Name: Imparziale sequenziamento profondo di RNA virus da campioni clinici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Impara a preparare librerie di sequenziamento per virus RNA da campioni clinici con deplezione selettiva dell'RNA. Questo metodo imparziale consente l'assemblaggio de novo e l'analisi delle varianti per la sorveglianza virale.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) e dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, nell'ambito dei contratti (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C e U19AI110818).

dichiarazione etica: pazienti febbre di Lassa sono stati reclutati per questo studio utilizzando protocolli approvati da comitati soggetti umani presso la Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Ospedale governo Kenema (KGH), Oyo Ministero della Salute, Ibadan , Nigeria e Sierra Leone Ministero della Salute. Tutti i pazienti sono stati trattati con un livello simile di cura e sono stati offerti il ​​farmaco ribavirina, anche se non hanno deciso di partecipare allo studio. Per la febbre Lassa (LF) dei pazienti, il trattamento con Ribavirina ha seguito le linee guida attualmente raccomandati ed è stato generalmente offerto non appena LF è stata fortemente sospettato. A causa della grave epidemia di Ebola virus della malattia (EVD), i pazienti non potevano essere consentito attraverso i nostri protocolli standard. Invece l&#39;uso di campioni in eccesso clinici di pazienti EVD è stato valutato e approvato da Institutional Review Boards in Sierra Leone e alla Harvard University. il Office della Etico e Review Comitato Scientifico la Sierra Leone, la Sierra Leone, Ministero della Salute e Igiene, e il Comitato di Harvard sulla uso di soggetti umani hanno concesso una rinuncia del consenso per sequenza e rendere sequenze virali pubblicamente disponibili ottenuti da campioni di pazienti e di contatto raccolti durante l&#39;epidemia di Ebola in Sierra Leone. Questi corpi inoltre concesso l&#39;uso dei dati clinici ed epidemiologici per campioni de-identificato raccolti da tutti i pazienti che ricevono cure EVD sospetti durante la risposta epidemia. Il Leone Ministero della Salute e Igiene Sierra ha inoltre approvato le spedizioni di non infettivi, i campioni non biologici da Sierra Leone a Broad Institute e Harvard University per gli studi genomici di campioni focolaio. 1. DNasi-trattamento di RNA del campione (fino a 55 ml estratti RNA totale, ~ 4 ore) <ol><li> Impostare la reazione DNasi in una piastra a 96 pozzetti PCR su ghiaccio in un armadio biosicurezza come descritto nella Tabella 1 </strong&gt;, Step 1,1 (volume totale, 70 microlitri / pozzetto). Nota: Un mix master può essere preparato. </li><li> Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Cleanup utilizza in fase solida reversibile immobilizzazione (SPRI) perline RNA. <ol><li> perline RNA riscaldare a TA per 30 min. </li><li> Agitare delicatamente bottiglia perline RNA per risospendere le particelle magnetiche che possono essere regolati. Aggiungere il volume 1,8x (126 ml) di perline RNA RNA DNasi-trattati (70 ml), mescolare con una pipetta 10 volte e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (volume totale di ben, 196 ml). </li><li> Posizionare miscela sulla stazione magnetica. Attendere la soluzione per deselezionare (5 - 10 min). </li><li> Rimuovere la soluzione eliminato mentre sulla stazione da pipetta e degli scarti. Mentre sulla stazione, lavare perline coprendo pellet con il 70% di etanolo e incubare per 1 min. Rimuovere etanolo con pipetta e degli scarti. Ripetere per un totale di due lavaggi. Nota: L&#39;utilizzo precisamente il 70% appena preparato etHANOL è critica, come una percentuale maggiore si tradurrà in lavaggio inefficiente delle molecole più piccole dimensioni, mentre &lt;70% di etanolo potrebbe causare la perdita di campione 7. </li><li> Mantenere targa sulla stazione e lasciare aperta asciugare all&#39;aria. Nota: Assicuratevi di lasciare le perline asciugare completamente fino perline cominciano a incrinarsi. </li><li> Aggiungere 55 ml di acqua priva di nucleasi alla piastra per eluire RNA. Rimuovere la piastra dalla stazione di mescolare le perline e acqua pipettando accuratamente. Nota: In alternativa, utilizzare meno acqua (≤ 10 pl) per concentrare l&#39;RNA totale. </li><li> Mettere piastra posteriore della stazione. Attendere fino a quando la soluzione cancella per trasferire da pipetta nuovo tubo tappo a vite per la conservazione a lungo termine (-80 ° C). Mettere 5 ml di RNA in new 96-pozzetti PCR per esaurimento (passo. 2.4). </li><li> Optional:. Salva e diluire 1 ml a 19 ml di acqua (1:20) per qRT-PCR di rRNA (ad esempio, 18S, 28S rRNA) (Tabella 2) e marcatori virali 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. L&#39;esaurimento selettiva di ribosomiale e Carrier RNA da virale campione di RNA (~ 4 ore) <ol><li> Fare ibridazione 5x e 10x buffer di reazione RNasi H, e l&#39;acqua priva di nucleasi con supporto acrilamide lineare come descritto nella tabella 1. </li><li> Impostare reazione di ibridazione combinando RNA con oligonucleotidi deplezione rRNA (Tabella 3) e oligo (dT) sul ghiaccio in una piastra a 96 pozzetti PCR come descritto nella Tabella 1. Nota: Un mix master può essere preparato. 50 femtogrammi (FG) di un RNA sintetico unico (ERCCs 8) possono essere aggiunti per il monitoraggio sia per il processo di sequenza virale e potenziale indice di lettura contaminazione incrociata. <ol><li> Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare a 95 ° C per 2 min, lento rampa di 45 ° C a -0,1 ° C per sec. Pausa termociclatore a 45 ° C. </li></ol></li><li> Impostare mix di reazione RNase H sul ghiaccio come descrittod nella Tabella 1, quindi preriscaldare a 45 ° C per 2 min. Nota: Un mix master può essere preparato. <ol><li> Aggiungere la miscela preriscaldata RNase H della reazione di ibridazione in lamiera mantenendo la piastra nel termociclatore a 45 ° C. </li><li> Mescolare bene delicatamente pipettando 6 - 8 volte. Incubare a 45 ° C per altri 30 min. Mettere in ghiaccio. </li></ol></li><li> Impostare la miscela di reazione DNasi sul ghiaccio, come descritto nella tabella 1. Nota: Un mix master può essere preparato. <ol><li> Aggiungere alla reazione RNasi H in lamiera, vortice delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Smettere di reazione DNase con l&#39;aggiunta di 5 ml di 0,5 M EDTA. Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li></ol></li><li> Cleanup utilizzando perline di RNA (vedi punto 1.3) con un volume di 1,8 volte (144 ml) perline. Eluire in 11 ml di acqua priva di nucleasi. Nota: Per lo stoccaggio a freddo di sicurezza, negozio impoverito RNA campioni a -80 ° C O / N. </li></ol> 3. cDNA Synthesis (~ 6 ore) <ol><li> Mix rRNA / RNA carrier-impoverito con primer casuali sul ghiaccio in una piastra a 96 pozzetti PCR, come descritto nella tabella 1, vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. <ol><li> Riscaldare il miscuglio a 70 ° C per 10 minuti in un termociclatore. Subito dopo la denaturazione di calore, posizionare l&#39;RNA in ghiaccio per 1-5 min. Non lasciare che l&#39;RNA di stare (anche su ghiaccio) per più di 5 minuti prima del primo filamento reazione. </li></ol></li><li> Impostare mix reazione di sintesi del primo filamento sul ghiaccio come descritto nella Tabella 1. Nota: Un maestro-mix può essere preparato. <ol><li> Aggiungi RNA / random miscela di primer in lamiera, vortice delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare a 22 - 25 ° C per 10 min. </li><li> Incubare a 55 ° C in un incubatore d&#39;aria per 60 min. Posizionare la piastra sul ghiaccio per terminare la reazione. None: L&#39;uso di un incubatore aria è consigliabile creare progressivo riscaldamento del primo filamento di reazione durante il quale il primer ricottura e la prima parte inizia ad allungarsi. </li></ol></li><li> Impostare mix reazione di sintesi del secondo filone sul ghiaccio, come descritto nella tabella 1. Nota: Un maestro-mix può essere preparato. <ol><li> Aggiungi il primo filamento reazione di sintesi nel piatto, vortice delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare per 2 ore a 16 ° C (tenere il coperchio a 25 ° C). Non permettere che la temperatura a salire sopra 16 ° C. </li><li> Posizionare la piastra sul ghiaccio, poi inattivare reazione con l&#39;aggiunta di 5 ml di 0,5 M EDTA, mescolare delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li></ol></li><li> Pulizia con perline di DNA (vedi punto 1.3 per il protocollo) che utilizzano il volume 1,8 volte (153 ml) di perline. Eluire in 9 ml di tampone di eluizione (EB). Salva 1 ml per la quantificazione. Utilizzare 1 ng di cDNA per subsequepassi NT. Se la concentrazione cDNA è troppo bassa per rilevare, utilizzare 4 ml di cDNA per tagmentation (vedi punto 4.1). </li><li> Per lo stoccaggio a freddo di sicurezza, negozio di doppio filamento cDNA a 4 ° CO / N o -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 4. Biblioteca Preparazione - DNA Biblioteca Costruzioni (~ 4 ore) <ol><li> Trasferimento 4 ml di cDNA ad una piastra a 96 pozzetti e salvare il restante cDNA per un secondo tentativo se necessario. </li><li> Impostare la reazione tagmentation su ghiaccio come descritto nella Tabella 1. Nota: Un maestro-mix può essere preparato. Per ridurre il fondo e il costo complessivo, il volume totale della reazione tagmentation è ridotto da 20 a 10 microlitri. Come cDNA è il fattore limitante, la quantità di ATM (cioè, transposome) utilizzato nella reazione è anche ridotta per diminuire il numero di siti di integrazione. <ol><li> Aggiungere mix tagmentation al cDNA nel piatto, vortice delicatamente e accuratamente e centrifugare a 280 g (a temperatura ambiente) per 1 min.Incubare a 55 ° C per 5 minuti, tenere a 10 ° C. </li><li> Una volta a 10 ° C, aggiungere immediatamente 2,5 ml di Neutralizzare Tagment Buffer (NT) per terminare la reazione. Mescolare pipettando su e giù, quindi si centrifuga a 280 xg (a RT) per 1 min. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol></li><li> Impostare PCR reazione di amplificazione in ghiaccio come descritto nella Tabella 1. <ol><li> Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Eseguire la PCR sul termociclatore utilizzando le condizioni descritte in Tabella 1. Nota: 12 cicli di PCR sono suggeriti per 1 ng di cDNA tagmented; tuttavia, campioni clinici virali hanno spesso quantità rilevabili di cDNA. Per basse quantità di cDNA (&lt;1 ng), utilizzare fino a 18 cicli di PCR per creare abbastanza libreria per il sequenziamento. </li></ol></li><li> Preparazione Biblioteca - pulizia e mettere in comune per il sequenziamento <ol><li> Portare campione fino a 50 ml con EB. </li><li> Pulizia conperline di DNA (vedi punto 1.3 per il protocollo) che utilizzano il volume 0.6x (30 ml) perline. Eluire in 15 microlitri EB. </li><li> Determinare la concentrazione di biblioteca (figura 3) per lo svolgimento di analisi di regione (da 150 a 1000 bp) utilizzando il software bioanalizzatore 9, esclusi i dimeri di primer (~ 120 bp) da analisi regione. Nota: In alternativa, qPCR può essere utilizzato per quantificare le librerie 10. </li><li> librerie piscina presso la più bassa concentrazione molare di 1 nm o superiore. Se biblioteca è inferiore a 1 nM, aggiungere una piccola quantità di biblioteca alla piscina (~ il volume 1x di altre biblioteche) per acquisire informazioni sulla sequenza da queste librerie. </li><li> piscina Cleanup con 0,7x perline DNA come descritto in precedenza (vedi punto 2). Eluire in 15 microlitri EB. Nota: Volume di perline dipenderà dal volume finale della piscina. </li><li> Analizzare piscina 9. Determinare concentrazione molare conducendo analisi regione (da 150 a 1000 bp) 9. Nota: In alternativa, qPCR può essere utilizzato per quantificare piscina libreria 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Carico sequencer a una concentrazione biblioteca 22:00 di generare 101 bp, abbinato-end legge con doppio codice a barre legge 11. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Figura 3. Biblioteche Costruito da virus Ebola campioni clinici. Immagine Gel di 4 rappresentante virus Ebola (EBOV) librerie. Regioni della biblioteca e di primer dimeri sono mostrati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

