Name: Covalente legame degli anticorpi al cellulosa dischi di carta e le loro applicazioni a occhio nudo colorimetrici Immunoassays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Impara a immobilizzare anticorpi su dischi di carta cellulosa mediante ossidazione con periodato e reticolazione con glutaraldeide. Questo metodo consente lo sviluppo di immunoassay colorimetrici a basso costo per la diagnosi point-of-care.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Ministero dell'Istruzione, Singapore attraverso il Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).

1. L&#39;innesto Amine gruppi funzionali di cellulosa dischi di carta <ol><li> Preparare un pezzo di carta quadrato con una dimensione di 1 cm x 1 cm e 100 dischi di carta in carta di cellulosa di grado n ° 1 con un diametro di 6,0 mm (carta flusso medio filtro) utilizzando un punzone buco. </li><li> Per derivare gruppi -NH 2 sui dischi di carta, mescolare 1 ml APS e 10 ml di acetone in una bottiglia di vetro da 50 ml sotto cappa. Aggiungere dischi di carta alla miscela APS reagente appena preparato, e incubare per 5 ore con agitazione orbitale (200 rpm) a temperatura ambiente 32. Attenzione: maneggiare APS e acetone nella cappa. </li><li> Decantare la soluzione in eccesso dalla bottiglia di vetro da 50 ml in un contenitore di rifiuti organici. </li><li> Aggiungere 10 ml di acetone alla bottiglia di vetro, mescolare bene e decantare completamente di togliere qualunque APS reagito e altre impurità. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Stendere i dischi di carta sul tovagliolo di carta e mettere in un forno a 110 C ° per 3 ore. Lasciare che ildischi di carta per il raffreddamento. Conservare i dischi in una provetta da centrifuga da 50 ml a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FTIR) per verificare l&#39;innesto di gruppi amminici sulla carta quadrato di cellulosa, come descritto di seguito (Figura 3A). <ol><li> Accendere il computer e aprire lo strumento spettroscopia FTIR. </li><li> Aprire il software per la spettroscopia FTIR. </li><li> Vai a &#39;misura → Inizializzare&#39;. I rettangoli per &#39;BS: KBr&#39;, &#39;Lampada: a raggi infrarossi&#39; e &#39;Laser&#39; diventa verde quando l&#39;inizializzazione è terminata. </li><li> Scegliere &#39;dati&#39; al di sotto dei rettangoli, e selezionare &#39;% di trasmissione&#39;, &#39;Happ-Genzel&#39;, &#39;45&#39;, &#39;4.0&#39;, e &#39;minima: 400, Max: 4000&#39; per &#39;modalità di misura&#39;, &#39;Apodizzazione&#39;, &#39; No. di scansioni &#39;,&#39; Resolution &#39;, e&#39; Range (cm-1) &#39;. </li><li> Fare clic su &#39;misura&#39;. </li><li> Selezionare &#39;File di dati&#39; per i dati di fondo. Scrivigiù i commenti. </li><li> Fare clic su &#39;BKG&#39; per ottenere la linea di base per lo sfondo. </li><li> Fissare la carta quadrato sul supporto del campione pellicola. </li><li> Selezionare &#39;File di dati&#39; per i dati di esempio. Annotare i commenti. </li><li> Fare clic su &#39;campione&#39; per ottenere gli spettri per il campione. </li><li> Chiudere l&#39;applicazione della spettroscopia FTIR e spegnere il computer. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi precedenti (passi da 1.1 a 1.6) per preparare ammina-funzionalizzati grado No. 113 cellulosa carta quadrati e dischi (carta da filtro rapido flusso), e di ottenere gli spettri FTIR per il grado No. 113 quadrato di carta (Figura 3B). </li></ol> 2. immobilizzazione covalente di anticorpi su Amine-funzionalizzati dischi di carta di cellulosa <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig1.jpg" /> Figura 1. immobilizzazione covalente di anticorpi con due metodi differenti.Un. Gli anticorpi immobilizzati su dischi di carta di cellulosa di ammine-funzionalizzati per ossidazione periodato. I residui di carboidrati sono stati ossidati da periodato di sodio per la produzione di aldeide gruppi funzionali. Quindi, gli anticorpi ossidati sono stati caricati su dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzato. B. Gli anticorpi sono stati poi immobilizzate su dischi di carta di cellulosa ammine funzionalizzate attraverso glutaraldeide. L&#39;ammina funzionalizzato dischi di carta di cellulosa sono stati immersi in soluzione di glutaraldeide 0,05% per introdurre gruppi aldeidici ai dischi di carta. Dopo il lavaggio, gli anticorpi sono stati caricati sui aldeide funzionalizzato dischi di carta. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Immobilizzare anticorpi su dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzato mediante ossidazione con periodato (Figura 1A). <ol><li> Mescolare 1 ml di perioda di sodio 2,5 mMte con 2 ml di 0,1 mg / ml di coniglio anti-IgG umane-FITC e 7 ml di 100 mM pH 5,5 tampone acetato in una provetta da 1,5 ml, e incubare la miscela al buio per 30 min. NOTA: Seguire questa rapporto volume di preparare anticorpi più ossidate, se necessario. Modificare il rapporto volumetrico di ottimizzare la concentrazione di periodato di sodio e di coniglio anti-IgG umane-FITC. </li><li> Diluire la soluzione di anticorpi sopra con 30 ml di 50 mM tampone fosfato isotonico (PBS, pH 7,4) ad un volume finale di 40 microlitri. </li><li> Preparare tre dischi di carta filtro medio-flow ammina-funzionalizzati e tre dischi di carta veloce flusso di ammina-funzionalizzati (come descritto nella sezione 1). <ol><li> Carico 5 ml di periodato di sodio coniglio ossidato IgG anti-umane-FITC viene eseguito su ciascun disco di carta filtro di media portata e 8 ml viene eseguito su ciascun disco di carta filtro rapido flusso. Mantenere questi dischi di carta al buio per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavare ogni disco carta con 0,2 ml di lavaggio appassionatoer (50 mM tampone Tris 0,15 M NaCl e 0,05% di tensioattivo, pH 7,4). Ripetere il lavaggio tre volte. </li><li> Fotografare le immagini di fluorescenza attraverso un imager molecolare di fluorescenza per identificare la presenza di anticorpi su ciascun disco di carta di cellulosa 32. Utilizzare dischi di carta in bianco (trattati con la stessa concentrazione di anticorpi in assenza di periodato di sodio) come un controllo (Figura S1 alla Figura S3). NOTA: per l&#39;ottimizzazione sperimentale, modificare la concentrazione di un parametro che deve essere ottimizzato e fissare le concentrazioni degli altri parametri. Una alta intensità di fluorescenza aumenta la quantità di anticorpi di cattura che sono immobilizzati sui dischi di carta di cellulosa. </li></ol></li><li> Immobilizzare anticorpi su dischi di carta di cellulosa funzionalizzati amminici tramite glutaraldeide (Figura 1B). <ol><li> Aggiungere i tre dischi di carta filtro APS medio-flow trattati e le tre dischi di carta filtro fast-flow (described sezione 1) a 2 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) contenente 0,05% glutaraldeide per 1 ora, sotto agitazione orbitale a temperatura ambiente. Attenzione: maneggiare glutaraldeide nella cappa. </li><li> Mettere tre dischi ciascuno in due da 1,5 ml provette da centrifuga. Aggiungere 1 ml di acqua deionizzata (DI) a ciascuna provetta e agitare le provette per 10 sec. Rimuovere l&#39;acqua aspirando con una pipetta. Ripetere altre due volte per rimuovere eventuali glutaraldeide non reagito. </li><li> Carico 5 ml di 25 mg / ml di coniglio IgG-FITC (anticorpo di cattura) anti-umano su ogni disco carta da filtro medio-flow aldeidi-funzionalizzati, e aggiungere 8 ml su ogni disco carta da filtro rapido flusso di aldeide-funzionalizzati. Incubare al buio per circa 20 min a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 10 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) per ciascun disco di carta senza rimuovere gli anticorpi e incubare per 40 min per la reazione ammina aldeidi. </li><li> Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. ripetere lalavare due volte. </li><li> Fotografare le immagini di fluorescenza attraverso un imager molecolare di fluorescenza per verificare la presenza di anticorpi su ogni disco carta di cellulosa 33. Utilizzare dischi di carta bianco come controllo. NOTA: In figura 4, &#39;0&#39; indica il disco di carta bianca che è stata trattata con la stessa concentrazione di FITC-anticorpo in assenza di glutaraldeide; in figura 5A, i dischi di carta vuoti sono stati trattati con glutaraldeide, ma nessun FITC-anticorpi stati caricati sul dischi di carta. </li></ol></li><li> Essiccare i dischi di carta (da sezioni 2.1 e 2.2) a 37 ° C per 10 min. </li><li> Bloccare le dischi di carta con 15 microlitri di tampone di bloccaggio (10% di latte scremato in polvere in 50 mM tampone Tris, pH 7,4, con 0,15 M NaCl) per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Carico 5 ml e 8 ml di perossidasi coniugato capra anti-IgG di coniglio in PBS (1: 10.000) sui rispettivamente medie di flusso e dischi di carta filtro rapido flusso,. incubare per30 min al buio a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte. NOTA: Non è necessario