Name: Sintesi della lunghezza donda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Scopri la sintesi di sonde DNA dual-label con cianine fotostabili per studi di trasferimento energetico. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale dell'ibridazione mediante cambio di colore fluorescente.

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Il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la ricerca di formazione Gruppo GRK 2039 (finanziato dalla DFG) e kit ringraziano.

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell&#39;uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate che sono tipicamente richiesti nei laboratori di chimica organica, come ad esempio indossare un camice da laboratorio, occhiali e guanti. 1. Sintesi dei coloranti Nota: Le due coloranti possono essere sintetizzati dagli stessi tipi di reazione Figura 2 mostra una panoramica di queste reazioni.. <ol><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io ioduro (dye 1) <ol><li> Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro (Figura 2A, passaggio a) <ol><li> Sciogliere 466 mg 4-picolina e 5,91 g di 1,3-diiodopropano in 10 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flacone 20 ml e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 20 ml di etile acetato per l&#39;olio residuo e trattare la miscela in un bagno ad ultrasuoni W 120 per 3 min. </li><li> Raccogliere il precipitato formatosi mediante filtrazione e lavare cinque volte con acetato di etile. Essiccare il prodotto solido sottovuoto O / N. </li></ol></li><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-io (Figura 2A, fase b) <ol><li> Sciogliere 900 mg 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro in 12 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flaconcino 20 ml, aggiungere 376 mg di sodio azide, e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 15 ml di diclorometano al residuo. </li><li> Filtrare fuori e scartare il precipitato risultante. </li><li> Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un rotevaporatore ary per ottenere il prodotto come olio bruno. </li></ol></li><li> Sintesi di 1-metil-1H-indol-3-carbaldeide (Figura 2A, fase c) <ol><li> Sotto gas inerte (argon), sciogliere 1,45 g indolo-3-carbaldeide, carbonato di potassio 1,52 ge 2,70 g dimetil carbonato in 10 ml di dimetilformammide assoluta in 50 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo. </li><li> Mescolare la miscela a 130 ° C per 19 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, poi versate il composto sul ghiaccio. </li><li> Estrarre la fase acquosa tre volte con acetato di etile 150 ml. </li><li> Combinare gli strati organici, lavarli con acqua, asciugarli su solfato di sodio e rimuovere il solvente a 50 ° C sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li></ol></li><li> Accoppiamento di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io ioduro (dye 1) (Figura 2A, fase d) <ol><li> Lavorare sotto argon e con esclusione di umidità. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-io e 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldeide in 4 ml di etanolo in 20 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo. </li><li> Aggiungere 0,07 ml piperidina e si riscalda a 80 ° C per 4 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il precipitato per filtrazione e lavare tre volte con dietiletere. </li><li> Aggiungere dietiletere al surnatante e raccogliere il precipitato per filtrazione. Lavare tre volte con etere etilico. </li><li> Unire i precipitati. </li></ol></li></ol></li><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) idrossi-1-io ioduro (dye 2) <ol><li> Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro (Figura 2B, il passaggio a) <ol><li> Sciogliere 715 mg 4 methylquinoline e 5,91 g di 1,3-diiodopropano in 10 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flacone 20 ml e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Calorea 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 20 ml di etile acetato per l&#39;olio rimanente e trattare la miscela in un bagno ad ultrasuoni W 120 per 3 min. </li><li> Raccogliere il precipitato formatosi mediante filtrazione e lavare cinque volte con acetato di etile. Essiccare il prodotto solido sottovuoto O / N. </li></ol></li><li> Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-io (Figura 2B, fase b) <ol><li> Sciogliere 900 mg 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro in 12 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flaconcino 20 ml, aggiungere 333 mg di sodio azide, e sigillare ermeticamente da un tappo setto. </li><li> Riscaldare a 85 ° C per 16 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Aggiungere 