Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la purificazione, la marcatura dello spin diretto al sito e la ricostituzione di un canale ligando-dipendente penamerico per studi di risonanza paramagnetica elettronica. Studiare la dinamica delle proteine di membrana in un ambiente fisiologicamente rilevante è fondamentale per comprendere appieno come funziona questa proteina di trasporto di membrana. E a causa di queste esigenze, penso che l'etichettatura a rotazione diretta dal sito e la tecnica EPR siano ideali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è limitata dalle dimensioni della proteina. Pertanto, la marcatura con spin sito-diretto e la spettroscopia EPR sarebbero una tecnica di scelta se si desidera studiare la dinamica delle proteine di grandi dimensioni o le proteine ricostituite nelle membrane. Introdurre singole mutazioni di cisteina nel gene GLIC mediante mutagenesi site directed.

Impostare una coltura notturna del mutante GLIC cisteina come descritto nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere 100 millilitri di tampone sterile di fosfato di potassio al fantastico brodo dell'autoclave. Quindi, aggiungere glucosio sterile, Kanamicina e 10 millilitri di coltura notturna.

Incubare a 37 gradi Celsius in un agitatore a 250 giri/min. Aggiungere 50 millilitri di glicerolo e continuare ad agitare la coltura fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge da 1,0 a 1,2. Dopo aver indotto le cellule con 200 micromolari di IPTG, riportare l'agitatore a 250 giri/min e incubare ulteriormente per circa 16 ore a 18 gradi Celsius.

Raccogliere le cellule in bottiglie da centrifuga da un litro girando a 8500 volte G, quattro gradi Celsius, per 15 minuti. Decantare il surnatante e pesare il flacone con il pellet cellulare come descritto nel protocollo di testo. Risospendere il pellet batterico in 150 millilitri di tampone ghiacciato A per un litro di coltura.

Omogeneizzare le cellule facendole passare attraverso un disgregatore cellulare in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius. Ripeti il processo tre volte in modo che la maggior parte dei batteri venga lisata. Centrifugare le celle a 14.000 volte G per 15 minuti.

Quindi, pipettare il surnatante e trasferirlo in una provetta da centrifuga pulita. Dopo aver centrifugato il surnatante a 168.000 volte G per un'ora, decantare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet della membrana. Estrarre il pellet di membrana da un litro di coltura e risospenderlo nel tampone A, integrato con glicerolo al 10%, fino a un volume finale di 50 millilitri.

Aggiungere 0,5 grammi di DDM alla sospensione della membrana e nutare per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo la solubilizzazione della membrana, rimuovere i detriti cellulari dal lisato mediante centrifugazione a 168.000 volte G per un'ora. Nel frattempo, preparate la resina di amilosio.

Trasferire tre millilitri di resina utilizzando una pipetta in una colonna cromatografica in polipropilene vuota. Lavare la resina passando tre volte 10 volumi di acqua e poi 10 volumi di Buffer A, contenente 0,5 millimolari di DDM. Dopo la centrifugazione, estrarre delicatamente il surnatante con una pipetta e trasferirlo in una provetta conica pulita da 50 millilitri.

Per la rilegatura in batch, aggiungere resina di amilosio pre-bilanciata al tubo conico. Legare la proteina estratta alla resina di amilosio nutendo la miscela per due ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, far passare l'intero impasto attraverso una colonna cromatografica e raccogliere il flusso.

Diluire la proteina GLIC con 10 millilitri di tampone A contenente 40 milliomolosi di maltosio oltre a 0,5 millimolari di DDM e 05 milliomolari di TCEP. Il TCEP previene l'ossidazione delle catene laterali della cisteina. Raccogli l'intero eluite.

Concentrare la proteina eluita utilizzando un contenuto centrifugo a una temperatura compresa tra quattro e sei milligrammi per millilitro. Aggiungere la proteasi HRV 3C e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Per eseguire l'etichettatura dello spin diretto al sito, aggiungere prima un eccesso molare di dieci volte dell'etichetta di spin MTSL al campione digerito della proteasi per ottenere un rapporto molare tra monomero GLIC e molare MTSL di 1:10.

Dopo un'ora di incubazione, aggiungere altra etichetta di spin con un rapporto di eccesso molare di cinque volte e incubare per un'altra ora. Far passare il campione attraverso una cromatografia liquida proteica veloce ad esclusione dimensionale, o colonna FPLC, pre-bilanciata con tampone A e DDM da 0,5 millimolari per separare il tag MBP clivato e l'etichetta di spin libero in eccesso dai pentameri GLIC. Concentrare la soluzione proteica utilizzando un concentratore centrifugo fino a una concentrazione finale di circa otto-dieci milligrammi per millilitro e posizionarla sul ghiaccio.