rimuovere il tampone di lavaggio come i risultati non sono influenzati dal buffer. </li><li> Caricare una miscela di 10 ml di 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno su ogni disco. </li><li> Prendere immagini dei dischi di carta con una fotocamera digitale o telefono intelligente dopo 5 min di incubazione. NOTA: In figura 5B, &#39;0&#39; significa i dischi di carta che sono stati trattati con glutaraldeide, seguita caricando anticorpo-HRP (perossidasi di rafano) coniugato in assenza di FITC-anticorpo. </li></ol> 3. a base di carta ELISA per il rilevamento IgG <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica della ELISA cartaceo for IgG rilevamento. Cattura anticorpi sono stati covalentemente immobilizzati su dischi di carta di cellulosa aldeide-funzionalizzati attraverso glutaraldeide. I dischi di carta di cellulosa sono state bloccate con tampone di bloccaggio. Obiettivo IgG è stato quindi aggiunto ai dischi, seguita dal caricamento di anticorpi segnale HRP-coniugati. Infine, la soluzione di TMB e la miscela di perossido di idrogeno è stato caricato su ogni disco di carta per la lettura del colore. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Aggiungere 5 ml di soluzione di glutaraldeide 0,05% (preparato in 50 mM tampone PBS, pH 7,4) ad una bottiglia di vetro da 20 ml. Immergere 15 medio-flow dischi di carta filtro ammina-funzionalizzata in questa soluzione e conservare per 1 ora con agitazione a temperatura ambiente. <ol><li> Allo stesso tempo, ripetere il punto 3.1 per preparare un altro 15 aldeide funzionalizzati dischi di carta filtro rapido flusso. ATTENZIONE: Maneggiare glutaraldeide nel fumecappuccio. </li></ol></li><li> Per rimuovere glutaraldeide non reagito dai dischi di carta, posizionare i dischi di carta filtro 15 medie di flusso in un tubo da centrifuga da 15 ml, ei dischi di carta filtro 15 fast-flow in un&#39;altra provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 5 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta e agitare le provette per 10 sec. Rimuovere l&#39;acqua aspirando con una pipetta. Ripetere due volte per rimuovere qualsiasi glutaraldeide non reagito. </li><li> Asciugare i dischi di carta in un forno a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 5 microlitri e 8 ml di 0,025 mg / ml anticorpi frammento IgG di topo-Fc per ciascuno dei dischi di media portata e carta da filtro a flusso veloce, rispettivamente, e incubare per 20 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) per ciascun disco di carta senza rimuovere gli anticorpi e incubare per 40 min per la reazione ammina aldeidi. </li><li> Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte. </li><li> Essiccare i dischi di carta in un forno a 37 ° C. </li><li> Bloccare i dischi di carta wesima 15 ml di tampone di bloccaggio per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare ogni disco di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte. </li><li> Eseguire standard IgG. <ol><li> Carico 10 ml di varie concentrazioni di IgG (ad esempio, 0, 10, 125, 250, e 500 ng / ml in PBS) su ogni disco in triplicato. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte. </li><li> Carico 10 ml di anticorpi HRP coniugato IgG di topo-Fc frammento (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7,4), e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte. NOTA: Non è necessario rimuovere il tampone di lavaggio come i risultati non sono influenzati dalla presenza di tampone. </li><li> Caricare una miscela di 10 ml di TMB e perossido di idrogeno su ogni disco. </li><li> Timmagini Ake di tutti i dischi di carta con una fotocamera digitale o telefono intelligente dopo 5 min di incubazione. NOTA: In figura 6A, &#39;0&#39; sta per dischi di carta trattati con anticorpo di cattura immobilizzazione e la soluzione di anticorpo-HRP / TMB senza siero IgG. </li><li> Analizzare l&#39;intensità di ciascun disco di carta nell&#39;immagine da Image J. <ol><li> Convertire le immagini scattate nel passo 3.15 nel formato &#39;.tif&#39;. </li><li> Aprire il software &#39;immagine J&#39;. </li><li> Vai a &#39;File → Open&#39;, scegliere l&#39;immagine da analizzare. </li><li> Scegliere il pulsante di forma &#39;ovale&#39;. </li><li> Vai a &#39;Immagine → Tipo → 32 bit&#39;. </li><li> Vai a &#39;Modifica → Inverti&#39;. </li><li> Vai a &#39;Analizzare → Misura&#39;. </li><li> Copia e analizzare i dati in un foglio di calcolo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

