Una strategia rapido per l'isolamento di nuovi Faustoviruses da campioni ambientali Utilizzando

L'obiettivo generale di questa nuova strategia di isolamento è ampliare il numero di nuovi ceppi virali isolati al fine di studiare il pan-genoma di questa nuova famiglia virale e comprendere meglio i loro ecosistemi e la potenziale patogenicità per l'uomo. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, aiutando i virologi di tutto il mondo interessati all'individuazione di virus giganti e in particolare dei Faustovirus. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nei nuovi miglioramenti apportati a diverse fasi, come la miscela di antibiotici e antifungini, il nuovo mezzo di privazione adattato per l'amoebo e l'uso della citometria a flusso per un rilevamento più rapido e sensibile della lisi. Dopo aver raccolto campioni di acqua sporca seguendo il protocollo descritto, preparare la cellula ospite, V. vermiformis, aggiungendo gli amoebe a un flacone da coltura cellulare da 75 centimetri quadrati con 30 millilitri di mezzo di coltura proteasi peptone estratto di lievito glucosio, o mezzo PYG, e incubare a 28 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare camere di conta per contare gli amoebe e, quando raggiungono una concentrazione compresa tra 5 × 10⁵ e 10⁶ cellule per millilitro, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 720 × g per 10 minuti.

Aspirare il soprannatante e utilizzare 30 millilitri di soluzione salina amoebica sterile di Page o PAS per risospendere il pellet di amoebi. Dopo aver lavato il pellet una seconda volta, utilizzare 30 millilitri di mezzo di digiuno, contenente un antibiotico e un antimicotico, per risospendere le cellule a una concentrazione di circa 10 alla sesta amoeba per millilitro. Il mezzo di digiuno permette alle amoebi di rimanere vive senza andare incontro a encistamento o moltiplicazione.

Successivamente, seminare 200 microlitri di ameba nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Poi, dopo aver agitato i campioni d'acqua al vortex per un minuto a temperatura ambiente, inoculare 25 microlitri di ciascun campione sulle cellule di ameba, lasciando due pozzetti senza campione come controlli negativi. Per evitare l'evaporazione, posizionare la piastra contenente la primocoltura in un sacchetto con una compressa umida e inserire la camera umidificata con la piastra in un incubatore a 30 gradi Celsius.

Trascorsi tre giorni dal primo innesto, effettuare il sottocoltura della piastra di primocoltura su una nuova piastra a 96 pozzetti contenente amebe, come appena illustrato, senza alcuna osservazione al microscopio. Incubare a 30 gradi Celsius per tre giorni. Successivamente, utilizzando il sottocoltura, inoculare una terza piastra come precedentemente descritto e incubare per due giorni.

Per rilevare la lisi nella piastra finale in co-coltura, accendere il citometro ed eseguire una pulizia e un risciacquo seguendo il protocollo del produttore per ridurre il rumore di fondo. Per effettuare un'acquisizione completamente automatizzata della durata di 40 minuti, avviare il campionatore ad alta produttività (HTS) per caricare automaticamente i campioni dalla piastra a 96 pozzetti seguendo il protocollo del produttore. Impostare i parametri dell'HTS come indicato di seguito: volume del campione di 150 microlitri, volume di miscelazione di 50 microlitri, velocità di miscelazione di 180, numero di cicli di miscelazione pari a 5, volume di lavaggio tra i campioni di 400 microlitri, velocità di flusso di 2,5 microlitri al secondo e numero di eventi registrati pari a 10.000. Fare clic su home per consentire all'HTS di individuare la piastra. Successivamente, valutare prima i pozzetti del controllo negativo contenenti le cellule amebiche ospiti, al fine di delimitare la popolazione amebica e determinare la percentuale cellulare in base alle loro caratteristiche fisiche. Assicurarsi di avere una popolazione amebica omogenea e una seconda popolazione con un numero inferiore di eventi corrispondente a detriti e rumore. Procedere quindi con il gating facendo clic su acquisisci campione.

