Name: Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Impara a isolare i cromosomi lampbrush giganti da ovociti di anfibi vivi. Questa tecnica consente di studiare la struttura cromosomica e l'attività trascrizionale con microscopia a luce convenzionale.

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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01 GM33397. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. J.G.G. è professore di genetica dello sviluppo presso l'American Cancer Society.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le prime osservazioni di LBCs &quot;vivente&quot; GVS-isolato mano di rane e salamandre sono state fatte quasi 80 anni fa dal biologo americano William Duryee, 19 prima dell&#39;introduzione del contrasto di fase e microscopia DIC, prima di immunostaining fluorescenti, e prima di FISH. I vantaggi di LBCs per indagare i dettagli della struttura cromosomica e trascrizione a livello singolo gene sviluppo necessario di tecniche per fissare la LBCs di vetrini, di risolverli in modo realistico, e di applicare tecni...

La maggior parte dei vertebrati, con la notevole eccezione di marsupiali e mammiferi placentati, producono grandi uova Yolky. Nonostante la loro talvolta enormi dimensioni, queste uova sono cellule singole che raggiungono la loro dimensione finale, pur nelle ovaie della femmina. Uova ovariche sono chiamati ovociti e ogni genere contiene un singolo nucleo gigante, conosciuta sin dagli inizi del 19 ° secolo come il vescicola germinale o semplicemente GV. 1 ovociti delle rane di laboratorio comuni, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, raggiungono un diametro massimo di 1,2 mm e 0,8 millimetri, rispettivamente (Figura 1). I GVs da ovociti maturi di questi due rane sono 0,3 - 0,4 mm di diametro (figure 2, 3). Salamandre in genere hanno ovociti ancora più grandi e GVs. Ovociti completamente maturi del axolotl messicano, Ambystoma mexicanum, sono più di 2 mm di diametro e GV è di circa 0,5 mm. Così, questi nuclei sono facilmente visibili ad occhio nudo e lattinaessere manipolata in molti modi che sono impossibili con i nuclei di cellule somatiche tipiche. Altrettanto notevole è il gigantismo dei cromosomi all&#39;interno del GV, un fatto riconosciuto già alla fine del 19 ° secolo. Cromosomi individuali di Ambystoma e altre salamandre possono essere fino a 1 mm di lunghezza (Figure 4, 5). Quelli di Xenopus sono notevoli più piccolo, anche se con lunghezze fino a 100 pm o più, nano cromosomi tipici somatici di maggior parte degli organismi. Una caratteristica importante dei cromosomi degli ovociti è la loro straordinaria attività trascrizionale, che porta ad una delle loro più caratteristici morfologiche - centinaia di loop laterali accoppiati (Figura 5). Ogni ciclo è composto da una o poche unità di trascrizione che sintetizzano attivamente RNA. Le anse conferiscono ovocita cromosomi uno fuzzy aspetto, che ha portato il nome di cromosoma &quot;lampbrush&quot; dopo la loro superficialesomiglianza con le spazzole utilizzate in passato per pulire camini lampada a cherosene. 2 L&#39;obiettivo di questo lavoro è l&#39;uso di GVs isolati per studiare LBCs e organelli nucleari (nucleoli, corpi istone locus, e macchie). Due tecniche piuttosto diverse saranno descritte. Nel primo, la tecnica più comune, GVs sono isolati in una soluzione salina con pinze del gioielliere, brevemente risciacquato per rimuovere tuorlo aderenti, e l&#39;involucro nucleare viene rimosso, ancora una volta con una pinza del gioielliere. I contenuti gelatinosi, contenenti i LBCs e organelli nucleari, sono autorizzati a stabilirsi su un vetrino da microscopio in vetro o coprioggetto. Tali preparati possono essere esaminati direttamente dal contrasto di fase o microscopia DIC. In alternativa, preparati possono essere centrifugati per fissare le LBCs e organelli alla diapositiva o coprioggetto. Tali preparati possono essere trattati per l&#39;analisi molecolare dettagliata degli acidi nucleici e proteine, in primo luogo mediante immunofluorescenza e fluorescent ibridazione in situ (FISH). 3-7 Una seconda tecnica prevede l&#39;isolamento del GV in olio minerale. 8 GVs olio isolato rimangono trascrizionalmente attivo per molte ore e sono potenzialmente utili per gli studi dove si vuole i contenuti nucleari di essere il più realistico possibile. 9,10 Poiché l&#39;indice di rifrazione del &quot;SAP&quot; nucleare è vicino a quello dei LBCs e altri organelli nucleari (Figura 3), tecniche microscopiche può essere una sfida con GVs olio isolato. Infine, a causa delle loro dimensioni e facilità di manipolazione, GVs sono materiale ideale per studi sulla membrana nucleare. Il complesso del poro nucleare è stata descritta da elettroni studi microscopici sulle buste GV anfibi 11 e osservazioni SuperResolution più recenti hanno utilizzato lo stesso materiale. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide (grado reattivo, cristallino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Nonostante le avvertenze in molti protocolli, una soluzione concentrata può essere conservata indefinitamente a RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesolfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>A volte indicato come MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 suture</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (cera di paraffina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>p-Fenilendiammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Negozio</td><td></td> di alimentari <td>Commerciale La gelatina Knox funziona bene</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura Gold Seal&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0,16 - 0,19 mm di spessore)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>Questi vetrini coprioggetti sono lo spessore consigliato per la microscopia a superrisoluzione</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Olio di paraffina (leggero)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>Per l'isolamento di GV in olio</td></tr><tr><td>Adesivo in situ PCR e camere di ibridazione (25 &; micro; L)</td>Camere di scorrimento <td>BioRad</td><td>Frame-Seal #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Isolatori in silicone</td><td>Grace-Biolabs</td><td>seleziona dal catalogo</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin barattoli e piastre di colorazione</td><td>Scienze di microscopia elettronica</td><td>seleziona dal catalogo</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolamento di gigante lampbrush cromosomi da living ovociti di rane e salamandre