dirette di verniciatura affinità purificato capra anti-mouse IgG-Fc anticorpo di cattura su dischi di carta non modificato di cellulosa è stato eseguito per rilevare le concentrazioni di IgG. I risultati hanno indicato che, ulteriormente fissaggio degli anticorpi di cattura è richiesto per la riproducibilità. La tecnica silano è stata usata con successo per introdurre gruppi funzionali amminici ai dischi di carta di cellulosa 34. La concentrazione di APS colpisce l&#39;immobilizzazione di anticorpi. Pertanto,...

Lo studio diagnostico point-of-care (POCT) è importante per lo sviluppo di nuove strategie per la terapia, la medicina personalizzata, e assistenza domiciliare 1. Carte cellulosa sono ampiamente usati come piattaforme in saggi immunologici, come sono economici, accessibili e familiare agli utenti 2. Inoltre, la struttura porosa della carta di cellulosa possiede il potere di guidare il flusso di liquido senza ulteriore impatto energetico. Le registrazioni dei bioanalisi cartaceo può essere trovato già nel 20 ° secolo, quando cromatografia su carta è stato inventato nel 1952. L&#39;esempio più diffuso è test immunocromatografici 3, come le strisce di gravidanza e test per il diabete. Questi test forniscono tempi di analisi relativamente veloce e analisi economica 4. Grazie alla loro semplicità, questi test striscia di carta convenzionali sono stati ampiamente utilizzati in diagnostica POCT 5. Metodi di rilevamento tra colorimetrico 6, elettroSono stati riportati chimici 7 e 8 ElettroChemiLuminescenza metodi per misurare bersagli in campioni biologici. In aggiunta a questi metodi quantitativi, un metodo affidabile per immobilizzare anticorpi su carta di cellulosa è anche importante per lo sviluppo di dispositivi diagnostici. Adsorbimento non specifico è la strategia principale per modificare gli anticorpi sulla superficie dei dispositivi cartacei 9, 10 per garantire la massima capacità di legame ai loro obiettivi dopo immobilizzazione. Tuttavia, uno studio precedente hanno dimostrato che gli anticorpi che vengono assorbiti dalla carta di cellulosa possono desorbire dalle fibre 11 del 40%. Così, adsorbimento diretta degli anticorpi su cellulosa non può fornire risultati riproducibili 12. Immobilizzazione covalente di anticorpi che si innestano sulle superfici di carta è un metodo alternativo di sviluppare efficaci biotest cartacei 13. Vari metodi sono stati segnalati per la modifica della cellulosa 14, 15 </sup&gt;. Idealmente, gli anticorpi dovrebbero mantenere la loro funzionalità originale dopo l&#39;immobilizzazione 12. Carbonildiimidazolo combinato con 1-ciano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene attraverso una strategia di attivazione UV a base 17, 18; una strategia basata su chemoenzimatica xyloglucan 19 modifica; un agente di collegamento 1,4-phenylenediisothiocyanate 20; eteropolisaccaride ossidazione 21 click chemistry 22; e porfirine cationiche 23 sono stati utilizzati per immobilizzare covalentemente biomolecole su carta di cellulosa. Chitosano carta modificato è stato usato per sviluppare immunodevices cartacei 24-26 poiché è abbondante e biocompatibile 27. Il chitosano è cationico e aderisce con forza alla cellulosa anionici 27. Gli anticorpi di cattura sono immobilizzati sulla carta attraverso rivestimento chitosano e glutaraldeide reticolazione. ossidazione periodato è un altro metodo per l&#39;innesto del captanticorpi ure sulla carta di cellulosa 28. In questo metodo, periodato di sodio è depositata su carta per convertire gruppi 1,2-dihydroxyl (glicole) di cellulosa direttamente ai gruppi aldeidici. I gruppi aldeidici sono quindi utilizzate per formare legami covalenti tra polisaccaridi e anticorpi 28. Sebbene la fabbricazione è semplice, è difficile lavare completamente periodato di sodio. Il periodato di sodio non lavato può causare ulteriore ossidazione degli anticorpi che sono immobilizzati sulla carta di cellulosa, influenzando l&#39;attività e la stabilità degli anticorpi N -. (3-dimetilamminopropil) - N cloridrato -ethylcarbodiimide e N linkers croce -hydroxysuccinimide sono utilizzati anche per covalentemente immobilizzare anticorpi sulla acide e acetato di cellulosa nanofibre poli-L-lattico elettrofilate per lo sviluppo di saggi nanofibre a base 29. In questo studio, una tecnica di accoppiamento silano è stato usato per innestare gruppi funzionali amminici su cellulosdischi di carta e. Questa tecnica aiuta a mantenere le dimensioni originali dei pori, traspirante, e velocità di filtrazione delle carte da filtro di cellulosa, consentendo la massima verticali flow-through in saggi immunologici. La tecnica di accoppiamento silano è stato ampiamente utilizzato in biosensori per funzionalizzare superfici dei substrati con gruppi amminici secondari, seguita da un&#39;ulteriore modifica utilizzando biomolecole. L&#39;innesto di gruppi amminici sulla superficie matrice comprende una reazione di condensazione tra i gruppi -OH degli agenti silano organo e matrice substrato 30. I dischi di carta di cellulosa sono stati funzionalizzati con gruppi amminici di silano attraverso 3-amminopropiltrimetossisilano (APS) 31. Questa è stata seguita da anticorpi di cattura covalente immobilizzanti utilizzando due metodi diversi. Il primo metodo ha coinvolto legame di periodato anticorpi di cattura ossidati alle ammine funzionalizzate dischi di carta di cellulosa. Il secondo metodo utilizzato glutaraldeide come agente reticolante per collegare la Antibodi catturaes ai dischi di carta di cellulosa di gruppo-funzionalizzati ammina. La presenza di anticorpi di cattura è stata confermata da rabbit IgG isotiocianato-fluoresceina anti-umano (FITC), utilizzando un sensore molecolare fluorescenza. L&#39;attività di legame di coniglio anti-IgG umane-FITC per capra anti-IgG di coniglio è stata anche valutata substrato perossidasi. Gli effetti di varie concentrazioni di periodato di sodio, glutaraldeide, e anticorpi di cattura sono stati studiati. Il test applicazione della anticorpo di cattura immobilizzato è stato eseguito con successo attraverso l&#39;individuazione di IgG nel siero.

