Sintesi della lunghezza d'onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare il trasferimento di energia da un filamento di DNA modificato con colorante all'altro. Questo metodo può aiutare a rispondere alle questioni chiave nel campo della biologia molecolare. Come l'interferenza dell'RNA monitorando l'elaborazione e l'integrità dei siRNA nelle cellule viventi in tempo reale.

Il vantaggio principale di questa tecnica, è la facilità di monitorare la portata della fioritura e il cambiamento di colore, dando un risultato chiaro. Quindi i risultati falsi positivi vengono eliminati. Per iniziare questa procedura, aggiungere gli appositi reagenti come indicato nel protocollo di testo a un pallone da 20 millilitri, a fondo tondo, dotato di ancoretta magnetica e condensatore a riflusso.

Quindi, aggiungere zero virgola zero sei millilitri di piperidina. E scaldare la miscela di reazione a 80 gradi Celsius per quattro ore. Dopo che la reazione si è raffreddata a temperatura ambiente, raccogliere il precipitato risultante mediante filtrazione.

E lavare con etere etilico tre volte. Quindi, aggiungi cento millilitri di etere etilico al surnatante. E raccogliere il precipitato risultante mediante filtrazione.

Dopo aver lavato tre volte con etere etilico, combinare il precipitato con il solido isolato dalla prima filtrazione. Utilizzando il computer, collegato a un sintetizzatore di DNA, inserire la sequenza di DNA desiderata e il metodo di accoppiamento. Seguendo le istruzioni del protocollo del produttore.

Successivamente, montare nel sintetizzatore la colonna contenente il vetro a colata controllata, che viene modificato con una micro mole della prima faccia. Ora, inizia la sintesi sul sintetizzatore di DNA. Dopo l'analisi dei filamenti di DNA, aggiungere i reggenti appropriati come indicato nel protocollo di testo al campione di alchino dietilizzato, DNA modificato.

Incubare il campione a 60 gradi Celsius per un punto cinque ore. Quindi, trasferire il campione in una provetta da 10 millilitri. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, aggiungere al campione di DNA 150 microlitri di una soluzione di sale disodico EDTA a cinque molari zero e 450 microlitri di una soluzione di acetato di sodio a tre molari zero virgola zero.

Successivamente, aggiungere 10 millilitri di etanolo al campione. E mantienilo a meno 32 gradi Celsius per 16 ore. Quindi, centrifugare il campione per 15 minuti a mille volte G.Al termine, rimuovere il surnatante.

Lavare il pellet di DNA risultante con due millilitri di etanolo freddo all'80%. Quindi asciugare il pellet a pressione ridotta utilizzando un liofilizzatore. Purificare il pellet di DNA grezzo con HP LC.Monitorare la corsa controllando 260 nanometri e 459 nanometri per Dye one.

O 542 nanometri per Dye two. Raccogli le frazioni che mostrano assorbimento in entrambi i canali di lunghezza d'onda. Per le misure di spettroscopia di assorbimento a filamento singolo, registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 millimolari di cloruro di sodio e 50 millimolari di tampone fosfato di sodio.

Quindi, trasferire la soluzione di DNA1 precedentemente preparata in una cuvetta di vetro al quarzo di un centimetro. Registrare l'assorbimento. Quindi determinare il valore massimo di assorbimento del colorante.

Per le misure di spettroscopia fluorescente a filamento singolo, registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 millimolari di cloruro di sodio e 50 millimolari di fosfato di sodio, utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione di Dye one. Successivamente, posizionare la cuvetta con la soluzione DNA1 nello spettrometro. Registra lo spettro di florescenza.

Per eseguire la misurazione della spettroscopia fluorescente a doppio filamento, posizionare la cuvetta con il doppio filamento di soluzione di DNA1 e DNA2 nello spettrometro. Quindi registrare lo spettro fluorescente utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione di Dye one. Per ottenere una migliore comprensione di ciò che mostrano gli spettri registrati, irradiare le cuvette con lampade UV portatili.

Osservare il cambiamento di colore della fioritura dal DNA a singolo filamento a quello a doppio filamento. Gli spettri di assorbimento registrati mostrano i massimi a 465 nanometri per il DNA a singolo filamento1 e a 546 nanometri per il DNA a singolo filamento2. Il doppio filamento ricotto di DNA1 e DNA2 mostra massimi sia a 469 che a 567 nanometri.

Entrambi i massimi di assorbimento mostrano uno spostamento bathaohromico. E i più piccoli cambiamenti spettroscopici sono il risultato di interazioni eccitoniche tra i coloranti all'interno dell'architettura del DNA a doppia elica. I corrispondenti spettri fluorescenti mostrano un massimo a 537 nanometri per il DNA a singolo filamento1.

A 607 nanometri per DNA a singolo filamento2. E a 615 nanometri per il doppio filamento ricotto di DNA1 e DNA2. Il doppio filamento di DNA1 e DNA2, mostra solo il massimo di emissione del colorante due, sebbene il colorante uno sia eccitato selettivamente, il che evidenzia che il trasferimento di energia avviene in modo efficiente dal colorante uno al colorante due.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modificare sinteticamente il DNA mediante una reazione catalitica di coppia di un filamento di DNA marcato con alchino con un lato A.