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Descriviamo i metodi per lo studio dei giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi (LBCs) in ovocita o uovo posata, di rane e salamandre. LBCs individuali possono essere fino a 1 mm di lunghezza e risiedere in un nucleo gigantesca, per sé fino a 0,5 mm di diametro. Le grandi dimensioni dei cromosomi permette osservazioni ineguagliabile geni attivi di microscopia ottica luce, ma allo stesso tempo tecniche speciali sono necessari per isolare il nucleo, la rimozione della membrana nucleare, e diffondere i cromosomi su un vetrino da microscopio. Il nucleo di ovociti, detto anche germinale vescicole (GV), è isolato in un mezzo che permette di gelificazione parziale della actina nucleare e preserva la delicata struttura dei LBCs. Questa fase viene effettuata manualmente sotto un microscopio da dissezione con pinze del gioielliere. Successivamente, l&#39;involucro nucleare viene rimosso, sempre manualmente con le pinze del gioielliere. I contenuti nucleari sono rapidamente trasferiti in un mezzo che VerniceRSES il gel actina e permette ai LBCs intatti di stabilirsi su un vetrino da microscopio. A questo punto i LBCs e altri organelli nucleari possono essere visualizzati da contrasto di fase o microscopio a contrasto di interferenza differenziale, anche se i dettagli più fini sono oscurati da moto browniano. Per l&#39;alta risoluzione di osservazione microscopica o analisi molecolare, tutta la preparazione viene centrifugato per fissare saldamente le LBCs delicati alla diapositiva. Una breve fissazione in paraformaldeide è poi seguita da immunofluorescenza colorazione o ibridazione in situ. LBCs sono in uno stato trascrizionalmente attivo e le loro enormi dimensioni permette l&#39;analisi molecolare a livello di singolo gene utilizzando confocale o la microscopia super-risoluzione.

Per esaminare giganti cromosoma a spazzola si comincia isolando ovociti da una rana o di salamandra. La figura 1 mostra un gruppo di oociti maturi in una soluzione salina tamponata dopo la rimozione dal ovaio della rana, Xenopus. Tali ovociti rimangono in buone condizioni per giorni a temperatura ambiente. Il nucleo (o vescicola germinale) sono eliminati da un ovocita con una pinza di gioielli, sia in soluzione salina (Figura 2) o in olio <stron...

Vi presentiamo semplici tecniche per isolare giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi da ovociti di rane e salamandre vivono. Descriviamo come osservare questi cromosomi &quot;vivo&quot; di contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale, e come risolverli per fluorescente ibridazione in situ o di immunofluorescenza colorazione.

Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il nucleo gigante, o vescicola germinale, da un oocita di anfibio e dispiegare i cromosomi a spazzola, insieme ad altri organelli nucleari, su un vetrino per microscopia al fine di eseguire immunomarcatura, ibridazione in citu e altre tecniche molecolari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla struttura di base di cromosomi, nucleoli e altri organelli nucleari, nonché sui dettagli molecolari della trascrizione, dello splicing e dell'esportazione dell'RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è la facilità con cui è possibile esaminare la struttura cromosomica e la trascrizione mediante microscopia ottica convenzionale, utilizzando immunofluorescenza, ibridazione in citu e altre tecniche molecolari.La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Zehra Nizami, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Dopo aver preparato tutte le soluzioni necessarie, assemblare vetrini con pozzetti, composti da vetrini di vetro rivestiti ai quali sono stati fissati pozzetti di plastica con paraffina, come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, raccogliere il tessuto ovarico precedentemente ottenuto da una femmina adulta di rana o di salamandra e riempire una piccola capsula di Petri con mezzo di coltura per ovociti.Procedere posizionando una porzione del tessuto isolato, contenente circa da 10 a 20 ovociti, in questa piastra. Successivamente, identificare un singolo ovocita e utilizzare due paia di pinzette da gioielliere per recidere il peduncolo che lo collega alla parete ovarica. Una volta liberato, trasferire l'ovocita in una nuova capsula di Petri contenente mezzo di isolamento per la vescicola germinale, o GV.Sotto basso ingrandimento, individuare il polo animale dell'ovocita, riconoscibile per la sua colorazione scura. Quindi utilizzare una pinzetta per praticare un foro di grandi dimensioni vicino al polo animale e procedere a espellere delicatamente il nucleo trasparente dell'ovocita, noto anche come GV. Successivamente, allontanare il GV dal tuorlo eventualmente espulso insieme. Per rimuovere il tuorlo che rimane fortemente aderente, aspirare il nucleo dentro e fuori da una pipetta con una punta dal diametro leggermente superiore a quello del GV. Dopo aver raccolto il GV di una rana, trasferirlo immediatamente nel mezzo di dispersione per prevenire l'indurimento nucleare, che potrebbe interferire con i passaggi successivi.Successivamente, utilizzando due paia di pinzette, afferrare l'involucro nucleare in prossimit&agrave; della parte superiore della GV, avendo cura di non premere verso il basso. Mentre si mantiene la presa sull'involucro, allontanare lentamente le due pinzette e attendere l'espulsione del contenuto nucleare. Per raccogliere questi contenuti, preparare innanzitutto una pipetta regolabile da 20 microlitri con punta tagliata, come descritto nel protocollo testuale.Quindi, prelevare dalla piastra cinque microlitri di liquido disperdente seguiti da cinque microlitri della soluzione contenente il materiale del GV. Una volta raccolti questi contenuti, trasferirli su un'immersione riempita con soluzione disperdente. Assicurarsi che il liquido nell'immersione presenti una superficie convessa, al fine di evitare l'intrappolamento di bolle nei passaggi successivi.Successivamente, posizionare un coprioggetto da 18 millimetri sopra la pozzetta e inserire il vetrino assemblato in una camera umida per 10-60 minuti. Durante questo periodo, ci si aspetta che il gel nucleare si disperda lentamente, in modo che i cromosomi e gli organelli nucleari si dispongano sulla superficie del vetro. Dopo aver rimosso un nucleo da un oocita di salamandra, lasciarlo nel mezzo di isolamento.Si noti che le Vg delle salamandre, a differenza di quelle delle specie di rane utilizzate qui, non induriranno eccessivamente in questa soluzione. Rimuovere l'involucro nucleare dalla Vg della salamandra utilizzando la stessa tecnica basata sulle pinzette descritta per le rane. Successivamente, raccogliere il contenuto nucleare leggermente gelificato con una pipetta avente la punta tagliata ed trasferire il gel in una capsula di Petri contenente soluzione disperdente.Risciacquare rapidamente la pipetta nella soluzione disperdente e utilizzarla per raccogliere il gel nucleare. Quindi introdurre il gel in un vetrino portaoggetti, aggiungere un coprioggetti e lasciare che il gel si disperda come descritto in precedenza. Successivamente, utilizzare il contrasto di fase per osservare il