Name: Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri la marcatura spin sito-specifica e la spettroscopia EPR per studiare la dinamica dei canali ionici pentamerici ligando-dipendenti. Questo metodo consente analisi dettagliate delle proteine di membrana in ambienti lipidici fisiologici.

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Siamo molto grati ai deputati ed ex deputati del laboratorio Chakrapani per la lettura critica e commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzione (1R01GM108921) e l&#39;American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) e SC.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

spettroscopia EPR ha dimostrato di essere un approccio strutturale senza precedenti nella quantificazione cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​di membrana in un ambiente quasi nativa. Questo approccio ci permette una sbirciatina nei dettagli molecolari di dinamica delle proteine ​​che vengono oscurate in strutture ad alta risoluzione da cristallografia a raggi X e microscopia crioelettronica. Tuttavia, è importante considerare le limitazioni tecniche di questo approccio che può influenzare l&#39;applicabilità ge...

Negli ultimi dieci anni, la comprensione strutturale dei canali ionici ligando-dipendenti pentamerica (pLGIC) è cresciuto in salti e limiti, a causa di una moltitudine di strutture ad alta risoluzione di diversi membri della famiglia. I fattori chiave che hanno portato ai progressi in corso nel settore includono, la scoperta dei canali pLGIC procariote, 1-3 grandi progressi nella espressione della proteina di membrana eucariotica, 4-6 e enormi progressi negli approcci determinazione della struttura. 7 Queste strutture forniscono un chiaro consenso su la conservazione complessiva dell&#39;architettura tridimensionale pLGIC. Tuttavia, due aree principali che sembrano scia dietro sono la caratterizzazione funzionale di questi preparati canale e la descrizione meccanicistica della funzione del canale. Gating cambiamenti conformazionali sono complessi e si verificano su una distanza di 60 Å lungo la lunghezza del canale e queste transizioni sono ampiamente modulati dalipidi di membrana. In particolare, è stato dimostrato lipidi negativi, colesterolo e fosfolipidi di modulare la funzione di pLGIC 8-11. Mentre il ruolo preciso di questi costituenti lipidici in funzione del canale rimane sconosciuta, una comprensione molecolare completa di gating richiederebbe lo studio di questi canali nel loro ambiente nativo. spettroscopia sito-Spin Labeling (SDSL) e Risonanza paramagnetica elettronica (EPR) sono le tecniche di scelta per studiare la dinamica delle proteine ​​nei sistemi ricostituiti. spettroscopia EPR non è limitata dalla dimensione molecolare (come è NMR) o la proprietà ottica del campione (come è spettroscopia di fluorescenza), e permette quindi misure di costrutti integrali ricostituiti in condizioni native lipidici. La tecnica è estremamente sensibile ed ha requisiti relativamente basse campione (nell&#39;intervallo pico-mole). Entrambi questi aspetti rendono la tecnica adatta per studiare proteine ​​di membrana di grandi dimensioni che sono difficili da esprimere in oltre milligrammile quantità. L&#39;uso della spettroscopia EPR in combinazione con il sito-diretta etichettatura rotazione è stato sviluppato da Wayne Hubbell e colleghi, ed è stato adattato per studiare una gamma di tipi di proteine. 12-24 dati EPR sono stati utilizzati per indagare strutture secondarie, cambiamenti nella proteina conformazione, profondità di membrana di inserimento, e proteina-proteina / interazioni proteina-ligando. Il metodo prevede la sostituzione cisteina nelle posizioni di interesse mediante mutagenesi sito-diretta. Per garantire un&#39;etichettatura sito-specifica, è necessario sostituire cisteine ​​nativi con un altro aminoacido (ad es., Serina) per creare un modello cisteina-less. Di gran lunga, l&#39;etichetta di spin più popolare è un MTSL specifica-tiolo: (1-oxyl-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) methanethiosulfonate che si attacca alla proteina attraverso un ponte legame disolfuro. Grazie alla sua elevata specificità, relativamente piccole dimensioni (leggermente più grande di triptofano), e flexibilità della regione linker, questa etichetta centrifuga ha dimostrato di avere un&#39;ottima reattività anche con una cisteina sepolta. Inoltre, per massimizzare la reattività, la reazione di marcatura della proteina è effettuata sotto forma detergente solubilizzata. Dopo la separazione dell&#39;eccesso libera spin-label per dimensione cromatografia di esclusione, la proteina viene ricostituito in liposomi o sistemi doppio strato-mimando di composizione lipidica definito. In generale, cisteina mutagenesi è ben tollerato nella maggior parte della proteina, e le dimensioni relativamente ridotte dello spin-sonda porta perturbazione minimo per le strutture secondarie e terziarie. Per garantire che la modifica mantenuto funzioni wild type, i canali etichettati e ricostituiti possono essere studiate mediante misurazioni patch-clamp. La proteina marcata-funzionale è quindi sottoposto a misure spettroscopiche, che forniscono essenzialmente tre tipi principali di informazioni: 12,14,15,20,22,23,25-27 dinamiche spin-sonda lineshanalisi ape; l&#39;accessibilità della sonda ad agenti paramagnetici di rilassamento; e la distanza di distribuzione. 27 distanze EPR sono misurate da due approcci diversi. Il primo si basa sulla tecnica Continuous Wave (CW), dove spettrale allargamento derivanti da interazioni dipolari tra spin-etichette (in 8 - un intervallo di distanze 20). Viene utilizzato per determinare la distanza 28,29 Il secondo è un pulsato EPR metodo in cui le misure di distanza può essere estesa fino a 70 Å. 30-34 in doppio Electron Electron Resonance (cervo), le oscillazioni di ampiezza spin-echo vengono analizzati per determinare le distanze e le distribuzioni di distanza. Qui l&#39;eco di spin è modulato alla frequenza dell&#39;interazione dipolare. Insieme, questi parametri vengono utilizzati per determinare la topologia di proteine, elementi strutturali secondari, e le modifiche delle proteine-conformazionale.