Il campione è ora pronto per la ricostituzione. Per preparare i liposomi, sciacquare un pallone pulito da 25 millilitri a fondo tondo con cinque millilitri di cloroformio e asciugare il pallone in un getto di azoto gassoso nella cappa aspirante. Quindi, trasferire 10 milligrammi di asolectina nel pallone e asciugare i lipidi sotto un flusso continuo di azoto gassoso.

Quando il cloroformio è evaporato, porre il pallone sottovuoto per un'ora per garantire la completa asciugatura. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di ricostituzione A al lipide essiccato e agitare energicamente il pallone per mettere in sospensione il pellet lipidico. Per preparare piccole vescicole unilamellari, sonicare la sospensione lipidica in un sonicatore a bagno freddo fino a quando la soluzione della vescicola diventa più o meno traslucida e non si osservano grumi.

A questa miscela, aggiungere DDM a una concentrazione finale di quattro millimolari e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Per ricostituire la proteina, aggiungere la proteina purificata alla miscela lipidica. Dopo l'incubazione del campione a quattro gradi Celsius per un'ora con una leggera rotazione, diluire il campione a 15 millilitri con il tampone A.Rimuovere il detergente residuo nella sospensione utilizzando perle di polistirene con pori idrofobici che intrappolano il detergente.

Aggiungere 80 milligrammi di perle pulite e incubare la sospensione liposomica per una notte su un nutatore a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire il liposoma in una provetta da ultracentrifuga da 25 millilitri utilizzando un filtro a colonna per rimuovere le perle e diluire ulteriormente il campione a 25 millilitri. Dopo aver centrifugato i campioni a 168.000 volte G per due ore, decantare il surnatante e risospendere il pellet utilizzando 100 microlitri di tampone B.To eseguire la spettroscopia EPR a onda continua, trasferire prima la sospensione liposomica in una provetta da 200 microlitri e pellettare i campioni utilizzando una centrifuga.

Dopo aver scartato il surnatante, il campione è pronto per le misure EPR. Rimuovere il più possibile il tampone dal campione di liposoma. Per effettuare la sostituzione del tampone, trasferire 20 microlitri di pellet di liposomi in una provetta per microfuge utilizzando una pipetta.

Aggiungere 180 microlitri di Buffer D e incubare a 42 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare il campione, rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e ripetere il processo tre volte per garantire la sostituzione completa del tampone. I capillari in plastica permeabile ai gas sono adatti per misure sia di forme di linee spettrali che di accessibilità ai solventi.

Picchiettare il capillare sul proteoliposoma pellettato per aspirare il campione all'interno e sigillare l'estremità con cera ossea. Qui viene mostrata la caratterizzazione biochimica di mutanti GLIC marcati con spin attraverso il cromatogramma di filtrazione su gel di GLIC marcato con spin dopo scissione proteolitica del tag MBP. I picchi corrispondono al pentamero GLIC e al MBP libero.

Il gel della pagina SDS mostra la proteina di fusione GLIC-MBP monomerica non tagliata prima della filtrazione su gel, nonché le frazioni MBP e GLIC estratte dalla filtrazione su gel. È stato eseguito un test basato su FRET per monitorare lo stato di aggregazione di GLIC ricostituito in vari lipidi di membrana. Le misurazioni FRET sono state effettuate per i campioni dopo la ricostituzione notturna e dopo più cicli di congelamento-scongelamento dei campioni.

In un cerotto inside-out asportato da vescicole di asolectina ricostituite, GLIC viene attivato mediante salti di pH utilizzando uno scambiatore di soluzione rapida. Si vede che i canali si attivano in circa 10 millisecondi e si desensibilizzano con una costante di tempo da uno a tre secondi. Durante l'attivazione del canale si osservano riarrangiamenti strutturali.

Qui, gli spettri di risonanza paramagnetica elettronica a onda continua per una posizione nell'elica M2 che riveste i pori spostano le variazioni di ampiezza e le forme cieche in risposta alle variazioni di pH. La spettroscopia EPR è un approccio strutturale senza precedenti per misurare i cambiamenti conformazionali delle proteine di membrana nel nostro ambiente nativo e fornisce uno sguardo ai dettagli molecolari della dinamica delle proteine che sono oscurati dalle strutture a raggi X ad alta risoluzione o dalle strutture crio-EM. Mentre si lavora con questa tecnica, è importante tenere a mente che le mutazioni molto spesso portano a una bassa e scarsa stabilità oligomerica della proteina.

Pertanto, potrebbe essere necessario elaborare una strategia per combattere questi problemi. La combinazione di questi risultati di questi studi EPR con le misurazioni funzionali può darci un quadro più completo per studiare la relazione struttura-funzione, e i futuri progressi tecnologici sono finalizzati all'utilizzo di questo potente approccio per studiare canali umani più complicati in condizioni lipidiche più sofisticate.