L&#39;approccio delineato consente robusto, universale, rapida sequenza ed è stato utilizzato per il sequenziamento virus Ebola nel corso del 2014 2,4 scoppio. Accoppiando deplezione selettiva e sintesi del DNA con la costruzione biblioteca tagmentation, il tempo complessivo processo è stato ridotto di ~ 2 giorni da precedenti metodi adattatore legatura. Più di recente, questo protocollo è stato impiegato da collaboratori internazionali e gli altri con grande successo 15,16 e verrà distribuito ai laboratori in Africa occidentale per sostenere gli studi di ricerca genomica basata su locali e diagnostica 17. Il protocollo qui descritto utilizza primer casuali per preparare cDNA per le librerie di RNA-Seq virali. A differenza dei precedenti approcci RNA-seq virali, essa non richiede una conoscenza a priori dei dati di sequenza o di progettazione Primer elaborato e richiede tempo per un virus o clade specifico. Il metodo può essere applicato a qualsiasi campione di RNA virale. Ad esempio, è stato utilizzato per generare contenuti virali sia Ebolae campioni Lassa 6. Il protocollo può essere utilizzato anche per la trascrittomica padrone di casa, progetti di sequenziamento metagenomiche e di scoperta patogeno 1. Un passaggio fondamentale del protocollo è rivolto RNase H digestione, un alto rendimento, metodo a basso costo per la rimozione di vettore indesiderate e dell&#39;RNA host da campioni virali. Il passo deplezione selettiva del protocollo utilizza molti componenti e richiede abilità e precisione. I tempi supplementari e la cura dovrebbe essere presa durante la configurazione iniziale. Come la maggior parte dei campioni di siero e plasma clinici hanno spesso molto poco materiale acido nucleico, la contaminazione e la perdita del campione sono comuni. Per evitare questi problemi, particolare attenzione dovrebbe essere presa quando si utilizza questo protocollo. Innanzitutto, RNA è altamente suscettibile alla degradazione; quindi tutte le aree devono essere puliti e privi di nucleasi. In secondo luogo, per identificare i campioni adatti per l&#39;utilizzo in questo protocollo, analisi qRT-PCR sia per l&#39;RNA ospite e virus devono essere utilizzati per la quantificazione 5,6 </sup&gt;. Quando si confrontano ingresso pari con i risultati di sequenziamento del protocollo, il successo sequenziamento (vale a dire, la generazione di dati sufficienti per l&#39;assemblaggio virale pieno) correlati con i campioni che contenevano almeno 100 pg RNA totale e 1.000 copie del virus. Terzo, l&#39;esposizione a fonti ambientali di acidi nucleici deve essere evitato. Il protocollo descritto qui viene eseguita in una cappa di biosicurezza per precauzioni di sicurezza e per limitare contaminanti ambientali. Inoltre, il nostro gruppo e gli altri hanno notato che gli enzimi commerciali possono essere un&#39;altra fonte di contaminazione acidi nucleici batterici in campioni a basso input 6,18. L&#39;utilizzo di uno spazio di lavoro pulito (ad esempio, la PCR cappuccio, armadio biosicurezza) e controlli negativi (ad esempio, acqua o buffer) aiuterà ad alleviare e tenere traccia di contaminazione, rispettivamente. Per i campioni con &lt;100 pg di RNA totale, solo poli (rA) RNA carrier, non rRNA, dovrebbe essere esaurita per garantire risultati di sequenziamento di alta qualità, limitando la perdita di materiale. per moltocampioni di ingresso bassa, metodi cDNA-amplificazione può essere più adatto 19, anche se poly (rA) vettore dovrebbe essere rimosso prima della sintesi del DNA. L&#39;esaurimento di accoglienza rRNA arricchisce di contenuti virali nelle biblioteche di sequenziamento ed è applicabile alle collezioni di campioni diversi, tra cui siero o plasma, e diversi tipi di tessuti da roditori e primati non umani 5,6. Negli organismi non umani, legge l&#39;allineamento di 28S rRNA è rimasto dopo l&#39;esaurimento, suggerendo 28S rRNA è meno conservato tra gli esseri umani e le altre specie 6,20. Quando si utilizza questo metodo con isolati non-umani, può essere necessario integrare con oligonucleotidi di DNA complementare alle divergenti sequenze rRNA della specifica 3,21 host. Dal momento che il protocollo è imparziale, virale legge può rappresentare solo una piccola frazione del contenuto totale biblioteca. Anche se rRNA è la specie più abbondante di RNA ospitante e solo una piccola percentuale di rRNA legge (0, 1%) si trovano dopo l&#39;esaurimento selettiva, tutti gli altri RNA host (ad esempio, mRNA) rimarrà dopo l&#39;esaurimento e può spiegare molti sequenziamento legge dal campione. Pertanto &quot;sovracampionamento&quot; (vale a dire, oversequencing) singole biblioteche è necessario al fine di avere una copertura sufficiente per le chiamate di assemblaggio e variante virale. Per i nostri studi, si cerca di sequenza ~ 20 milioni letture per campione di avere abbastanza profondità per l&#39;analisi dei virus e varianti genomiche associate così come il contenuto metagenomica 2,5. Per gli studi di scoperta metagenomiche e patogeni, è importante notare che DNA contaminante host viene rimosso dalla DNasi digestione. Pertanto virus e altri agenti patogeni che contengono genomi di DNA possono essere persi durante il processo, tuttavia intermedi di RNA possono ancora essere sequenziato.

