La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di progettare un sistema di somministrazione in grado di fornire farmaci a piccole molecole come il siRNA al cervello. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della neurodegenerazione come: il siRNA è un'opzione terapeutica praticabile per le malattie da misfolding proteico? e Possiamo progettare un sistema affidabile di somministrazione di farmaci al cervello?

Il vantaggio principale della creazione di un sistema di somministrazione di farmaci liposomiali è che possiamo somministrare il nostro siRNA per via endovenosa o attraverso il flusso sanguigno piuttosto che direttamente attraverso il tessuto neuronale, il che provoca danni neuronali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnostica delle malattie neurodegenerative perché questa tecnica consente la somministrazione specifica attraverso la barriera emato-encefalica, in particolare ai neuroni che esprimono l'acetilcolina. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale poiché le iniezioni della vena della coda del topo sono difficili da imparare a causa delle piccole dimensioni della vena della coda del topo.

Inizia preparando un rapporto DOTAP / colesterolo uno a uno. Per una preparazione di liposomi di animali estranei, mescolare due nanomoli di DOTAP e due nanomoli di colesterolo in dieci millilitri di una soluzione uno-a-uno di cloroformio in metanolo. Quindi, evaporare nove millilitri della soluzione di cloroformio e metanolo utilizzando azoto gassoso.

Far evaporare l'ultimo millilitro di solvente in una cappa aspirante per una notte senza gas. Il giorno successivo, un sottile film lipidico dovrebbe essere visibile sul fondo del pallone. Scaldare sia questo pallone con il film lipidico che dieci millilitri di una soluzione di saccarosio al dieci percento a 55 gradi Celsius.

Quindi, pipettare lentamente la soluzione di saccarosio riscaldata sulla sottile pellicola lipidica mentre si agita delicatamente il pallone. Successivamente, assemblare un estrusore con filtri da un micron secondo le istruzioni del produttore. Quindi, aggiungere un millilitro della sospensione liposomica riscaldata a una delle siringhe sull'estrusore.

Quindi passare la sospensione tra le due siringhe 11 volte. Mantenendo la sospensione liposomica riscaldata per facilitare il dimensionamento, dimensionare i liposomi fino a 45 micron e un filtro da 2 micron Per generare grandi vescicole unilamellari, aggiungere 20 microlitri della sospensione di liposomi a quattro nanomoli a 200 microlitri di una soluzione di siRNA stock da 20 micromolari e incubare per dieci minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 80 microlitri di un ceppo da 500 micromolari di peptide mirato RVG-9R alla soluzione liposomica siRNA e incubare per dieci minuti a temperatura ambiente.

Preparare una sospensione di lipsomoe di animali estranei mescolando 2,2 nanomoli di DSPE o DOTAP in dieci millilitri di una soluzione da cloroformio a metanolo due a uno con 1,6 nanomoli di colesterolo e 2 nanomoli di DSPE peg. Successivamente, applicare azoto gassoso e, quando la maggior parte del solvente è evaporata, lasciare il pallone nella cappa per una notte. Quindi, aggiungi lentamente dieci millilitri di 1X PBS riscaldato a 75 gradi Celsius al sottile film lipidico.

Lasciare che i lipidi si reidratino a 75 gradi Celsius per almeno un'ora prima di dimensionare. Dopo aver dimensionato la sospensione liposomica utilizzando un estrusore come prima, pipettare 20 microlitri di ciascuna delle quattro sospensioni liposomiche nanomoli in aliquote monouso e liofilizzare per 30 minuti utilizzando un liofilizzatore da banco. Successivamente, aggiungere 1,4 microlitri di una soluzione 26,6 micromolari di protamina solfato a 200 microlitri di soluzione di siRNA madre da 20 micromolari e incubare per dieci minuti a temperatura ambiente per condensare il siRNA.