<table><tbody><tr><td>Carta da filtro in cellulosa, grado 1 (carta da filtro a medio flusso)</td><td>GE Healthcare Pte Ltd Singapore&nbsp;</td><td>1001 110</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro di cellulosa, Grado 113 (carta da filtro a flusso rapido)</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>1113-320</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>G6257</td><td>Grado II, 25% in H2O</td></tr><tr><td>Tensioattivo</td><td>Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Album di siero bovino.</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Louis Fran&ccedil; ois&nbsp;</td><td></td><td>Confezionato da Kitchen Capers, Singapore</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>Periodato di sodio</td><td>Merck</td><td>106597</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>CALBIOCHEM</td><td></td><td></td>567441</tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS, contenente 137&nbsp; mmol/L NaCl, 2,7&nbsp; mmol/L KCl, 8,0&nbsp; mmol&#8288;/&#8288; L Na2HPO4 e 1,5&nbsp; mmol/L KH2PO4, è preparato con acqua e regolato a pH 7,4 con 0,1&nbsp; mol/L NaOH o 0,1&nbsp; mol/L HCl</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore</td><td>9005-68</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di TMB e soluzione di perossido di idrogeno&nbsp;</td><td>Soluzione ultra TMB-ELISA in 1 fase, Thermo Scientific Pierce</td><td>34029</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coniglio anti-umano IgG-FITC</td><td>TWC/Bio Pte Ltd</td><td>Singapore sc-2278</td><td></td></tr><tr><td>Capra coniugata perossidasi anti-coniglio IgG</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2030</td><td></td></tr><tr><td>Affinità capra purificata anti-topo IgG-Fc rivestimento anticorpo</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131A</td><td></td></tr><tr><td>Riferimento per topi siero</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>RS10-101-5</td><td>9,5 mg/ml</td></tr><tr><td>HRP capra coniugata anti-topo IgG-Fc rilevamento anticorpo</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro a infrarossi a trasformata di Fourier</td><td>Shimadzu IR Prestige-21&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imager molecolare a fluorescenza</td><td>Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>NUVE FN500</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Turbo mixer VM-2000</td><td>MYC LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RGB, download gratuito</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

covalente legame degli anticorpi al cellulosa dischi di carta e le loro applicazioni a occhio nudo colorimetrici immunoassays