Quindi, utilizzando la freccia, che definisce i gate, localizzare la popolazione di amoebi di interesse. Dopo aver effettuato il gating di almeno 10.000 eventi, fare clic su "run" per consentire all'HTS di eseguire automaticamente l'intera piastra. Eseguire l'acquisizione e l'analisi dei dati in base al parametro dimensionale di scattering in avanti e al parametro strutturale di scattering laterale. Per ulteriori dettagli, consultare il testo.

Dopo aver rilevato la lisi mediante citofluorimetria, pipettare le colture co-lytiche per sospendere gli amebe rimanenti. Dopo aver pipettato 50 microlitri di ogni campione su vetrini, sottoporre direttamente la sospensione a citocentrifugazione a 800 × g per 10 minuti.

Successivamente, utilizzare metanolo puro per fissare i vetrini, quindi lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, immergere i vetrini nella soluzione ESN tre volte per quattro secondi ciascuna, prima di posizionarli nell'azur blu per sei secondi. Infine, immergere i vetrini nel PBS per 45 secondi.

Lasciare asciugare le diapositive a temperatura ambiente prima di procedere all'osservazione. Per colorare nuove diapositive fissate con DAPI, pipettare 15 microlitri di DAPI sulle diapositive asciutte. Osservare le diapositive al microscopio ottico con un ingrandimento di 1000x per verificare la presenza di fabbriche virali.

Per eseguire la microscopia elettronica, depositare cinque microlitri del campione positivo su una griglia trattata al plasma, e incubare a temperatura ambiente per circa 20 minuti. Asciugare con attenzione la griglia, quindi aggiungere una piccola quantità di molibdato di ammonio all'1% e incubare per 10 secondi. Dopo aver rimosso con cura la goccia, lasciare asciugare la griglia per cinque minuti. Successivamente, impostare il microscopio elettronico a 200 chiloelettronvolt. Quindi, posizionare la griglia sul portagriglia e inserire il portagriglia nel microscopio. Fare clic sull'icona di panoramica del vuoto e verificare il livello di vuoto. Chiudere quindi le valvole, impostare una dimensione del spot pari a cinque e un ingrandimento di 25.000 prima di iniziare l'osservazione. Dopo aver individuato un virus gigante sullo schermo di acquisizione, utilizzare lo strumento di misura per determinarne le dimensioni.

Eseguire la biologia molecolare e il sequenziamento del genoma virale seguendo il protocollo indicato nel testo.

Questa figura mostra i risultati del rilevamento di due Faustovirus rispetto ai controlli negativi affidabili. Il controllo negativo per la lisi conteneva una popolazione di amebe all'86%. Al contrario, più del 60% delle amebe è stato lisato, con la percentuale più elevata di detriti nei campioni positivi.

Come mostrato qui, la colorazione con ESN e blu azur evidenzia i nuclei delle cellule di amebe non infette e infette, nonché la presenza di fabbriche virali all'interno delle cellule infette. La colorazione con DAPI conferma inoltre la presenza di fabbriche virali all'interno delle amebe. In queste immagini, la microscopia elettronica rivela la presenza di Faustovirus con l'aspetto tipico di un mega-virus costituito da un capside icosaedrico privo di fibrille e di dimensioni pari a 200 nanometri.

Dopo aver acquisito padronanza della tecnica e al termine della co-coltura, il rilevamento della lisi e la caratterizzazione del virus possono essere eseguiti in un'ora, se effettuati correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale controllare la vitalità delle amebe e verificare la presenza di eventuali contaminazioni. Al termine di questo protocollo, possono essere eseguiti altri metodi, come quelli di biologia molecolare mirati ai virus giganti, al fine di ottenere ulteriori informazioni, ad esempio sulla famiglia virale e/o sul genotipo.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia per esplorare questa famiglia virale, il loro specifico ospite e la loro potenziale patogenicità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare facilmente i virus giganti ampliando il numero e i tipi di campioni e scegliendo la migliore cellula ospite e le migliori condizioni di coltura. Non dimenticare che lavorare con virus potenzialmente patogeni per l'uomo può essere estremamente pericoloso, specialmente con campioni di acque reflue.

Pertanto, è sempre necessario adottare precauzioni come lavorare in laboratori di livello di sicurezza 2 (SB2) con condizioni sicure durante l'esecuzione di questa procedura.