Dopo l'incubazione, reidratare le capsule DSPE con 201,4 microlitri di soluzione di protamina siRNA. Reidratare le capsule DOTAP con 200 microlitri di una soluzione di siRNA di origine animale estranea. Incubare ogni soluzione di siRNA del liposoma per dieci minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere dieci microlitri di una soluzione EDC da 60 millimolari a ciascuna provetta di liposomi reidratati. Quindi aggiungere dieci microlitri di soluzione sulfo-NHS da 150 millimolari alla soluzione di siRNA liposoma per entrambi i palets DOTAP e DSPE. Incubare per due ore a temperatura ambiente.

Infine, aggiungere 80 microlitri di 500 micromolari di peptide RVG-9R alla soluzione di reticolazione del liposoma siRNA e incubare per dieci minuti a temperatura ambiente. Dopo aver anestetizzato un topo utilizzando il due o tre percento di isoflurano in ossigeno, coprire gli occhi del topo con un unguento aptalmico e confermare l'anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita. Procedere solo se una reazione è assente.

Mentre mantieni l'anestesia, posiziona il mouse sulla schiena o sul lato per accedere alla vena caudale. Pulisci la coda con etanolo al 70% e poi usa una siringa da insulina calibro 26 per iniettare 300 microlitri di LSPC o capsule nella vena della coda. Iniziare l'iniezione distalmente e muoversi prossimalmente se la vena collassa o si rompe.

Metti il topo in una gabbia pulita fino a quando non mantiene la decubito sternale. Monitorare l'animale per diverse ore dopo l'iniezione per assicurarsi che l'anestesia svanisca e che non vi siano effetti negativi del trattamento. Dopo aver lasciato circolare gli LSPC o le capsule per almeno 24 ore e aver soppresso il topo, sezionare mezzo emisfero del cervello.

Quindi posizionare il semiemisfero e 2,5 millilitri di tampone fax su un filtro cellulare a maglie da 40 micron e utilizzare lo stantuffo di una siringa per premere il tessuto attraverso il filtro in una capsula di Petri. Sciacquare il colino cellulare e la capsula di Petri con altri 2,5 millilitri di tampone fax. Quindi trasferire la sospensione a cella singola in un tubo conico da 15 millilitri e posizionarla sul ghiaccio.

Quindi, pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare nella provetta della microcentrifuga e centrifugare per cinque minuti a 350 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone fax e centrifugare nuovamente. Quindi, aggiungere un altro millilitro di tampone fax e posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio. Ora, incubare le cellule in 100 microlitri di blocco Fc anti-topo di ratto in tampone fax per 30-60 minuti su ghiaccio.

Dopo la pellettatura e il lavaggio come prima, aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale primaria fluorescente e porre in ghiaccio per 30-60 minuti. Dopo un lavaggio finale, risospendere le cellule in un millilitro di tampone di lisi RVC per un minuto. Quindi, pellettare le celle.

Dopo aver eliminato il tampone, risospendere in un millilitro di tampone fax e metterlo sul ghiaccio. Le celle sono ora pronte per l'analisi via fax. I topi trattati con siRNA somministrati tramite LSPC hanno mostrato una significativa diminuzione dei livelli cellulari di proteina prionica rispetto a un controllo PBS che mostra mentre i livelli di proteina prionica cellulare.

I topi trattati con LSPC hanno mostrato livelli cellulari di proteina prionica vicini a quelli di un topo knock-out per la proteina prionica. In tre esperimenti, i topi trattati con LSPC hanno mostrato diminuzioni significative dei livelli cellulari di proteina prionica rispetto ai PBS durante i controlli di tipo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i liposomi possono essere conservati in frigorifero per diversi mesi, ma gli LSPC completi devono essere utilizzati entro 24 ore dall'assemblaggio.

Dopo il suo sviluppo, la generazione di LSPC o palets aprirà la strada ai ricercatori per esplorare più opzioni terapeutiche nel campo delle malattie neurodegenerative.