15 ml di diclorometano al residuo. </li><li> Filtrare fuori e scartare il precipitato risultante. </li><li> Rimuovere la u solventender pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante per ottenere il prodotto come olio bruno. </li></ol></li><li> Sintesi di 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide (Figura 2B, la fase c) <ol><li> Sotto gas inerte (argon), sciogliere 1,45 g di 2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide, carbonato di potassio 0,996 ge 1,77 g dimetil carbonato in 10 ml di dimetilformammide assoluta in 50 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo. </li><li> Mescolare la miscela a 130 ° C per 19 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a RT, poi versate il composto sul ghiaccio. </li><li> Estrarre la fase acquosa tre volte con acetato di etile 150 ml. </li><li> Combinare gli strati organici, lavarli con acqua, asciugarli su solfato di sodio e rimuovere il solvente a pressione ridotta usando evaporatore rotante. </li></ol></li><li> Accoppiamento di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-2-phe NYL-1H-indol-3-il) vinil) idrossi-1-io ioduro (Figura 2B, fase d) <ol><li> Lavorare sotto argsopra e sotto l&#39;esclusione di umidità. Disciogliere 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-io e 59,7 mg 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide in 4 ml di etanolo in 20 ml pallone a fondo tondo dotato di condensatore a riflusso. </li><li> Aggiungere 0,06 ml piperidina e si riscalda a 80 ° C per 4 ore. </li><li> Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il precipitato per filtrazione e lavare con dietiletere tre volte. </li><li> Aggiungere dietiletere al surnatante e raccogliere il precipitato per filtrazione. Lavare tre volte con etere etilico. </li><li> Unire i precipitati. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sintesi dei filamenti di DNA Nota: La sintesi dei filamenti di DNA viene effettuata con il metodo fosforammidito su una fase solida, come descritto da M. Caruthers 11 su un sintetizzatore di DNA. Il funzionamento del sintetizzatore viene testato prima della procedura di sintesi e reagenti si rinnovano senecessario. <ol><li> predisposizioni <ol><li> Sciogliere il disponibile in commercio 2&#39;-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) in 1,2 ml di diluente amidite (acetonitrile extra dry). Spostare soluzione nel flaconcino di una fiala sintetizzatore e avvitare in sintetizzatore. </li><li> Eseguire un &quot;test di tenuta&quot; (secondo le istruzioni del produttore) per assicurarsi che non esiste alcuna fuga di gas argon. Se la &quot;prova di tenuta&quot; fallisce, avvitare il flacone più strettamente. </li><li> Prime soluzione cU riempiendo il tubo che collega la camera di sintesi in fase solida. </li><li> Lavare tutte le linee con acetonitrile. </li></ol></li><li> Sintesi di filamenti di DNA <ol><li> Usare il computer collegato ad entrare nel metodo di sequenza del DNA e l&#39;accoppiamento, seguendo le istruzioni dal protocollo del produttore. La fase di accoppiamento del blocco di costruzione cU prende 168 secondi con 7 impulsi (ogni impulso sono 16 ml) rispetto a 40 sec con 7 impulsi per una convenzionalePhosphoramidite come blocchi di costruzione. </li><li> Montare la colonna contenente la CPG (vetro pori controllata) come fase solida che viene modificato con 1 mol della prima base (sintesi del DNA viene eseguita da 3 &#39;a 5&#39;) nel sintetizzatore. </li><li> Avviare la sintesi sul sintetizzatore di DNA 11. </li></ol></li><li> Workup di filamenti di DNA sintetizzati <ol><li> Asciugare le colonne con i filamenti di DNA sintetizzati sotto vuoto O / N. </li><li> Utilizzare una pinza per aprire la colonna e rilasciare il CPG in una fiala di reazione. Aggiungere 700 ml di soluzione di ammoniaca acquosa concentrata al deproteggere l&#39;oligonucleotide e rilasciare il filamento di DNA dal CPG. </li><li> Chiudere la fiala e applicare un coperchio di sicurezza sul recipiente di reazione per evitarne la rottura, e si riscalda a 50 ° C per 18 ore. </li><li> Rimuovere ammoniaca mediante centrifugazione a pressione ridotta (100 mbar) a 30 ° C per 30 min. </li><li> Inizia filtrazione da CPG: nave Centrifugare a 11.000 xg for 3 min. Prendere supernatante e trasferirlo in un dispositivo centrifuga con dimensione dei pori di 0,45 micron. Centrifugare a 1000 xg per 4 min. </li><li> Nel frattempo aggiungere 300 ml di acqua distillata al doppio CPG, vortex per 20 secondi e centrifugare a 11.000 xg per 3 min. Trasferire il surnatante nel dispositivo centrifuga e centrifugare a 1000 xg per 4 min. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua dalle soluzioni acquose riunite per centrifugazione a 0,1 mbar e 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. Procedura &quot;Cliccando&quot; <ol><li> Aggiungere 50 ml di acqua bidistillata, 25 ml di una soluzione di ascorbato di sodio (0,4 M in acqua), 34 microlitri tris - [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ml di azide (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) e 17 ml di un tetrakis (acetonitrile) di rame (I) soluzione esafluorofosfato (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) al campione di DNA alchino-modificato liofilizzato. </li&gt; <li> Incubare il campione a 60 ° C per 1,5 ore. </li><li> Raffreddare a RT. </li><li> Aggiungere 150 microlitri Na 2 EDTA (0,05 M in acqua) e 450 ml di acetato di sodio (0,3 M in acqua) per il campione di DNA e trasferimento in una provetta da 10 ml. </li><li> Aggiungere 10 ml di etanolo (100%) e mantenerlo a -32 ° C per 16 ore. </li><li> nave Centrifugare per 15 minuti a 1000 xg e rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare DNA pellet con 2 ml di etanolo freddo (80%). </li><li> pellet secco sotto pressione ridotta. </li></ol> 4. HPLC Purificazione Nota: Prima di separare i filamenti di DNA assicurarsi che l&#39;HPLC funziona correttamente, abbastanza solvente è disponibile e la colonna è pulito. Lavare colonna con la concentrazione iniziale di tampone / acetonitrile. <ol><li> Sciogliere il greggio DNA pellet in 250 ml di acqua bidistillata e trasferimento in una fiala HPLC. </li><li> Inizia HPLC run di 45 min con un gradiente di 0% acetonitrile al 15% di acetonitrile per tinture 1 e gradi<html> ento di 0% acetonitrile al 17% di acetonitrile per tintura 2. Monitorare la corsa controllando 260 nm (assorbimento DNA) e 459 nm (dye 1) o 542 nm (dye 2). Raccogliere quelle frazioni che mostrano assorbimento in entrambi i canali di lunghezza d&#39;onda. </li><li> Controllare le frazioni raccolte per la messa destra matrice assistito ionizzazione desorbimento laser (MALDI) spettrometria di massa utilizzando una matrice costituita da 3 hydroxypicolinic acido (3 hPa) e diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Preparare la matrice mescolando 900 ml di una soluzione satura di 3 HPA in 1: 1 miscela di acetonitrile e acqua con 100 ml di una soluzione diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) in acqua. </li><li> Pipetta 1-2 ml di sonda DNA sul bersaglio e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di matrice 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate al campione e mescolare fino cristallizza. </li><li> Eseguire la spettrometria di massa MALDI. </li><li> Unire le frazioni HPLC che presentano la massa a destra. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. determinazione della concentrazione Nota: La concentrazione viene determinata misurando l&#39;assorbimento a 260 nm usando un UV / Vis spettrofotometro, sulla base dei coefficienti di estinzione (ε 260) delle basi del DNA e il colorante. <ol><li> Sciogliere il DNA in 100 - 200 ml di acqua bidistillata. </li><li> Applicare 1 ml di soluzione di DNA in UV / Vis spettrofotometro. </li><li> Misurare l&#39;assorbimento a 260 nm. Ripetete tre volte. </li><li> Prendere il valore medio per calcolare la concentrazione della soluzione. Per il calcolo dei coefficienti di estinzione, utilizzare ε 260nm delle quattro basi naturali 12 e 260 nm ε della CU blocco acquistato (considerato come uridina naturale) 12 per ottenere l&#39;260nm ε dell&#39;intero filamento di DNA. Per tintura 1, uso ε 260 nm = 10,200 L * mol -1 * cm -1 e tintura 2, l&#39;uso ε 260 nm = 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Calcolare la concentrazione della soluzione seguente legge di Lambert-Beers &#39;sulla base dei coefficienti di estinzione e assorbanze misurate. 13 </li></ol> 6. Preparazione del campione e Spettroscopia <ol><li> Preparazione dei campioni singolo filamento <ol><li> Preparare separatamente 1 ml di 2,5 uM soluzioni di ciascuno degli DNA1 modificato e DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i buffer, pH = 7. </li></ol></li><li> Preparazione dei campioni doppio filamento <ol><li> Preparare 1 ml di una soluzione contenente 2,5 mM di DNA1 e 2,5 mM di DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7 in un recipiente di reazione. </li><li> Fissare il coperchio con un tappo di sicurezza e di calore a 90 ° C per 10 min. Quindi spegnere il riscaldamento e lasciar raffreddare fino a RT O / N. </li></ol></li><li> spettroscopia di assorbimento Nota: per determinare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione per la specifica di fluorescenzaspettri di assorbimento troscopy sono registrati. <ol><li> Misurazioni singole Strand <ol><li> Registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7. </li><li> Trasferire la soluzione preparata di DNA1 in vaschetta da 1 cm vetro di quarzo e registrare l&#39;assorbimento. Correggere la misurazione con i dati vuoti. Determinare il valore massimo di assorbimento colorante. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> spettroscopia di fluorescenza <ol><li> Misurazioni singole Strand <ol><li> Registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7; utilizzando la lunghezza d&#39;onda di eccitazione di colorante 1. </li><li> Trasferire la soluzione DNA1 in vaschetta da 1 cm vetro di quarzo. </li><li> Registrare lo spettro di fluorescenza. </li></ol></li><li> Misurazione doppio filamento <ol><li> Trasferire la soluzione a doppio filamento in una provetta di vetro di quarzo. </li&gt; <li> Registrare lo spettro di fluorescenza utilizzando la lunghezza d&#39;onda di eccitazione di colorante 1. </li></ol></li></ol></li><li> esperimenti di visualizzazione Attenzione: la protezione degli occhi adeguata dovrebbe essere indossato per evitare danni UV per gli occhi! <ol><li> Per ottenere una migliore comprensione di ciò che gli spettri registrati stanno mostrando, irradiare le cuvette con palmare lampade UV (Figura 5). Osservare il cambiamento di colore di fluorescenza dal singolo al DNA a doppio filamento. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo mostra la procedura completa di etichettare DNA post-sinteticamente tramite CuAAC dai coloranti fluorescenti azide modificati. Questo include la sintesi dei coloranti e il DNA alchino modificato così come la procedura di etichettatura. La sintesi dei coloranti segue quattro fasi. Tutti i prodotti possono essere ottenuti da un piuttosto semplice precipitazione causa della loro carica positiva e non è necessaria tempo cromatografia su colonna. L&#39;introduzione delle funzion...

Imaging molecolare rappresenta una tecnica fondamentale per la comprensione dei processi biologici all&#39;interno delle cellule viventi. 1-3 Lo sviluppo di fluorescenti sonde base di acido nucleico per tali applicazioni chimico-biologico è diventato un campo di ricerca in espansione. Queste sonde fluorescenti devono soddisfare alcuni requisiti per diventare strumenti adatti per l&#39;imaging cellulare. In primo luogo, i coloranti applicati devono mostrare fluorescenza con elevati rendimenti quantici, turni grande Stokes &#39;e, soprattutto, di alta photostabilities per consentire a lungo termine imaging in vivo. E in secondo luogo, essi dovrebbero mostrare una lettura di fluorescenza affidabile. Convenzionale cromoforo-quencher sistemi si basano sulla lettura di un singolo colore di fluorescenza con semplici cambiamenti di intensità di fluorescenza. 4 Questo approccio si assume il rischio di risultati falsi positivi o falsi negativi a causa di autofluorescenza di componenti intracellulari o bassi rapporti segnale-rumore a causa di quenching indesiderato da altri comcomponenti. 4 Recentemente abbiamo riportato sul concetto di &quot;semafori DNA&quot; che mostrano doppio letture colore fluorescenza utilizzando due cromofori differenti. 5-6 Il concetto è basato sul trasferimento di energia (ET) dalla tintura donatore al colorante accettore che cambia la fluorescenza colore (vedi Figura 1). Questo consente una lettura più affidabile e quindi fornisce un potente strumento per sonde di imaging fluorescenti. Etichettatura di oligonucleotidi con coloranti fluorescenti può essere ottenuto mediante due approcci diversi. Coloranti possono essere incorporati durante la sintesi del DNA chimica su una fase solida utilizzando blocchi fosforammidito corrispondentemente modificati. 7 Questo metodo è limitato ai coloranti che sono stabili in condizioni Phosphoramidite e deprotezione standard. In alternativa, le metodologie di modificazione post-sintetici sono stati stabiliti in oligonucleotide chimica. Qui, dimostriamo la sintesi di una delle nostre nuove fotoenergia tabella coppie di trasferimento 8,9 e l&#39;etichettatura di post-sintetico del DNA utilizzando rame-catalizzata 1,3-cicloaddizione tra azidi ed alchini (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4"><sintesi>forte</forte></td></tr><tr><td>4-Picolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>grado tecnico</td>Fisher Scientific</tr><tr><td>Azoturo</td> <td>di sodioSigma Aldrich</td><td>71290</td> diclorometano di <td>grado p.a.