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Questo rapporto presenta due metodi per l&#39;immobilizzazione covalente di anticorpi di cattura su filtro di cellulosa grado di carta n ° 1 (carta da filtro di media portata) dischi e di grado n ° 113 (carta da filtro rapido flusso) dischi. Questi dischi di carta di cellulosa sono stati innestati con gruppi funzionali amminici tramite una tecnica di accoppiamento silano prima gli anticorpi sono stati immobilizzati su di essi. metodi di reticolazione periodato di ossidazione e glutaraldeide sono stati usati per innestare anticorpi di cattura sui dischi di carta di cellulosa. Per garantire la massima capacità di legame degli anticorpi di cattura ai loro bersagli dopo l&#39;immobilizzazione, sono stati studiati gli effetti di varie concentrazioni di periodato di sodio, glutaraldeide, e anticorpi di cattura sulla superficie dei dischi di carta. Gli anticorpi che sono stati rivestiti sui dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzata tramite un agente reticolante glutaraldeide mostrato migliorata attività di legame al bersaglio rispetto al metodo di ossidazione periodato. IgG (nel siero riferimento mouse) è stato usato come target di riferimento in questo studio per testare l&#39;applicazione di anticorpi immobilizzati covalentemente attraverso glutaraldeide. Un nuovo cartaceo, enzimatico test immunoenzimatico (ELISA) è stato sviluppato con successo e convalidato per l&#39;individuazione di IgG. Questo metodo non richiede attrezzature, e può rilevare 100 ng / ml di IgG. La carta da filtro a flusso rapido era più sensibile della carta da filtro flusso medio. Il periodo di incubazione di questo test è stato breve e richiedeva piccoli volumi di campione. Questo occhio nudo, immunologico colorimetrica può essere esteso per rilevare altri obiettivi che sono identificati con ELISA convenzionale.

<img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig3.jpg" /> Figura 3. trasformata di Fourier (FTIR) spettri di filtro flusso medio greggia e APS-trattata carta quadrato (A) e il filtro a flusso rapido carta quadrato (B). A. Gli spettri per non trattata filtro medio-flow quadrato di carta era simile a quella di APS trattate filtro medio-flusso di carta quadrato. L&#39;aumento della intensità a bande di 902-1,170 cm -1</su...

In questo manoscritto vengono presentati i metodi di ossidazione dei periodici e di reticolazione della glutaraldeide per l'immobilizzazione covalente degli anticorpi su dischi di carta. È stata valutata l'attività di legame degli anticorpi immobilizzati. Sulla base di questi risultati, è stato utilizzato un metodo di reticolazione della glutaraldeide per sviluppare un nuovo test immunologico basato su carta per la rilevazione delle immunoglobuline G (IgG).

Covalente legame degli anticorpi al cellulosa dischi di carta e le loro applicazioni a occhio nudo colorimetrici Immunoassays

