Name: Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Impara a isolare i cromosomi lampbrush giganti da ovociti di anfibi vivi. Questa tecnica consente di studiare la struttura cromosomica e l'attività trascrizionale con microscopia a luce convenzionale.

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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01 GM33397. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. J.G.G. è professore di genetica dello sviluppo presso l'American Cancer Society.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le prime osservazioni di LBCs &quot;vivente&quot; GVS-isolato mano di rane e salamandre sono state fatte quasi 80 anni fa dal biologo americano William Duryee, 19 prima dell&#39;introduzione del contrasto di fase e microscopia DIC, prima di immunostaining fluorescenti, e prima di FISH. I vantaggi di LBCs per indagare i dettagli della struttura cromosomica e trascrizione a livello singolo gene sviluppo necessario di tecniche per fissare la LBCs di vetrini, di risolverli in modo realistico, e di applicare tecni...

La maggior parte dei vertebrati, con la notevole eccezione di marsupiali e mammiferi placentati, producono grandi uova Yolky. Nonostante la loro talvolta enormi dimensioni, queste uova sono cellule singole che raggiungono la loro dimensione finale, pur nelle ovaie della femmina. Uova ovariche sono chiamati ovociti e ogni genere contiene un singolo nucleo gigante, conosciuta sin dagli inizi del 19 ° secolo come il vescicola germinale o semplicemente GV. 1 ovociti delle rane di laboratorio comuni, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, raggiungono un diametro massimo di 1,2 mm e 0,8 millimetri, rispettivamente (Figura 1). I GVs da ovociti maturi di questi due rane sono 0,3 - 0,4 mm di diametro (figure 2, 3). Salamandre in genere hanno ovociti ancora più grandi e GVs. Ovociti completamente maturi del axolotl messicano, Ambystoma mexicanum, sono più di 2 mm di diametro e GV è di circa 0,5 mm. Così, questi nuclei sono facilmente visibili ad occhio nudo e lattinaessere manipolata in molti modi che sono impossibili con i nuclei di cellule somatiche tipiche. Altrettanto notevole è il gigantismo dei cromosomi all&#39;interno del GV, un fatto riconosciuto già alla fine del 19 ° secolo. Cromosomi individuali di Ambystoma e altre salamandre possono essere fino a 1 mm di lunghezza (Figure 4, 5). Quelli di Xenopus sono notevoli più piccolo, anche se con lunghezze fino a 100 pm o più, nano cromosomi tipici somatici di maggior parte degli organismi. Una caratteristica importante dei cromosomi degli ovociti è la loro straordinaria attività trascrizionale, che porta ad una delle loro più caratteristici morfologiche - centinaia di loop laterali accoppiati (Figura 5). Ogni ciclo è composto da una o poche unità di trascrizione che sintetizzano attivamente RNA. Le anse conferiscono ovocita cromosomi uno fuzzy aspetto, che ha portato il nome di cromosoma &quot;lampbrush&quot; dopo la loro superficialesomiglianza con le spazzole utilizzate in passato per pulire camini lampada a cherosene. 2 L&#39;obiettivo di questo lavoro è l&#39;uso di GVs isolati per studiare LBCs e organelli nucleari (nucleoli, corpi istone locus, e macchie). Due tecniche piuttosto diverse saranno descritte. Nel primo, la tecnica più comune, GVs sono isolati in una soluzione salina con pinze del gioielliere, brevemente risciacquato per rimuovere tuorlo aderenti, e l&#39;involucro nucleare viene rimosso, ancora una volta con una pinza del gioielliere. I contenuti gelatinosi, contenenti i LBCs e organelli nucleari, sono autorizzati a stabilirsi su un vetrino da microscopio in vetro o coprioggetto. Tali preparati possono essere esaminati direttamente dal contrasto di fase o microscopia DIC. In alternativa, preparati possono essere centrifugati per fissare le LBCs e organelli alla diapositiva o coprioggetto. Tali preparati possono essere trattati per l&#39;analisi molecolare dettagliata degli acidi nucleici e proteine, in primo luogo mediante immunofluorescenza e fluorescent ibridazione in situ (FISH). 3-7 Una seconda tecnica prevede l&#39;isolamento del GV in olio minerale. 8 GVs olio isolato rimangono trascrizionalmente attivo per molte ore e sono potenzialmente utili per gli studi dove si vuole i contenuti nucleari di essere il più realistico possibile. 9,10 Poiché l&#39;indice di rifrazione del &quot;SAP&quot; nucleare è vicino a quello dei LBCs e altri organelli nucleari (Figura 3), tecniche microscopiche può essere una sfida con GVs olio isolato. Infine, a causa delle loro dimensioni e facilità di manipolazione, GVs sono materiale ideale per studi sulla membrana nucleare. Il complesso del poro nucleare è stata descritta da elettroni studi microscopici sulle buste GV anfibi 11 e osservazioni SuperResolution più recenti hanno utilizzato lo stesso materiale. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide (grado reattivo, cristallino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Nonostante le avvertenze in molti protocolli, una soluzione concentrata può essere conservata indefinitamente a RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesolfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>A volte indicato come MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 suture</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (cera di paraffina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>p-Fenilendiammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Negozio</td><td></td> di alimentari <td>Commerciale La gelatina Knox funziona bene</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura Gold Seal&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0,16 - 0,19 mm di spessore)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>Questi vetrini coprioggetti sono lo spessore consigliato per la microscopia a superrisoluzione</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Olio di paraffina (leggero)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>Per l'isolamento di GV in olio</td></tr><tr><td>Adesivo in situ PCR e camere di ibridazione (25 &; micro; L)</td>Camere di scorrimento <td>BioRad</td><td>Frame-Seal #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Isolatori in silicone</td><td>Grace-Biolabs</td><td>seleziona dal catalogo</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin barattoli e piastre di colorazione</td><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>seleziona dal catalogo</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolamento di gigante lampbrush cromosomi da living ovociti di rane e salamandre