</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>grado tecnico</td></tr><tr><td>indolo-3-carbossaldeide; 98%</td> <td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>carbonato di potassio, 99+%</td> <td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimetilcarbonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformammide, 99,8%, Extra secco su setaccio molecolare</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623,46</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 99,5%</td> <td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidina, 99%</td> <td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Dietiletere</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>grado tecnico</td></tr><tr><td>2-fenilindo-3-carbossaldeide; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-metilchinolina</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DNA synthesis</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Sintetizzatore di acidi nucleici</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Phosphoramidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Fosforamidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Fosforamidite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Diluente amidite per la sintesi del DNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile ultrapuro per la sintesi del DNA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich L840000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Colonna 1.0&nbsp; &micro; mole</td><td>Proligo Reagenti</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Colonna 1.0&nbsp; &micro; mole</td><td>Proligo Reagents</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Colonna 1.0&nbsp; &micro; mole</td><td>Proligo Reagenti</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Colonna 1.0&nbsp; &micro; mole</td><td>Proligo Reagenti</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>ammoniaca (soluzione acquosa)&nbsp;</td><td>Fluka Dispositivi analitici</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>centrifughi nanosep 0.45&nbsp; &micro; m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazolo (Attivatore)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td><td>Chem Genes</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">workup</td></tr><tr><td>vacuum concentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clicking procedure </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitrile)rame(I) esafluorofosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodio L-ascorbato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sale disodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligando</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>sintetizzato secondo una procedura di letteratura1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spettrometro</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 colonna</td><td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">determinazione della concentrazione</td></tr><tr><td>ND 1000 Spettrofotometro</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">preparazione del campione e spettroscopia</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3</td><td>fluorimetro Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting dna sonde di ibridazione utilizzando fotostabile cyanine coloranti

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In questo protocollo, dimostriamo un metodo per la sintesi di 2&#39;-alchino modificato acido (DNA) trefoli nucleici di sintesi in fase solida utilizzando la chimica automatizzata fosforamidite standard. Oligonucleotidi sono post-sinteticamente etichettate da due nuove tinte cianina fotostabili utilizzando rame-catalizzata click-chimica. La sintesi di dye donatore e accettore è descritto ed avviene in tre fasi consecutive. Con il DNA come l&#39;architettura circostante, questi due coloranti subiscono un trasferimento di energia quando vengono portati in stretta prossimità mediante ibridazione. Pertanto, ricottura di due singoli filamenti di DNA bloccati viene visualizzato da un cambiamento di colore di fluorescenza. Questo cambiamento di colore è caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza, ma può anche essere osservato direttamente utilizzando una lampada ultravioletta palmare (UV). Il concetto di una doppia lettura di fluorescenza di colore rende questi sonde oligonucleotidiche ottimi strumenti per l&#39;imaging molecolare soprattutto quando il pho descrittocoloranti tostable vengono utilizzati. In tal modo, photobleaching delle sonde di imaging è impedito, e processi biologici può essere osservato in tempo reale per un periodo di tempo più lungo.

Assorbimento e spettri di fluorescenza del DNA a singolo e doppio filamento sono registrati come mostrato in Figura 4. Gli spettri di assorbimento registrata (Figura 4 a destra) mostrano l&#39;assorbimento massimi λ max a 465 nm per DNA1 a singolo filamento (dye 1) e 546 nm per DNA2 a singolo filamento (dye 2). Il DNA1_2 ricotto (dye 1 &amp; dye 2) mostra massimi sia a 469 nm e 567 ...