La nuova generazione di sequenziamento del virus da fonti cliniche può informare la trasmissione e l&#39;epidemiologia delle infezioni, così come l&#39;aiuto supporto romanzo diagnostica, vaccini e lo sviluppo terapeutico. sintesi del DNA utilizzando primer casuali ha permesso l&#39;individuazione e l&#39;assemblaggio dei genomi da divergenti, co-infettante o anche di nuovi virus 1,2. Come con altri metodi imparziali, contaminanti indesiderati occupano molti sequenziamento legge e un impatto negativo i risultati di sequenziamento. Host e poli (Ra) RNA carrier sono contaminanti presenti in molte collezioni di campioni virali esistenti. Il protocollo descrive un modo efficiente ed economico di profondi genomi virali sequenza di RNA sulla base imparziale totale RNA-Seq. Il metodo utilizza una deplezione selettiva passo RNase H 3 per rimuovere indesiderati ribosomiale host e l&#39;RNA carrier. Deplezione selettiva arricchisce di contenuti virali (Figura 1) e migliora la qualità complessiva dei dati di sequenziamento(Figura 2) da campioni clinici. Inoltre, tagmentation viene applicato al protocollo poiché riduce notevolmente i tempi di costruzione libreria. Questi metodi sono stati utilizzati per generare rapidamente grandi quantità di dati di Ebola e Lassa genomi virali 2,4,5 e possono essere utilizzati per studiare una vasta gamma di virus a RNA. Infine, il metodo non è limitato a campioni umani; l&#39;utilità di esaurimento selettivo è stata dimostrata su campioni di tessuto raccolti da roditori Lassa-infette e modelli di malattia di primati non umani 5,6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;RNA totale contenuto riflette Arricchimento di Lassa Virus Content Utilizzando selettiva esaurimento. Partendo contenuto complessivo (ingresso RNA) e l&#39;arricchimento di unico virus Lassa (LASV) legge (contenuto Library) sulla riduzione di rRNA da nove diversi isolati clinici. Questa cifra è stata modificata da 6 <em&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Figura 2. più di alta qualità Sequencing Dopo Carrier RNA esaurimento. Qualità di base mediani per ciclo di sequenziamento di poli (rA) -contaminated librerie virus Lassa (rosso) e di controllo (nessun vettore osservata in biblioteca, nero) dal rapporto QC 13. Sia in lettura 1 e 2 lettura di fine accoppiato letture vengono uniti nel file BAM biblioteca e il punteggio di qualità sono mostrati in ogni base. Questa cifra è stata modificata dal 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I dettagli del protocollo di costruzione virale RNA-Seq di librerie direttamente da estrattiRNA raccolti da campioni clinici e biologici. Per garantire la sicurezza personale, tutti i campioni di siero, plasma e del tessuto virali, devono essere inattivati ​​nei buffer appropriato prima estrazione di RNA. In alcuni kit di inattivazione e di estrazione, vettore poli (rA) RNA è incluso; questo verrà rimosso durante la fase di svuotamento selettivo iniziale RNase H. Sulla base di recupero completo, la concentrazione atteso di RNA carrier è di 100 ng / ml. Nel protocollo, 110 ng / ml oligo dT RNA (concentrazione di portatori 1.1x) viene utilizzato per esaurimento. Se poly (rA) vettore non è presente nel campione, quindi oligo (dT) non dovrebbe essere aggiunto prima della deplezione. Il seguente protocollo è stato progettato per 24 reazioni in formato piastra PCR (fino a 250 volumi mL). Una precedente versione di questo protocollo è stato segnalato in Matranga, et al. 6.