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è stabilizzare anticorpi e proteine su una matrice di cellulosa per facilitare lo sviluppo di un saggio immunoistochimico colorimetrico visibile ad occhio nudo, utile per la diagnostica point-of-care. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della diagnostica point-of-care. Il principale vantaggio di questa tecnica è che favorisce la stabilizzazione delle proteine sulla cellulosa, consentendo lo sviluppo di saggi diagnostici su carta a basso costo.La procedura sarà dimostrata da Gloria Chang, una studentessa del mio laboratorio. Per iniziare, preparare un pezzo di carta quadrata con dimensioni di un centimetro per un centimetro. Preparare inoltre 100 dischetti di carta realizzati in carta di cellulosa Whatman grado numero uno con un diametro di 6,0 millimetri, utilizzando un perforatore.Per ottenere gruppi amminici sui dischetti di carta, mescolare un millilitro di APS e 10 millilitri di acetone in un flacone di vetro da 50 millilitri sotto cappa. Aggiungere i dischetti di carta alla miscela di reagente APS appena preparata. Quindi incubare i dischetti nella miscela per cinque ore con agitazione orbitale a temperatura ambiente.Versare la soluzione in eccesso dalla bottiglia di vetro da 50 millilitri in un contenitore per rifiuti organici. Aggiungere 10 millilitri di acetone nella bottiglia di vetro, mescolare bene ed eliminare completamente il liquido per rimuovere qualsiasi APS non reagito e altre impurità. Ripetere questo passaggio due volte.Disporre i dischetti di carta sul tovagliolo di carta e collocarli in un forno a 110 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver lasciato raffreddare i dischetti di carta, conservarli in un tubo da centrifuga da 50 millilitri a temperatura ambiente. Utilizzare la spettroscopia infrarossa con trasformata di Fourier o FTIR per verificare il grafting dei gruppi amminici sulla carta quadrata di cellulosa.Aprire il software per la spettroscopia FTIR. Accedere all'inizializzazione della misurazione. Selezionare i dati al di sotto dei rettangoli e scegliere la percentuale di trasmissione come modalità di misurazione.Quindi selezionare Happ-Genzel come apodizzazione, impostare 45 come numero di scansioni, 4,0 come risoluzione e definire l'intervallo da un minimo di 400 a un massimo di 4.000. Fare clic su misura, quindi selezionare il file dati per i dati di fondo. Cliccare su BKG per ottenere la linea di base del fondo.Successivamente, fissare il campione di carta quadrata sul portacampioni per film. Quindi selezionare il file dati per i dati del campione e fare clic su campione per ottenere lo spettro del campione. Chiudere l'applicazione di spettroscopia FTIR e spegnere il computer.Aggiungere cinque millilitri di soluzione di glutaraldeide allo 0,05% in un flacone di vetro da 20 millilitri. Immergere 15 dischetti di carta filtrante a flusso medio funzionalizzati con gruppi amminici in questa soluzione e lasciare per un'ora sotto agitazione a temperatura ambiente. Contemporaneamente, ripetere questo passaggio per preparare altri 15 dischetti di carta filtrante a flusso rapido funzionalizzati con gruppi aldeidici.Per rimuovere il glutaraldeide non reagito dai dischetti di carta, posizionare prima i dischetti di carta da filtro a flusso medio e i dischetti di carta da filtro a flusso rapido in provette centrifughe da 15 millilitri separate. Aggiungere quindi cinque millilitri di acqua deionizzata in ciascuna provetta e agitare le provette per 10 secondi. Rimuovere l'acqua aspirando con una pipetta.Ripetere due volte per rimuovere ogni traccia di glutaraldeide non reagita. Quindi asciugare i dischetti di carta in un forno a 37 gradi Celsius. Una volta asciutti, aggiungere cinque microlitri di anticorpi frammento Fc di IgG murina a una concentrazione di 0,025 milligrammi per millilitro sui dischetti di carta filtrante a flusso medio e otto microlitri sui dischetti di carta filtrante a flusso rapido.Dopo un'incubazione di 20 minuti, aggiungere 10 microlitri di PBS 50 millimolare, pH 7,4, su ciascun disco di carta senza rimuovere gli anticorpi. Incubare per 40 minuti per consentire la reazione tra ammina e aldeide. Lavare i dischi di carta con 0,2 millilitri di tampone di lavaggio su un tovagliolo di carta.Ripetere il lavaggio tre volte. Dopo aver essiccato i dischetti di carta in un forno a 37 gradi Celsius, bloccare i dischetti con 15 microlitri di buffer di blocco per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare ciascun dischetto con 0,2 millilitri di buffer di lavaggio sopra un tovagliolo di carta.Ripetere il lavaggio tre volte. Successivamente, eseguire gli standard di IgG. Caricare 10 microlitri di diverse concentrazioni di IgG su dischetti individuali in triplice replicato.Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare i dischetti di carta con 0,2 millilitri di soluzione di lavaggio su un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.Dopo i lavaggi, aggiungere 10 microlitri di anticorpi contro il frammento Fc della IgG murina coniugati con HRP e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare i dischetti di carta con 0,2 millilitri di soluzione di lavaggio su un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.Infine, applicare una miscela di 10 microlitri di TMB e perossido di idrogeno su ciascun disco. Scattare immagini di tutti i dischi di carta con una fotocamera digitale o uno smartphone dopo cinque minuti di incubazione e analizzarle come descritto nel protocollo testuale. Qui sono mostrati gli spettri FTIR della carta da filtro a flusso medio non trattata e trattata con APS e della carta da filtro a flusso rapido.L'aumento delle intensità alle bande di 902 e 1.170 centimetri inversi e da 1.210 a 1.500 centimetri inversi per la carta da filtro a flusso medio, così come i picchi caratteristici nell'intervallo da 972 a 1.180 centimetri inversi per la carta da filtro a flusso rapido, ha dimostrato che l'APS è stato correttamente grefatto sulla carta di cellulosa. Gli effetti di diverse concentrazioni di glutaraldeide sull'immobilizzazione di IgG-FITC sui dischetti di carta sono mostrati qui. La concentrazione ottimale di glutaraldeide è dello 0,05%. Analogamente, vengono presentati gli effetti di diverse concentrazioni di IgG-FITC sull'immobilizzazione di IgG-FITC sui dischetti di carta.L'aumento del carico e della concentrazione di IgG FITC incrementa la quantità di IgG FITC immobilizzata sui dischetti di carta. Tuttavia, un'elevata concentrazione di IgG FITC immobilizzata non migliora la capacità di legame con l'antigene. Qui vengono mostrate le curve di calibrazione per la determinazione di IgG mediante ELISA su carta.Gli anticorpi sono stati rilevati a una concentrazione di un nanogrammo per millilitro di IgG ad occhio nudo utilizzando questo saggio su carta. La concentrazione di IgG nel siero presentava una relazione lineare con l'intensità colorimetrica da zero a 500 nanogrammi per millilitro quando ogni passaggio era incubato per un'ora. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come immobilizzare anticorpi sulla matrice cellulare per lo sviluppo di saggi immunoenzimatici.L'idea è nata inizialmente durante lo sviluppo di saggi diagnostici a basso costo che presentavano una sensibilità limitata. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica point-of-care, permettendo di esplorare lo sviluppo di test diagnostici economici da eseguire direttamente sul posto per vari patogeni.

