Name: Misurazione del Tempo di sopravvivenza in Brachionus Rotiferi: Sincronizzazione di materni Condizioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Impara a misurare il tempo di sopravvivenza in Brachionus rotiferi per studi sull'invecchiamento e l'ecotossicologia. Questo metodo sincronizza le condizioni materne per ottenere dati riproducibili con elevata potenza statistica.

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Siamo grati a George Jarvis, Martha Bock, e Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, per il loro aiuto in riprese.

1. Preparazione di media Nota: utilizzare metà diluita Brujewicz acqua di mare artificiale di salinità 16,5 ppt (PSU). Altri seawaters artificiali sono anche spesso utilizzate per cultura Brachionus rotiferi 25,26. <ol><li> Aggiungere 454 mM NaCl, 26 mM MgCl 2, 27 mM MgSO 4, 10 mM KCl, e 10 mM CaCl 2 al 4,5 l di acqua distillata (volume finale sarà di 5 L). In alternativa, utilizzare acqua di diluizione deionizzata invece di acqua distillata. Aggiungere CaCl 2 dopo aver sciolto tutti gli altri sali. </li><li> Preparare la M NaHCO soluzione 0.48 3 stock (concentrazione 200x). Aggiungere 25 ml di esso alla soluzione precedente. La concentrazione finale di NaHCO 3 è di 2,4 mM. </li><li> Preparare la soluzione di riserva M NaBr 0,4 (concentrazione 500x). Aggiungere 10 ml di esso alla soluzione precedente. La concentrazione finale di NaBr è 0,8 mM. Portare a 5 L con acqua distillata. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro a membrana da 0,45 micron.Diluire due volte con acqua sterile prima dell&#39;uso (v / v). Nota: E &#39;possibile effettuare una concentrazione 2x di Brujewicz acqua di mare artificiale come una soluzione madre. </li></ol> 2. Condizioni generali Culture <ol><li> Cultura laboratorio rilievo o rotiferi selvatici catturati in una sterile bicchiere da 100 ml tra 20 e 30 ° C. Temperature più elevate si traducono in durate di vita più brevi e la riproduzione accelerata. Utilizzare 25 ° C per la comodità di esperimenti. La densità rotifero o il volume di acqua di mare artificiale non è un grosso problema qui. </li><li> Cultura specie di microalghe alimentari in acqua di mare artificiale 11. Vedere Snell et al. (2014) per i dettagli 11. In genere, usare Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellule / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellule / ml 25,29), e Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellule / ml 30,31). Dal momento che le alghe dieta (specie, la cultura Conditioni, composizioni biochimiche) influenza in modo significativo il tempo di sopravvivenza dei rotiferi Brachionus, utilizzare lo stesso lotto di microalga in tutti i gruppi sperimentali. </li><li> Mantenere una popolazione magazzino di rotiferi in una cultura lotto alimentando e cambio di un supporto di tanto in tanto (ad esempio, da mangiare ogni 2 giorni e inoculare ogni settimana). Molti neonati e adulti che portano 2-3 uova possono essere osservati quando rotiferi sono in condizioni ottimali. Nota: Un modo alternativo per ottenere rotiferi sperimentali è a covare le uova di riposo. Rotiferi nati dalle uova di riposo sono considerati essere ben sincronizzati, e la loro durata di vita non è significativamente diversa da quella dei rotiferi nati da uova amictic 11. Tuttavia, rotiferi da uova di riposo iniziare la riproduzione prima di quelli da uova amictic. Quindi, cautela è necessaria per la misura