<table><tbody><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Strisce da otto tappi VWR</td><td></td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Flacone da 50 ml</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>fase di estrazione post RNA, 2 U/&micro; l, tampone incluso</td></tr><tr><td>ciclatore</td><td></td><td></td> PCR <td>qualsiasi ciclatore PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Perline Agencourt RNAClean XP SPRI&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>perline per la pulizia dell'RNA</td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td>qPCR in tempo reale</td><td>qualsiasi sistema</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td>preparare</td></tr><tr><td>freschi primer qRT-PCR</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>vedere Tabella 2</td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide lineare&nbsp;</td><td>Ambion&nbsp;</td>Oligo di DNA <td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>che coprono l'intera regione dell'rRNA</td><td>DNA</td><td></td><td>IDT vedi Tabella 3, ordinare pronto per il laboratorio a 100 & micro; M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt lungo, desalinizzato</td></tr><tr><td>Ibridasi RNasi termostabile H&nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNasi senza RNasi&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>passo di deplezione selettiva</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNasi Inibitore</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Primer casuali&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>per lo più esameri</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Trascrittasi inversa&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>con tampone del primo filamento, incubatore</td></tr><tr><td></td><td></td><td>d'aria</td> DTT <td>qualsiasi ciclatore dell'incubatore d'aria&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Tampone di reazione per sintesi del secondo filamento (senza dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>E. coli DNA Ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&mu; l</td></tr><tr><td>E. coli DNA polimerasi I&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&mu; l</td></tr><tr><td>E. coli RNasi H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&mu; l</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Perline SPRI</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>perline per la pulizia del DNA</td></tr><tr><td>Tampone di eluizione&nbsp;</td>Kit di analisi <td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8,5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS</td><td>Fluorimetro Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&nbsp;</td>Kit di preparazione del campione <td>di DNA Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT&nbsp;</td><td>Kit</td> indice DNA Illumina <td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>reagenti D1000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>ad alta sensibilità D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo per la quantificazione della libreria (universale)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>alternativa alla tapestation, bioanalizzatore per la quantificazione della libreria</td></tr></tbody></table>

imparziale sequenziamento profondo di rna virus da campioni clinici

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Qui descriviamo un protocollo sequenza di RNA di nuova generazione che permette de novo assemblee e chiamate variante intra-host dei genomi virali raccolti da fonti clinici e biologici. Il metodo è imparziale e universale; utilizza primer casuali per la sintesi del DNA e non richiede alcuna conoscenza preliminare del contenuto di sequenza virale. Prima costruzione della libreria, selettivo digestione RNasi H-based è utilizzata per esaurire indesiderato RNA - vettore compreso poli (Ra) e RNA ribosomiale - dal campione di RNA virale. deplezione selettiva migliora sia la qualità dei dati e il numero di univoco legge in biblioteche RNA virali sequenziamento. Inoltre, passo un trasposasi-based &#39;tagmentation&#39; è usato nel protocollo in quanto riduce il tempo complessivo di costruzione biblioteca. Il protocollo ha permesso un rapido sequenziamento profondo di oltre 600 campioni, tra cui Lassa e Ebola virus collezioni sia da sangue e tessuti isolati, ed è ampiamente applicabile ad altri studi di genomica microbica.