<table><tbody><tr><td>Mutagenesi sito-specifica e mutazioni Cys 10x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra tampone di reazione HF</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM ciascuno dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polimerasi</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2,5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20.000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>supporti SOC</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB media</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 cellule competenti</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Espressione e purificazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>del glucosio</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-tio-beta;-galattoside)</td> <td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Resina di amilosio</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltosio</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonna cromatografica vuota in polipropilene</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Etichettatura a rotazione diretta dal sito</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-ossil-2,2,5,5-tetrametil-3-pirrolina-3-metile) Metanonetisolfonato</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acetossi-2,2,5,5-tetrametil-&Delta; 3-pirrolina-3-metile) metanotisolfonato</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectin lipid</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (perle di polistirina)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher chemicals</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina-maleimmide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina-maleimmide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti lipidi polari Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti lipidi polari Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli estratto di lipidi polari</td><td>Avanti lipidi polari Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Misurazione</td><td></td><td></td><td></td>EPR</tr><tr><td>TPX capillari plastici</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (etilendiammina-N, acido N'-diacetico)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

sito-labeling spin e epr spettroscopiche studi di canali pentamerica ligando-dipendenti ion

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Il gating dei canali ionici è un'orchestrazione guidata dallo stimolo dei movimenti delle proteine che porta a transizioni tra stati chiusi, aperti e desensibilizzati. Fondamentale per queste transizioni è la flessibilità intrinseca della proteina, che è modulata in modo critico dalla composizione lipidica di membrana. Per comprendere meglio le basi strutturali della funzione dei canali, è necessario studiare la dinamica delle proteine in un ambiente fisiologico di membrana. La spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è uno strumento importante per caratterizzare le transizioni conformazionali tra gli stati funzionali. Rispetto alla NMR e alla cristallografia a raggi X, le informazioni ottenute dall'EPR sono intrinsecamente di risoluzione inferiore. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, nell'EPR non esiste un limite superiore al peso molecolare della proteina, i requisiti del campione sono significativamente inferiori e, cosa più importante, la proteina non è vincolata dalle forze del reticolo cristallino. Pertanto, l'EPR è particolarmente adatta per lo studio di grandi complessi proteici e proteine in sistemi ricostituiti. In questo articolo, discuteremo i protocolli generali per la marcatura dello spin sito-diretto e la ricostituzione della membrana utilizzando come esempio un canale ionico ligando-gated ligando-gated (pLGIC) da Gloeobacter violaceus (GLIC). Verrà descritta una combinazione di approcci EPR a onda continua (CW) e pulsata (Double Electron Electron Resonance-DEER) che consentiranno una caratterizzazione quantitativa completa della dinamica dei canali.

Caratterizzazione biochimica dei mutanti GLIC Spin-marcato Seguendo il protocollo sopra descritto sarebbe tipicamente produrre proteina di fusione GLIC-MBP nell&#39;intervallo 10 - 12 mg / L di cultura. Anche se questo valore può variare tra diversi mutanti, in particolare per le posizioni sepolti all&#39;interno della proteina, il rendimento può essere notevolmente compromessa. In questi casi, i volumi di col...

Questo articolo descrive i metodi per l'etichettatura dello spin sito-diretto e la ricostituzione dei canali pentamerici ligando-dipendenti per studi di risonanza paramagnetica elettronica. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina di membrana. Il metodo di ricostituzione qui descritto può essere utilizzato anche per misure di patch-clamp di correnti macroscopiche e a canale singolo in un sistema lipidico definito.

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la purificazione, l'etichettatura con spin mediante mutagenesi mirata e il reimpacchettamento di un canale di membrana pentamerico attivato da ligando, per studi mediante risonanza paramagnetica elettronica. Studiare la dinamica delle proteine di membrana in un ambiente fisiologicamente rilevante è fondamentale per comprendere appieno il funzionamento di questa proteina di trasporto di membrana. E proprio alla luce di queste esigenze, ritengo che la tecnica dell'etichettatura mirata con spin e la risonanza paramagnetica elettronica siano particolarmente adatte.Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è limitato dalle dimensioni della proteina. Pertanto, l'etichettatura con spin mirata e la spettroscopia EPR sarebbero la tecnica da scegliere se si desidera studiare la dinamica di proteine di grandi dimensioni o proteine rese in membrane. Introdurre mutazioni singole di cisteina nel gene GLIC mediante mutagenesi mirata.Allestire una coltura notturna del mutante cisteina di GLIC come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, aggiungere 100 millilitri di tampone sterile di fosfato di potassio al terreno terrifi

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Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine ​​del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L'estensione e l'applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Ci descrive un metodo che misura la cinetica del trasporto ionico di proteine ​​di membrana a fianco sito-specifica analisi dei cambiamenti conformazionali mediante fluorescenza su singole cellule. Questa tecnica è adattabile a canali ionici, trasportatori e pompe ioniche e può essere utilizzato per determinare vincoli di distanza tra le subunità proteiche.

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

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Modellazione di ligandi in mappe derivate dalla criomicroscopia elettronica

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Monitoraggio dell'attività di ripetizione ricca di leucina contenente 8 canali (LRRC8/VRAC) utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster a emissione sensibilizzata (SE-FRET)

Scopri la marcatura spin sito-specifica e la spettroscopia EPR per studiare la dinamica dei canali ionici pentamerici ligando-dipendenti. Questo metodo consente analisi dettagliate delle proteine di membrana in ambienti lipidici fisiologici.

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

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