I coloranti fotostabili della cianina sono attaccati agli oligonucleotidi per monitorare l'ibridazione mediante trasferimento di energia.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è visualizzare il trasferimento di energia da una catena di DNA modificata con un colorante a un'altra. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia molecolare, come l'interferenza dell'RNA, monitorando in tempo reale l'elaborazione e l'integrità del siRNA all'interno di cellule vive.Il principale vantaggio di questa tecnica è la facilità con cui si può monitorare l'estendersi della fluorescenza e il cambiamento di colore, ottenendo un risultato chiaro. In questo modo si eliminano i risultati falsamente positivi. Per iniziare questa procedura, aggiungere i reagenti appropriati, come indicato nel protocollo del testo, in un pallone da 20 millilitri a fondo rotondo, munito di barretta magnetica e refrigerante a riflusso.Quindi, aggiungere 0,06 mL di piperidina. Riscaldare la miscela di reazione a 80 gradi Celsius per quattro ore. Dopo che la reazione si è raffreddata a temperatura ambiente, raccogliere il precipitato risultante per filtrazione.E lavare con dietiletere tre volte. Successivamente, aggiungere cento millilitri di dietiletere al surnatante. E raccogliere il precipitato risultante mediante filtrazione.Dopo aver lavato tre volte con dietiletere, combinare il precipitato con il solido isolato dalla prima filtrazione. Utilizzando il computer collegato a un sintetizzatore di DNA, inserire la sequenza di DNA desiderata e il metodo di accoppiamento. Seguire le indicazioni riportate nel protocollo del produttore.Successivamente, montare la colonna contenente il vetro a flusso controllato, modificato con una micro mole della prima faccia, sul sintetizzatore. Ora, avviare la sintesi sul sintetizzatore di DNA. Dopo il trattamento delle catene di DNA, aggiungere i reagenti appropriati come indicato nel protocollo testuale all'alcino dietilizzato, campione di DNA modificato.Incubare il campione a 60 gradi Celsius per un'ora e mezza. Successivamente, trasferire il campione in un tubo da 10 millilitri. Dopo averlo raffreddato a temperatura ambiente, aggiungere 150 microlitri di una soluzione 0,05 molare di sale di sodio dell'EDTA e 450 microlitri di una soluzione 0,3 molare di acetato di sodio al campione di DNA.In seguito, aggiungere 10 millilitri di etanolo al campione e mantenerlo a meno 32 gradi Celsius per 16 ore. Successivamente, centrifugare il campione per 15 minuti a mille volte G. Al termine, rimuovere il soprannatante.Lavare il pellet di DNA risultante con due millilitri di etanolo al 80% freddo. Quindi asciugare il pellet sotto pressione ridotta utilizzando un liofilizzatore. Purificare il pellet di DNA grezzo mediante HP LC. Monitorare la corsa controllando 260 nanometri e 459 nanometri per il colorante uno.O 542 nanometri per il colorante due. Raccogliere le frazioni che mostrano assorbimento in entrambi i canali di lunghezza d'onda. Per le misurazioni spettroscopiche di assorbimento di singolo filamento, registrare una misurazione di bianco contenente soltanto cloruro di sodio 200 millimolare e tampone fosfato di sodio 50 millimolare.Successivamente, trasferire la soluzione di DNA1 precedentemente preparata in una cuvetta di vetro al quarzo di un centimetro. Registrare l'assorbimento. Quindi determinare il valore massimo dell'assorbimento del colorante.Per misurazioni spettroscopiche fluorescenti a singolo filamento, eseguire una misurazione di bianco contenente soltanto 200 millimoli di cloruro di sodio e 50 millimoli di fosfato di sodio, utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione del colorante uno. Successivamente, posizionare la cuvetta con la soluzione DNA1 nello spettrometro. Registrare lo spettro di fluorescenza.Per eseguire la misurazione della doppia elica mediante spettroscopia fluorescente, inserire la cuvetta contenente la soluzione della doppia elica di DNA1 e DNA2 nello spettrometro. Registrare quindi lo spettro fluorescente utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione del colorante uno. Per ottenere una migliore comprensione di ciò che mostrano gli spettri registrati, irradiare le cuvette con lampade UV portatili.Osservare il cambiamento del colore della fluorescenza dal DNA a singolo al doppio filamento. Gli spettri di assorbimento registrati mostrano i massimi a 465 nanometri per il DNA a singolo filamento1 e a 546 nanometri per il DNA a singolo filamento2. Il doppio filamento ricombinato di DNA1 e DNA2 mostra massimi sia a 469 che a 567 nanometri.Entrambi i massimi di assorbimento mostrano uno spostamento batocromico. E le variazioni spettroscopiche più piccole sono il risultato di interazioni eccitoniche tra i coloranti all'interno dell'architettura del DNA a doppia elica. Gli spettri fluorescenti corrispondenti mostrano un massimo a 537 nanometri per il DNA a singolo filamento1.A 607 nanometri per il DNA a singolo filamento2 e a 615 nanometri per il DNA ibridato, a doppio filamento, di DNA1 e DNA2. Il DNA a doppio filamento di DNA1 e DNA2 mostra esclusivamente il massimo di emissione del colorante due, sebbene il colorante uno venga eccitato selettivamente, il che dimostra che il trasferimento di energia avviene in modo efficiente dal colorante uno al colorante due.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modificare post-sinteticamente il DNA mediante alcune reazioni catalitiche tra un filamento di DNA marcato con alchino e un lato A.

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