Il protocollo descritto consente la generazione di sequenziamento di alta qualità legge da campioni di RNA virale a basso input, arricchendo di contenuti virali unici. Come mostrato in figura 1, il protocollo arricchita unico contenuto virus Lassa almeno cinque volte in tutti i campioni (rispetto ai controlli non impoverito) con almeno un milione di copie del 18S rRNA (~ 100 pg di RNA totale). Allo stesso modo, il successo sequenziamento anche correlata con la quantità di virus in un dato campione. Utilizzando qRT-PCR come surrogato per quantità virale, i campioni che contenevano ~ 1.000 o più copie di genoma virale più spesso create assemblee pieno (dati non riportati). Inoltre, deplezione di poli (rA) portante, sequenze omopolimero di A e T in biblioteche, conseguente preparazioni puliti e garantire una migliore qualità sequenziamento letture (Figura 2). biblioteche definitivo campioni clinici virali a basso input spesso hanno un ampio frammento lunghezza da 150 a 1000 bp(Figura 3). Dopo il sequenziamento, per ridurre errori di identificazione del campione e diafonia tra le biblioteche all&#39;interno di una piscina di 12, solo indice di legge con un punteggio di qualità di base di 25 (Q25) e garantire a zero mancate corrispondenze sono mantenuti durante il processo di demultiplazione. Genomi virali sono assemblati utilizzando una pipeline bioinformatica specifico per virus divergenti 2,4-6. Questi strumenti sono disponibili presso https://github.com/broadinstitute/viral-ngs o attraverso piattaforme cloud commerciali 4. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fase 1.1: reazione DNasi </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Buffer 10x DNase </td><td> 7 </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 6 </td></tr><tr><td> RNA virale estratto </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNase (2 U / &amp; #181; l) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 70 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: tampone 5x ibridazione </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per 1 ml (ml) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Fase 2.1: 10x tampone di reazione RNase H </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per 1 ml (ml) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Fase 2.1: Acqua wacrilamide lineare esimo </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per 1 ml di tampone (ml) </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 992 </td></tr><tr><td> acrilammide lineare (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 2.2: reazione di ibridazione per la deplezione selettiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> 5x Tampone di ibridazione </td><td> 2 </td></tr><tr><td> oligo mix rRNA-esaurimento (100 micron) </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td> Oligo (d) T (550 ng / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNasi trattati RNA totale </td><td> fino a 5 </td></tr><tr><td> Spike-in RNA (questo è facoltativo) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Acqua (con acrilammide lineare) </td><td> portare fino a 10 in totale </td></tr><tr><td> volu totaleme </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 2.3: RNase H reazione per deplezione selettiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> 10x RNase H tampone di reazione </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Acqua (con acrilammide lineare) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termostabile RNase H (5 U / ml) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 2.4: messaggio reazione DNasi deplezione selettiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> 10x DNase Buffer </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Acqua (con acrilammide lineare) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> inibitore RNasi (20 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNasi RNasi-free I (2.72 U / ml) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Volume totale (con reazione RNasi H) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 3.1: sintesi del DNA, Primer casuale ibridazione </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> rRNA / RNA carrier-impoverito </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 mg di primer casuale </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Fase 3.2: Primo aspetto reazione di sintesi del DNA </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> 5x First-Strand tampone di reazione </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> mix 10 mM dNTP </td><td> 1 </td></tr><tr><td> inibitore RNasi (20 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> trascrittasi inversa (aggiungere ultima) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume totale (con l&#39;RNA sopra) &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 3.3: Secondo aspetto reazione di sintesi del DNA </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> acqua priva di RNasi </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x tampone di reazione seconda Strand </td><td> 8 </td></tr><tr><td> mix 10 mM dNTP </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. coli DNA Ligase (10 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> E. coli DNA polimerasi I (10 U / ml) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E. coli RNase H (2 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume totale (con 1 ° reazione filo) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Fase 4.2: reazione Tagmentation </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> Amplicon Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNA Buffer (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Volume totale (con cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Passo 4.3: reazione Biblioteca PCR </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (NPM) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Indice 1 Primer (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Indice 2 Primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Volume totale (con tagmented cDNA) </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Punto 4.3.2: condizioni di PCR Biblioteca </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 min </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> fino a 18 cicli a 10 sec a 95 ° C, 30 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 min </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, per sempre </td><td></td></tr></tbody></table>Tabella 1:. Reazione di set-up e buffer Step-by-Step tabelle con contenuto di tutti i buffer e miscele di reazione. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligo Nome </td><td> Sequenza (5 &#39;a 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola Kulesh FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola Kulesh RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tin grado&gt; Tabella 2: qRT-PCR Primer sequenze primer utilizzati per la misurazione host (18S rRNA) e virali contenuti (Ebola e Lassa).. &#39;KGH&#39; è Hospital Kenema governo in Sierra Leone, dove i primer di Ebola sono stati testati 2. &#39;Kulesh&#39; è il ricercatore che ha progettato il primer set 14. Tabella 3: RNA ribosomiale (rRNA) Depletion Oligos 195 lunghe sequenze di 50 nucleotidi complementari per rRNA umana per passo deplezione selettiva 6.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive un metodo rapido e ampiamente applicabile per il sequenziamento imparziale dell'RNA di campioni virali da isolati clinici umani.

