La prevenzione di stress termico effetti avversi nei ratti Bacillus subtilis Strain

Abbiamo descritto un protocollo per la prevenzione degli effetti dello stress da calore nei ratti mediante pre-trattamento orale con batteri benefici. Questo protocollo può essere modificato e utilizzato per varie vie di somministrazione e per l'analisi di diversi composti.

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare l'effetto preventivo del ceppo B.subtilis BSB3 contro le complicanze dopo stress da calore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella prevenzione degli effetti negativi dello stress da calore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per valutare diversi approcci per mitigare le complicanze dello stress da calore.

A dimostrare questa procedura sarà Ludmila Globa. E Oleg Pusovyy, ricercatore associato del nostro laboratorio. Per cominciare, con una singola colonia di Bacillus subtilis BSB3 che è stata coltivata durante la notte su una piastra di agar nutriente.

Inoculare dieci millilitri di brodo nutriente in un pallone. Coltiva la coltura durante la notte a 37 gradi Celsius. Preparare 500 millilitri di terreno di sporulazione secondo la ricetta mostrata qui.

E sterilizzare in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Lasciare raffreddare il terreno a 50 gradi Celsius prima di aggiungere le seguenti soluzioni sterili. In un armadio sterile, raffreddare il terreno preparato a temperatura ambiente a 40 gradi Celsius per 20 minuti.

E versare 25 millilitri in ciascuna delle 20 piastre di Petri sterili. Lasciare solidificare il terreno per una notte. Quindi, distribuire 0,5 millilitri della coltura di Bacillus subtilis BSB3 durante la notte sulla superficie delle piastre del terreno di sporulazione.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per cinque giorni fino al 90% di sporulazione. Quindi utilizzare la microscopia ad alta risoluzione per verificare la presenza di spore luminose in fase. Per raccogliere i batteri, aggiungere un millilitro di PBS alle piastre e utilizzare un divaricatore di cellule sterili per raschiare i batteri dalla superficie.

Conservare la sospensione a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Confermare la vitalità dei batteri piastrando 0,1 millilitri della diluizione appropriata di una sospensione batterica su piastre di terreno di sporulazione e incubare a 37 gradi Celsius per 18-24 ore. Utilizzare un contatore di colonie per contare le colonie batteriche e calcolare il titolo di batteri nella sospensione testata.

Quindi preparare una sospensione batterica in PBS ad una concentrazione finale di una volta dieci fino all'ottavo CFU per millilitro. Dopo aver trattato i ratti mediante sonda gastrica orale con B.subtilis BSB3 o PBS per due giorni, quindi suddividendo gli animali e misurando la loro temperatura, tenere i ratti dei gruppi uno e due a temperatura ambiente per 25 minuti. Porre gli animali dei gruppi tre e quattro in una camera climatica a 45 gradi Celsius e 55% di umidità relativa per 25 minuti.

Dopo aver misurato nuovamente la temperatura rettale di ciascun ratto, porre tutti gli animali a temperatura ambiente per quattro ore. Quindi, dopo l'eutanasia degli animali, la raccolta del sangue del tronco e l'isolamento degli organi secondo il protocollo di testo, posizionare ogni campione di organo in provette sterili pre-pesate e pesare. Aggiungere PBS sterile a ciascuna provetta per ottenere una diluizione da uno a dieci pesi per volume del campione e utilizzare un omogeneizzatore di tessuto di vetro sterile per generare sospensioni tissutali omogenee.

Successivamente, utilizzare PBS sterile per effettuare diluizioni seriali di ciascun campione. Quindi piastrate 0,1 millilitri di tutte le diluizioni sulla superficie di MacConkeys e il 5% di agar sanguigno. E agar sangue di brucella con emina e vitamina K1. Dopo aver incubato le piastre, usa un contatore di colonie per contare le colonie su ogni gruppo di piastre.

Esprimere i risultati come numero di unità formanti colonie, o CFU, per grammo di tessuto. Dopo aver preparato e colorato sezioni dell'intestino tenue secondo il protocollo di testo, utilizzare un microscopio ad alta risoluzione per misurare i villi intestinali e lo spessore totale della parete mucosa. Analizzare almeno quattro campioni di ciascun ratto ed effettuare almeno 20 misurazioni in ciascun campione.

Per eseguire la microscopia ottica ad alta risoluzione di campioni di sangue, utilizzare la piattaforma di isolamento dalle vibrazioni come base per il sistema di microscopio con una videocamera e un computer per registrare immagini dal vivo. Dopo aver calibrato le immagini del test secondo il protocollo di testo, posizionare sette microlitri di sangue appena prelevato da ciascun ratto su un vetrino e aggiungere un vetrino coprioggetti. Quindi fotografare e registrare dieci fotogrammi di immagini di 72 x 53,3 micrometri quadrati in ciascun campione.

Infine, utilizzando un software che fornisce immagini ottiche ad alta risoluzione a vista diretta in tempo reale, misurare la concentrazione di vescicole. La temperatura corporea media degli animali prima e immediatamente dopo lo stress da calore era rispettivamente di 36,7 più o meno 07 gradi Celsius e 40,3 più o meno 0,17 gradi Celsius. L'esposizione dei ratti al calore ha provocato una significativa inibizione dell'altezza dei villi e dello spessore totale della mucosa.

Tuttavia, il trattamento con il ceppo BSB3 prima dello stress, ha protetto l'intestino dall'effetto dannoso del calore. Per la traslocazione dei batteri dall'intestino, sono stati analizzati i linfonodi mesenterici, il fegato e la milza. Come illustrato qui, i batteri sono stati isolati a una concentrazione di 1,7 volte dieci per tre più o meno 4,6 volte dieci per due CFU per grammo di tessuto solo in campioni di linfonodi mesenterici e fegato di ratti trattati con PBS esposti al calore.

D'altra parte, tutti i campioni testati da animali di controllo e stressati dal calore che hanno ricevuto il ceppo BSB3 erano sterili. Nei ratti sottoposti a stress termico non è stato registrato alcun cambiamento nei livelli di citochine IL 1beta, IL-6, TNFalfa o interferone gamma. Tuttavia, i livelli di IL-10 e LPS erano elevati negli animali trattati con PBS prima del trattamento termico.

Pertanto, il pretrattamento con B.subtilis BSB3 ha impedito l'aumento di IL-10 e LPS nel siero dopo il trattamento termico. Infine, un aumento significativo della concentrazione di vescicole libere è stato riscontrato nel sangue dei ratti che hanno ricevuto PBS prima dello stress da calore, ma non negli animali trattati con BSB3. È importante ricordare di utilizzare materiali pirogeni per la raccolta del sangue e la precisione di mantenere i liquidi del siero a meno 20 gradi Celsius con ripetuti congelamenti e scongelamenti, e di seguire una procedura sterile durante l'analisi della traslocazione batterica.

Seguendo questa procedura, come la somministrazione di batteri dopo lo stress da calore, è possibile eseguire per rispondere a ulteriori domande sulle complicanze dello stress da calore.