contenuto nucleare e identificare i cromosomi a spazzola, abbreviati come LBCs, in base alle loro grandi dimensioni e ai loop laterali appaiati.Dopo aver verificato che le LBC siano integre, preparare il vetrino per la centrifugazione posizionando un pezzo di carta filtrante sul cover slip. Quindi premere verso il basso per rimuovere il liquido in eccesso dalla camera. Successivamente, aggiungere vaselina a ciascun bordo del cover slip.Riscaldare una bacchetta metallica a circa 70-80 gradi Celsius e utilizzarla per sciogliere la gelatina e sigillare il vetrino coprioggetto sul plastico sottostante. Ripetere questa procedura per altri vetrini con LBC di buona qualità. Una volta fissati tutti i vetrini coprioggetto, posizionare i vetrini nei portaportanti per la centrifugazione e assicurarsi che i portaportanti opposti siano bilanciati.Utilizzando la funzione di avvio lento, centrifugare i vetrini come descritto nel testo usando portavetrini appositamente costruiti. In alternativa, si può utilizzare una centrifuga da banco standard, in cui i vetrini vengono fissati con del nastro adesivo su una piastra e fatti ruotare. Per preparare il contenuto nucleare per immunomarcatura o ibridazione in situ, rimuovere innanzitutto il sigillo temporaneo di vaselina con una lametta, quindi inserire il vetrino nel portaoggetti di un contenitore standard per la colorazione dei vetrini.Successivamente, aggiungere una quantità sufficiente di paraformaldeide per coprire i vetrini. Dopo l'immersione, utilizzare pinzette non taglienti per rimuovere e scartare ciascun coprioggetto. Lasciare i vetrini nel fissativo per 15-30 minuti.Dopo la fissazione, posizionare un vetrino in una vaschetta per colorazione contenente PBS freddo di ghiaccio. Inserire quindi una lametta affilata al bordo del quadrato di plastica e staccare delicatamente questa camera di plastica. Una volta ripetuto questo procedimento per tutti i vetrini, procedere con la colorazione come descritto nel protocollo testuale.Nell'immagine ottenuta con illuminazione in campo scuro sono mostrati i contenuti nucleari di un singolo GV di axolotl in profase della prima divisione meiotica, raccolti e preparati utilizzando il protocollo descritto. Sono evidenti 14 grandi cromosomi a bracci laterali (LBC) appaiati, così come nucleoli amplificati. Una colorazione aggiuntiva di questo preparato, effettuata con un anticorpo contro l'RNA polimerasi II fosforilata, mostrata qui in verde, rivela la localizzazione dei corpi del locus degli istoni e fornisce inoltre informazioni sull'intensa attività trascrizionale di questi cromosomi dell'ovocita.Un ingrandimento maggiore di un singolo cromosoma a fibre laterali dell'axolotl, in questo caso colorato in verde per l'RNA polimerasi e in blu per il DNA, mostra la caratteristica morfologica più peculiare di questi cromosomi. Centinaia di fibre laterali appaiate, ognuna delle quali rappresenta almeno un'unità di trascrizione attivamente impegnata nella sintesi di RNA. Il confronto con un cromosoma a fibre laterali di rospo, colorato in modo analogo e osservato allo stesso ingrandimento, evidenzia la notevole differenza di dimensioni tra i cromosomi di rospo e di salamandra, una differenza che si correla al contenuto totale di DNA nei genomi delle specie utilizzate.Tuttavia, anche nel cromosoma della rana, le singole unità trascrizionali possono essere osservate come loop di cromatina che si estendono lateralmente dall'asse cromosomico, come mostrato in questa immagine a maggiore ingrandimento. Anche gli oociti di pesci, uccelli, rettili e alcuni invertebrati contengono cromosomi a spazzola giganti. In modo notevole, i cromosomi a spazzola si formano quando teste di spermatozoi di altri organismi, inclusi gli esseri umani, vengono iniettate nella vescicola germinale degli anfibi.Una volta padroneggiata la tecnica, un lotto di preparati di AGV può essere preparato in un'ora e successivamente centrifugato e fissato nell'arco di altre una o due ore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare un GV e stendere i cromosomi a spazzola per ulteriori studi mediante sonde molecolari.

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I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Impara a isolare i cromosomi lampbrush giganti da ovociti di anfibi vivi. Questa tecnica consente di studiare la struttura cromosomica e l'attività trascrizionale con microscopia a luce convenzionale.

Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre

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