Imparziale sequenziamento profondo di RNA virus da campioni clinici

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare librerie di sequenziamento di virus a RNA direttamente da campioni clinici, al fine di consentire studi di sorveglianza virale ed evolutivi. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nei campi della genomica e dell'evoluzione virale, come ad esempio in che modo i virus a RNA mutano all'interno e tra diversi ospiti e come si diffondono all'interno di una popolazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è priva di bias.Non richiede alcuna conoscenza pregressa della sequenza virale per la preparazione della libreria e può essere utilizzata per sequenziare qualsiasi virus. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al rilevamento e al contrasto delle malattie virali come la febbre di Lassa, poiché i test diagnostici e i trattamenti terapeutici che sviluppiamo dipendono fondamentalmente dalla sequenza genomica del virus. A dimostrare l'esaursione selettiva sarà Adrianne Gladden.La sintesi di CDNA sarà dimostrata da Sarah Winnicki. La costruzione della libreria di DNA sarà dimostrata da Dolo Nosamiefan. Per iniziare, preparare i tamponi di ibridazione 5X e di reazione della RNasi H 10X in acqua priva di nucleasi con carrier di acrilamide lineare come descritto nella tabella uno del protocollo testuale.In una piastra PCR a 96 pozzetti posizionata su un blocco metallico in ghiaccio, preparare la reazione di ibridizzazione mescolando l'RNA virale precedentemente estratto e trattato con DNasi con gli oligo per l'esaurimento dell'RNA ribosomiale e gli oligo(dT). Notare che tutte le reazioni di questo protocollo vengono preparate e distribuite in strip tube per l'uso con una pipetta multicanale. Vortexare delicatamente ma completamente la reazione, quindi centrifugare a 280 ×g e temperatura ambiente per un minuto.Incubare a 95 gradi Celsius per due minuti, quindi ridurre lentamente la temperatura fino a 45 gradi Celsius a una velocità di -0,1 grado Celsius al secondo. Successivamente, mettere in pausa il termociclatore a 45 gradi Celsius. Preparare una miscela di reazione per la RNasi H in un blocco metallico su ghiaccio, quindi preriscaldare la soluzione a 45 gradi Celsius per due minuti.Con la piastra a 96 pozzetti ancora nel termociclatore a 45 gradi Celsius, aggiungere la miscela di RNase H preriscaldata alla reazione di ibridazione. Mescolare accuratamente pipettando delicatamente da sei a otto volte, quindi incubare a 45 gradi Celsius per altri 30 minuti prima di porre la piastra sul ghiaccio. Successivamente, preparare la miscela per la reazione con DNasi in un blocco metallico sul ghiaccio come descritto nella tabella uno del protocollo testuale.Aggiungere la miscela alla reazione di RNase H nella piastra. Vortexare delicatamente e accuratamente, quindi centrifugare a 280 ×g e temperatura ambiente per un minuto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi aggiungere cinque microlitri di EDTA 0,5 molar per arrestare la reazione.Dopo aver agitato delicatamente e accuratamente la piastra con un vortex, centrifugare a 280 × g e a temperatura ambiente per un minuto. Utilizzare un volume pari a 1,8X di perle per RNA per purificare la reazione seguendo le indicazioni del produttore ed eluire in 11 microlitri di acqua priva di nucleasi. Conservare i campioni di RNA impoverito a meno 80 gradi Celsius durante la notte.È necessario prestare particolare attenzione in questo passaggio, poiché potrebbero verificarsi perdita o degradazione del campione. Per eseguire la sintesi di CDNA, in una piastra PCR a 96 pozzetti posizionata su un blocco metallico in ghiaccio, mescolare l'RNA privo del carrier di RNA ribosomiale con primer casuali secondo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver agitato delicatamente e centrifugato la piastra, riscaldare la miscela in un termociclatore a 70 gradi Celsius per dieci minuti.Immediatamente dopo la denaturazione termica, posizionare l'RNA in un blocco metallico su ghiaccio per uno a cinque minuti. Successivamente, dopo aver preparato il mix di reazione per la sintesi del primo filamento, aggiungerlo al mix di primer casuale per l'RNA nella piastra. Quindi, dopo aver agitato e centrifugato, incubare a 22-25 gradi Celsius per dieci minuti.Incubare la piastra a 55 gradi Celsius in un incubatore ad aria per 60 minuti. Successivamente, posizionare la piastra su un blocco di metallo posto sul ghiaccio per terminare la reazione. Preparare ora la miscela per la sintesi del secondo filamento e aggiungerla alla reazione di sintesi del primo filamento nella piastra.Dopo aver vortexato e centrifugato come in precedenza, incubare la reazione a 16 gradi Celsius per due ore. Posizionare la piastra in un blocco di metallo su ghiaccio, quindi inattivare la reazione aggiungendo cinque microlitri di EDTA 0,5 M, mescolare e centrifugare come in precedenza. Pulire la reazione utilizzando un volume 1,8X di perle di DNA ed eluire i campioni con nove microlitri di tampone di eluizione o EB.Conservare un microlitro per la quantificazione. Per una conservazione a freddo sicura, conservare il CDNA a doppio filamento a 4 gradi Celsius durante la notte oppure a meno 20 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine. Per costruire una libreria di DNA, trasferire quattro microlitri di CDNA in una piastra a 96 pozzetti e conservare il CDNA rimanente per un secondo tentativo di rilevamento, se necessario.Preparare la reazione di tagmentazione, come descritto nella tabella uno del protocollo testuale, utilizzando un blocco di metallo su ghiaccio. Quindi aggiungere la miscela al cDNA nella piastra a 96 pozzetti. Dopo aver vortexato e centrifugato, incubare la piastra a 55 gradi Celsius per cinque minuti, quindi mantenerla a 10 gradi Celsius.Una volta raggiunti i 10 gradi Celsius, aggiungere immediatamente 2,5 µL di tampone di tagmentazione neutralizzato per terminare la reazione. Dopo aver centrifugato la piastra a 280 ×g e a temperatura ambiente per un minuto, incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. A questo punto, preparare la reazione di amplificazione PCR su un blocco metallico posto sul ghiaccio come descritto nel protocollo testuale.Dopo aver agitato con il vortex e centrifugato la piastra, eseguire la PCR. Per preparare la libreria, utilizzare EB per portare i campioni a 50 microlitri. Utilizzando un volume 0,6X di perle di DNA, purificare la reazione ed eluire in 15 microlitri di EB. Unire le librerie alla concentrazione molare più bassa di un nanomolare o superiore.Se la libreria è inferiore a un nanomolare, aggiungere un piccolo volume di libreria al pool. Infine, utilizzare un volume pari a 0,7X di perle di DNA per purificare il pool, come descritto in precedenza nel video, quindi eluire i campioni con 15 microlitri di EB. Analizzare seguendo il protocollo descritto nel testo.Come mostrato qui, il protocollo descritto in questo video ha arricchito il contenuto unico del virus Lassa di almeno cinque volte in tutti i campioni con almeno un milione di copie di RNA ribosomiale 18S. Questo grafico illustra come la riduzione del carrier poli(rA) abbia diminuito le sequenze omopolimeriche di A e T nelle librerie, portando a preparazioni più pulite e garantendo letture di sequenziamento di qualità superiore. Infine, questa figura dimostra che le librerie finali ottenute da campioni clinici virali con quantità ridotte di materiale presentano spesso un ampio spettro di frammenti compresi tra 150 e 1000 paia di basi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la maggior parte dei campioni clinici contiene una quantità molto ridotta di materiale nucleico. Pertanto, la perdita di campione, la contaminazione e il degrado dell'RNA sono fenomeni comuni.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come RNA seek per rispondere a ulteriori domande, ad esempio in che modo l'organismo ospite risponde all'infezione virale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della sorveglianza virale per tracciare i percorsi di trasmissione di virus come Ebola e Lassa, e di altri patogeni circolanti nell'Africa occidentale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare librerie di sequenziamento per virus a RNA direttamente da campioni clinici, consentendo studi di sorveglianza virale ed evoluzionistici.Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni virali può essere estremamente pericoloso. Precauzioni come l'uso di idonei dispositivi di protezione individuale e il rispetto delle norme relative al livello di biosicurezza devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Qui vi presentiamo un nuovo approccio per identificare virus vegetali con genomi di DNA double-strand. Usiamo metodi standard per estrarre RNA e DNA da foglie infette e svolgere il sequenziamento di nuova generazione. Strumenti bioinformatici assemblare sequenze in contigs, identificano contigs che rappresenta il genoma del virus e assegnano genomi a gruppi tassonomici.

Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi

Il sequenziamento di nanopore è una nuova tecnologia che consente un sequenziamento conveniente in posizioni remote e impostazioni di scarsa risorse. Qui, presentiamo un protocollo per il sequenziamento di mRNA da sangue intero che è compatibile con tali condizioni.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

In precedenza abbiamo convalidato un protocollo per il sequenziamento del virus USsutu intero genoma basato sull'amplicon (USUV) su una piattaforma di sequenziamento nanoporo. Qui, descriviamo i metodi utilizzati in modo più dettagliato e determiniamo il tasso di errore della cella di flusso nanopora R10.

Convalida del sequenziamento dei nanopore dell'intero genoma, usando Usutu Virus come esempio

Un progetto di citizen science è stato progettato per reclutare residenti a San Diego per raccogliere campioni ambientali per SARS-CoV-2. È stata creata una piattaforma multilingue basata sul Web per l'invio dei dati utilizzando un'interfaccia di dispositivo mobile intuitiva. Un sistema di gestione delle informazioni di laboratorio ha facilitato la raccolta di migliaia di campioni geograficamente diversi con il monitoraggio dei risultati in tempo reale.

Tamponare l'ambiente urbano - Una pipeline per il campionamento e il rilevamento della SARS-CoV-2 dai bacini ambientali

Questo protocollo mira a quantificare l'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria da utilizzare per studi epidemiologici basati sulle acque reflue e a valutare il rischio di esposizione a SARS-CoV-2 in aerosol interni ed esterni. Questo protocollo descrive anche un approccio di sequenziamento a modello lungo dell'amplicone piastrellato per la caratterizzazione dell'intero genoma di SARS-CoV-2.

Quantificazione e caratterizzazione dell'intero genoma dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria

Qui, presentiamo un flusso di lavoro rapido ed economico per la caratterizzazione dei genomi del virus della rabbia (RABV) utilizzando la tecnologia dei nanopori. Il flusso di lavoro ha lo scopo di supportare la sorveglianza basata sulla genomica a livello locale, fornendo informazioni sui lignaggi RABV circolanti e sul loro posizionamento all'interno delle filogenesi regionali per guidare le misure di controllo della rabbia.

Sequenziamento dell'intero genoma per una rapida caratterizzazione del virus della rabbia utilizzando la tecnologia Nanopore

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Questo protocollo dimostra il test della reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) in tempo reale della trascrizione inversa del pan-lyssavirus LN34 dalla raccolta dei tessuti all'interpretazione dei risultati, compresi gli aggiornamenti alle sequenze e alle formulazioni dei primer per migliorare le prestazioni del test per alcuni lissavirus e lagomorfi non antirabbici. Dimostriamo anche la configurazione del saggio per un formato multiplex LN34 a pozzetto singolo (LN34M).

Diagnosi post-mortem della rabbia negli animali mediante il test di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale LN34 aggiornato e multiplexato

Impara a preparare librerie di sequenziamento per virus RNA da campioni clinici con deplezione selettiva dell'RNA. Questo metodo imparziale consente l'assemblaggio de novo e l'analisi delle varianti per la sorveglianza virale.

Imparziale sequenziamento profondo di RNA virus da campioni clinici

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