delle loro caratteristiche riproduttive. </li></ol> 3. La sincronizzazione dei rotiferi da Pre-cultura <ol><li> Selezionare una singola rotifero dalla stock popolazione e cultura come descritto in 2.1-2.3 per stabilire una sottopopolazione che verrà utilizzato per esperimenti. In genere la cultura per due settimane. </li><li> Raccogliere rotiferi uova recanti dalla sotto-popolazione (raccogliere un numero doppio di persone che verranno utilizzati per l&#39;esperimento). Li cultura come singola coorte (densità: ~ 50 individui / ml) in una piastra di coltura a 6 così come descritto in 2.1-2.3 in un fresco supporto sotto alimentazione ad libitum. Controllare la densità di popolazione è importante perché il mezzo condizionato incide sulla fisiologia della riproduzione Brachionus rotiferi 32,33. </li><li> Trasferire i neonati nati da uova prima degli adulti a terreni di coltura appena preparata. Ripetere questa procedura per 2-3 generazioni. </li><li> Utilizzare neonati nati entro un certo periodo di tempo (ad esempio, &lt;3 hr) per la misura del tempo di sopravvivenza. Per evitare possibili distorsioni nella scelta del singolo individuo, anche se molto improbabile, controllare la riproducibilità utilizzando diversi independenti sottopopolazioni. Nota: Come rotiferi solito riproducono solo asessuata in questa condizione, garantire l&#39;assenza di maschi sono presenti in tutto l&#39;esperimento. I maschi sono più piccoli di neonati e in genere si muovono più velocemente rispetto alle femmine. Femmine Mictic hanno differenti durate di vita da femmine amictic a determinate condizioni 29. </li></ol> 4. Le misurazioni del Tempo di sopravvivenza <ol><li> Luogo neonati in piatti di plastica (in genere 24 o 48 pozzetti, con ogni ben contenente 1 ml di acqua di mare artificiale). </li><li> A intervalli hr 24, trasferire i rotiferi per terreni di coltura appena preparati o ad intervalli di 12 h se a temperatura elevata (30 ° C o superiore). Registrare il numero di figli e se ogni individuo è vivo o morto. Registrare il rotifero come morto quando il movimento delle ciglia della corona ha completamente fermato. Nota: Rotiferi spesso attaccano alle pareti laterali dei pozzi. pipettaggio delicato dell&#39;acqua aiuta a trovarli. Se rotiferi non si trovano o are danneggiato accidentalmente dal pipettaggio, registrarli come &quot;censurato&quot;, non come &quot;morto&quot;. </li><li> Rimuovere i neonati quando rotiferi sperimentali sono attivamente riprodursi. I neonati crescono rapidamente ed è a volte difficile distinguerli dai rotiferi sperimentali. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Creare la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier (figure 1 e 2) riportando tasso di sopravvivenza cumulativo sull&#39;asse Y e tempo sull&#39;asse X. Questa è la rappresentazione più comune di dati di sopravvivenza. Utilizzare il log-rank test non parametrico (chiamato anche test di Mantel-Cox) per il confronto statistico del tempo di sopravvivenza 34. Il log-rank test è incluso anche in altri pacchetti statistici standard come JMP e R. Nota: non utilizzare t-test o analisi della varianza (ANOVA) seguita da parametrico confronto multiplo di Student distribuzione normale perché di solito non è soddisfatta da dati di sopravvivenza 35. Inoltre, questi methods non prendono gli individui Censored in considerazione. Mann-Whitney U test può essere utilizzato se non ci sono dati censurati. </li></ol>

