti di sutura in nylon 6-0, fissare la base della camera al legamento inguinale e alla fascia muscolare sottostante.

Quindi, posizionare il coperchio sulla base della camera. Pizzica i rami epigastrici sotto il coperchio per mantenere l'anello in posizione. Quindi, chiudere la ferita utilizzando una sutura di seta 4-0 a corsa continua, più due o tre punti interrotti semplici aggiuntivi.

Infine, consentire all'animale di riprendersi dall'anestesia in una gabbia individuale e somministrare una singola dose di carprofene per via sottocutanea come analgesico. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico come prima. Due camere possono essere impiantate in un singolo ratto, una in ciascun inguine.

Quindi, isolare il vaso femorale come descritto in precedenza. Con l'arteria e la vena completamente liberate dai tessuti circostanti e i loro rami legati, portare la camera in campo operatorio. Quindi, posizionare ciascuno dei vasi femorali intatti nelle fessure corrispondenti della base della camera.

Assicurati che nessuno dei due sia attorcigliato o attorcigliato. Quindi, chiudere la camera attaccando il coperchio alla base. Quindi chiudere la ferita e lasciare che l'animale si riprenda come precedentemente descritto.

La creazione microchirurgica di camere di ingegneria tissutale è stata eseguita come descritto. Vari tipi di tessuto sono stati ingegnerizzati con successo utilizzando la camera vascolarizzata in vivo, che include tessuto cardiaco con cardiomiociti di ratto neonatale, tessuto muscolare con mioblasti scheletrici di ratto e tessuto adiposo con idrogel derivato dalla matrice extracellulare del tessuto adiposo. Il sistema stereologico consente una quantificazione imparziale del volume specifico del tessuto.

Ad esempio, le cellule endoteliali colorate con lectina nelle sezioni trasversali sono state utilizzate per stimare i volumi vascolari. Dopo l'impianto in vivo di cellule marcate con coloranti fluorescenti, il loro destino può essere tracciato. Ad esempio, cardiomiociti di ratto neonatale marcati con il colorante i sono stati rilevati nei costrutti tissutali tre giorni dopo l'impianto.

In alternativa, gli anticorpi specie-specifici possono essere utilizzati per identificare le cellule impiantate negli studi di xenotransplanazione. Ad esempio, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo impiantate in ratti immunocompromessi potrebbero essere identificate nel tessuto raccolto dalla camera. Una volta padroneggiati, la camera a flusso continuo e l'ansa arterovenosa possono essere impiantati rispettivamente in circa 20 e 90 minuti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere la sterilità in ogni momento e adottare le misure necessarie in caso di contaminazione. Non dimenticare che la manipolazione delicata dei vasi sanguigni e l'anastomosi microchirurgica atraumatica sono fondamentali per garantire il successo. In questo senso, raccomandiamo una formazione microchirurgica di base prima di tentare questa procedura, in particolare per la costruzione dell'ansa arterovenosa.