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Descriviamo i metodi per lo studio dei giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi (LBCs) in ovocita o uovo posata, di rane e salamandre. LBCs individuali possono essere fino a 1 mm di lunghezza e risiedere in un nucleo gigantesca, per sé fino a 0,5 mm di diametro. Le grandi dimensioni dei cromosomi permette osservazioni ineguagliabile geni attivi di microscopia ottica luce, ma allo stesso tempo tecniche speciali sono necessari per isolare il nucleo, la rimozione della membrana nucleare, e diffondere i cromosomi su un vetrino da microscopio. Il nucleo di ovociti, detto anche germinale vescicole (GV), è isolato in un mezzo che permette di gelificazione parziale della actina nucleare e preserva la delicata struttura dei LBCs. Questa fase viene effettuata manualmente sotto un microscopio da dissezione con pinze del gioielliere. Successivamente, l&#39;involucro nucleare viene rimosso, sempre manualmente con le pinze del gioielliere. I contenuti nucleari sono rapidamente trasferiti in un mezzo che VerniceRSES il gel actina e permette ai LBCs intatti di stabilirsi su un vetrino da microscopio. A questo punto i LBCs e altri organelli nucleari possono essere visualizzati da contrasto di fase o microscopio a contrasto di interferenza differenziale, anche se i dettagli più fini sono oscurati da moto browniano. Per l&#39;alta risoluzione di osservazione microscopica o analisi molecolare, tutta la preparazione viene centrifugato per fissare saldamente le LBCs delicati alla diapositiva. Una breve fissazione in paraformaldeide è poi seguita da immunofluorescenza colorazione o ibridazione in situ. LBCs sono in uno stato trascrizionalmente attivo e le loro enormi dimensioni permette l&#39;analisi molecolare a livello di singolo gene utilizzando confocale o la microscopia super-risoluzione.

Per esaminare giganti cromosoma a spazzola si comincia isolando ovociti da una rana o di salamandra. La figura 1 mostra un gruppo di oociti maturi in una soluzione salina tamponata dopo la rimozione dal ovaio della rana, Xenopus. Tali ovociti rimangono in buone condizioni per giorni a temperatura ambiente. Il nucleo (o vescicola germinale) sono eliminati da un ovocita con una pinza di gioielli, sia in soluzione salina (Figura 2) o in olio <stron...

Vi presentiamo semplici tecniche per isolare giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi da ovociti di rane e salamandre vivono. Descriviamo come osservare questi cromosomi &quot;vivo&quot; di contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale, e come risolverli per fluorescente ibridazione in situ o di immunofluorescenza colorazione.

Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il nucleo gigante, o vescicola germinale, da un oocita di anfibio e dispiegare i cromosomi a spazzola, insieme ad altri organelli nucleari, su un vetrino per microscopia al fine di eseguire immunomarcatura, ibridazione in citu e altre tecniche molecolari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla struttura di base di cromosomi, nucleoli e altri organelli nucleari, nonché sui dettagli molecolari della trascrizione, dello splicing e dell'esportazione dell'RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è la facilità con cui è possibile esaminare la struttura cromosomica e la trascrizione mediante microscopia ottica convenzionale, utilizzando immunofluorescenza, ibridazione in citu e altre tecniche molecolari.La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Zehra Nizami, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Dopo aver preparato tutte le soluzioni necessarie, assemblare vetrini con pozzetti, composti da vetrini di vetro rivestiti ai quali sono stati fissati pozzetti di plastica con paraffina, come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, raccogliere il tessuto ovarico precedentemente o

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