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<li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;attuale protocollo descrive un metodo per misurare il tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus. Il passo fondamentale è la sincronizzazione delle condizioni di rotiferi per diverse generazioni. Quando rotiferi sperimentali sono ben sincronizzati, una curva di sopravvivenza che tipo tipico è osservata con molto poco mortalità precoce come riportato in diversi studi precedenti 18,24,37,38. Le deviazioni standard del loro tempo di sopravvivenza di conseguenza diventano più piccoli rispetto ai...

Rotiferi sono microscopici cosmopolita zooplancton (&lt;1 mm), che costituiscono il phylum Rotifera 1. Hanno un semplice piano corpo composto di circa 1.000 cellule somatiche, nonché un apparato ciliare ruota-come caratteristica denominata corona, che viene utilizzato per la locomozione e l&#39;alimentazione. La maggior parte dei rotiferi appartengono a classi Monogononta o Bdelloidea, che contengono circa 1.600 e 500 specie, rispettivamente 2. Rotiferi Monogonont hanno generalmente entrambe le fasi riproduttivo sessuale e asessuale (partenogenesi ciclico), mentre rotiferi bdelloid si riproducono per partenogenesi obbligatoria 3. È così possibile ottenere individui rotifere geneticamente identici, che assicura un&#39;elevata riproducibilità in esperimenti. Inoltre, essi hanno diversi altri vantaggi come organismi modello, come una vita breve, facilità di coltura, la disponibilità dei dati di sequenza genomica e trascrittomica 4-7, ed una posizione filogenetica unica distante da unarthropods e nematodi 8. Rotiferi sono quindi promettenti modelli di invertebrati in ecologico, tossicologico, e l&#39;invecchiamento studi 9-12. Il tempo di sopravvivenza in condizioni di esposizione a stress ambientale o sostanze chimiche è un parametro spesso misurato in questi campi di ricerca 13-19. Tuttavia, la cautela è necessaria quando si misura il tempo di sopravvivenza dei rotiferi, perché è suscettibile a condizioni ambientali delle loro madri. Vale a dire, nel monogonont Manjavacas rotifero Brachionus, prole femminile da madri di età hanno una durata più breve rispetto a quelli da giovani madri; tuttavia, la restrizione calorica materna (CR) compensa in parte gli effetti deleteri di avanzata età materna 20. In B. plicatilis, materna CR fornisce longevità prole, il tempo di sopravvivenza a lungo sotto la fame, ed elevata resistenza stress ossidativo associato con una maggiore espressione di enzimi antiossidanti 21,22. L&#39;effetto dell&#39;età maternaè stato osservato anche in rotiferi bdelloid 23. Pertanto, le condizioni di rotiferi sperimentali devono essere attentamente sincronizzate su più generazioni prima di misurazioni del tempo di sopravvivenza. Qui forniamo un protocollo per la misurazione del tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus dopo la sincronizzazione delle condizioni di coltura per diverse generazioni. Digiuno intermittente (IF), una variazione di CR dove rotiferi vengono alimentati periodicamente, è stato applicato per rivelare l&#39;effetto della sincronizzazione a causa degli effetti ben noti di IF sulla longevità 22,24.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Wako</td><td>190-13921</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Wako</td><td>136-03995</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Wako</td><td>131-00427</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Wako</td><td>168-22111</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Wako</td><td>035-00455</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di sodio</td><td>Wako</td><td>190-01515</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a membrana (0,45 &; micro; m dimensione dei pori)</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura, 6 pozzetti, non trattata</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D01</td> Piastra di coltura <td>a fondo piatto</td></tr><tr><td>, 48 pozzetti, non trattata</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D07</td><td>Tetraselmo a fondo piatto</td></tr><tr><td>, Living</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>152610</td><td></td></tr><tr><td>PRISM 6</td><td>GraphPad</td><td>Software versione 6.0d</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione del tempo di sopravvivenza in<em&gt; brachionus</em&gt; rotiferi: sincronizzazione di materni condizioni

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

I rotiferi sono microscopici zooplancton cosmopoliti utilizzati come modelli negli studi ecotossicologici e sull'invecchiamento grazie ai loro numerosi vantaggi come la breve durata della vita, la facilità di coltura e la partenogenesi che consente la coltura clonale. Tuttavia, è necessaria cautela quando si misura il loro tempo di sopravvivenza in quanto è influenzato dall'età materna e dalle condizioni di alimentazione materna. Qui forniamo un protocollo per la misurazione potente e riproducibile del tempo di sopravvivenza nei rotiferi Brachionus a seguito di un'attenta sincronizzazione delle condizioni di coltura per diverse generazioni. Empiricamente, una scarsa sincronizzazione si traduce in una mortalità precoce e in una graduale diminuzione del tasso di sopravvivenza, con conseguente debole potenza statistica. Infatti, in tali condizioni, la restrizione calorica (CR) non è riuscita a prolungare significativamente la durata della vita di B. plicatilis, sebbene la longevità indotta dalla CR sia stata dimostrata con campioni di rotiferi ben sincronizzati in studi passati e presenti. Questo protocollo è probabilmente utile per altri modelli di invertebrati, tra cui il moscerino della frutta Drosophila melanogaster e il nematode Caenorhabditis elegans, perché in queste specie sono stati riportati anche effetti sull'età materna.

La figura 1 mostra le curve rappresentative di sopravvivenza delle popolazioni mal sincronizzati (su due repliche). In questo esperimento, rotiferi erano o tutti i giorni della Fed [ad libitum (AL) gruppo] o ogni altro giorno (se il gruppo). La sopravvivenza mediana è stata di 13 e 18 giorni nel AL e se i gruppi, rispettivamente. Sebbene sia ben noto che se prolunga la vita della rotifero, questo esperimento non ha rilevato una differenza statisticamente s...

I rotiferi sono zooplancton microscopici utilizzati come modelli in studi ecotossicologici e sull'invecchiamento. Qui forniamo un protocollo per la misurazione potente e riproducibile del tempo di sopravvivenza nei rotiferi Brachionus. La sincronizzazione delle condizioni di coltura nel corso di diverse generazioni è di particolare importanza perché la condizione materna influenza la storia di vita della prole.