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Questo video dimostra il rilevamento di complessi anticorpo-antigene coniugati chimicamente tramite il test di immunoassorbimento enzimatico a sandwich, o ELISA, tecnica. L'anticorpo catturato si lega all'epitopo specifico dell'antigene del coniugato anticorpo-antigene, che può essere successivamente visualizzato utilizzando un anticorpo secondario legato all'enzima.

Saggio di immunoassorbimento enzimatico per la verifica di coniugati anticorpo-antigene chimicamente accoppiati

Il video mostra un test immunologico basato su carta, che coinvolge dischi di cellulosa funzionalizzati con ammina reticolati con glutaraldeide. L'immobilizzazione covalente degli anticorpi di cattura specifici per IgG-Fc, seguita dall'introduzione di immunoglobuline G e anticorpi di rilevamento coniugati con perossidasi di rafano, determina un cambiamento di colore che conferma la presenza di immunoglobulina G.

Un test immunologico cartaceo per la rilevazione dell'immunoglobulina G

Questo protocollo descrive lo sviluppo di due anticorpi monoclonali (mAb) di classe IgG fortemente reattivi alla mioglobina dei cetacei. Questi mAb vengono applicati su una striscia reattiva immunocromatografica all'oro colloidale basata sul formato a sandwich per differenziare il Mb dei cetacei dalla foca e da altri animali.

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Questo protocollo descrive una metodologia per la preparazione di perle di lattice per saggi che utilizzano anticorpi IgY per la rilevazione dell'antigene.

Standardizzazione di un test citometrico a perline basato su anticorpi tuorlo d'uovo

Per rispondere alle esigenze diagnostiche urgenti della dengue, qui presentiamo un dispositivo analitico cartaceo Dengue NS1 integrato nell'app per smartphone (DEN-NS1-PAD) per quantificare la concentrazione dell'antigene Dengue NS1 in campioni clinici di siero/sangue. Questa innovazione migliora la gestione della dengue aiutando il processo decisionale clinico in vari contesti sanitari, anche quelli con risorse limitate.

Immunodosaggio portatile su carta combinato con l'applicazione per smartphone per la rilevazione colorimetrica e quantitativa dell'antigene NS1 della dengue

Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di nanosfere a punti quantici (QDNB) e il rilevamento di biomarcatori di malattia utilizzando strisce di immunodosaggio a flusso laterale basate su QDNB. I risultati del test possono essere valutati qualitativamente sotto l'illuminazione a luce UV e misurati quantitativamente utilizzando un lettore di strisce fluorescenti entro 15 minuti.

Immunodosaggio fluorescente a flusso laterale basato su nanosfere di punti quantici

Descriviamo una piattaforma di immunodosaggio di recente sviluppo basata sui principi della biologia sintetica cell-free e sulla tecnica dot-blot per il rilevamento personalizzabile della risposta anticorpale in sieri umani e animali.

Cell-Free Dot Blot come piattaforma di immunodosaggio pratica e adattabile per il rilevamento della risposta anticorpale in sieri umani e animali

Impara a immobilizzare anticorpi su dischi di carta cellulosa mediante ossidazione con periodato e reticolazione con glutaraldeide. Questo metodo consente lo sviluppo di immunoassay colorimetrici a basso costo per la diagnosi point-of-care.

Covalente legame degli anticorpi al cellulosa dischi di carta e le loro applicazioni a occhio nudo colorimetrici Immunoassays

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