Misurazione del Tempo di sopravvivenza in<em&gt; Brachionus</em&gt; Rotiferi: Sincronizzazione di materni Condizioni

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è misurare con precisione il tempo di sopravvivenza dei rotiferi Brachionus, riducendo gli eventuali effetti dannosi delle generazioni materne. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sull'invecchiamento.Fornendo un metodo affidabile per misurare il tempo di sopravvivenza dei rotiferi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è riproducibile e ha un elevato potere statistico. Per iniziare, aggiungere a 4,5 litri di acqua distillata o deionizzata 454 millimolare di cloruro di sodio, 26 millimolare di cloruro di magnesio, 27 millimolare di solfato di magnesio, 10 millimolare di cloruro di potassio e 10 millimolare di cloruro di calcio.Preparare una soluzione madre di bicarbonato di sodio 0,48 molare. Aggiungere 25 millilitri di questa soluzione alla soluzione salina appena preparata. Preparare una soluzione madre di bromuro di sodio 0,4 molare.Aggiungere dieci millilitri di questo composto alla soluzione salina. Successivamente, portare la soluzione salina a cinque litri con acqua distillata. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando una membrana filtrante da 0,45 micrometri.Per coltivare rotiferi allevati in laboratorio o catturati in natura, posizionarli in un becher sterile da 100 millilitri contenente acqua marina artificiale e coltivarli a 25 gradi Celsius. Secondo i metodi di Snell, coltivare le specie di microalghe alimentari in acqua marina artificiale.Assicurarsi che lo stesso lotto di microalghe venga utilizzato in tutti i gruppi sperimentali. Mantenere una popolazione di riserva di rotiferi in coltura discontinua, nutrendoli ogni due giorni e cambiando il mezzo ogni settimana.Quando i rotiferi si trovano in condizioni ottimali, è possibile osservare numerosi esemplari neonati e adulti che portano due o tre uova. Per sincronizzare i rotiferi mediante pre-coltura, selezionare un singolo rotifero dalla popolazione di riserva e coltivarlo in acqua marina artificiale in un becher da 100 millilitri come appena descritto per circa due settimane.Dopo l'incubazione, raccogliere i rotiferi portatori di uova dalla sotto-popolazione. Coltivarli come un singolo coorte posizionando circa 50 rotiferi per millilitro di acqua di mare nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti, nutrendoli ad libitum. Quando le uova si saranno schiuse, trasferire i neonati in un mezzo di coltura appena preparato.Ripetere la coltivazione e il trasferimento dei neonati per due o tre generazioni. Per misurare il tempo di sopravvivenza, posizionare i neonati schiusi entro un periodo di tre ore nei pozzetti di piastre da 24 o 48 pozzetti contenenti un millilitro di acqua marina artificiale. A intervalli di 12 o 24 ore, trasferire i rotiferi in un mezzo di coltura appena preparato.Registrare il numero di prole e se ogni individuo è morto o vivo. Registrare il rotifero come morto quando il movimento delle ciglia della corona si è completamente arrestato. Quando i rotiferi sperimentali si stanno riproducendo attivamente, rimuovere i neonati poiché crescono rapidamente e a volte è difficile distinguerli dai rotiferi sperimentali.Eseguire l'analisi dei dati seguendo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra le curve di sopravvivenza di due repliche di popolazioni di rotiferi scarsamente sincronizzate. Alimentati ad libitum, indicati come A-L, oppure ogni due giorni, indicati come digiuno intermittente, I-F.La sopravvivenza mediana è stata rispettivamente di 13 e 18 giorni nei due gruppi. Sebbene sia noto che il digiuno intermittente allunga l'aspettativa di vita del rotifero, le differenze non erano statisticamente significative. In questo esperimento, le condizioni dei rotiferi erano ottimali e ben sincronizzate.E gli animali tendevano a sopravvivere fino alla fase successiva dell'esperimento. La sopravvivenza mediana era di 13 giorni per i rotiferi AL e di 20 giorni per i gruppi IF, una differenza statisticamente significativa.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sincronizzare le condizioni dei rotiferi. Speriamo che questo protocollo migliori l'utilizzo dei rotiferi come organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento.

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Misurazione del Tempo di sopravvivenza in

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