Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare la purificazione, l'etichettatura con spin mediante mutagenesi mirata e il reimpacchettamento di un canale di membrana pentamerico attivato da ligando, per studi mediante risonanza paramagnetica elettronica. Studiare la dinamica delle proteine di membrana in un ambiente fisiologicamente rilevante è fondamentale per comprendere appieno il funzionamento di questa proteina di trasporto di membrana. E proprio alla luce di queste esigenze, ritengo che la tecnica dell'etichettatura mirata con spin e la risonanza paramagnetica elettronica siano particolarmente adatte.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è limitato dalle dimensioni della proteina. Pertanto, l'etichettatura con spin mirata e la spettroscopia EPR sarebbero la tecnica da scegliere se si desidera studiare la dinamica di proteine di grandi dimensioni o proteine rese in membrane. Introdurre mutazioni singole di cisteina nel gene GLIC mediante mutagenesi mirata.

Allestire una coltura notturna del mutante cisteina di GLIC come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, aggiungere 100 millilitri di tampone sterile di fosfato di potassio al terreno terrific broth sterilizzato in autoclave. Poi, aggiungere glucosio sterile, kanamicina e 10 millilitri della coltura notturna.

Incubare a 37 gradi Celsius in un agitatore a 250 giri al minuto. Aggiungere 50 millilitri di glicerolo e continuare ad agitare la coltura fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge un valore compreso tra 1,0 e 1,2. Dopo l'induzione delle cellule con 200 micromolar di IPTG, reimpostare l'agitatore a 250 giri al minuto e proseguire l'incubazione per circa 16 ore a 18 gradi Celsius.

Raccogliere le cellule in bottiglie da un litro per centrifuga eseguendo una rotazione a 8500 volte G, a quattro gradi Celsius, per 15 minuti. Decantare il soprannatante e pesare la bottiglia con il pellet cellulare come descritto nel protocollo testuale. Risospendere il pellet batterico in 150 millilitri di tampone A freddo di ghiaccio per ogni litro di coltura.

Omogeneizzare le cellule facendole passare attraverso un disgregatore cellulare in una stanza fredda a quattro gradi Celsius. Ripetere il processo tre volte in modo che la maggior parte dei batteri venga lisata. Centrifugare le cellule a 14.000 ×g per 15 minuti.

Quindi, pipettare il soprannatante e trasferirlo in un tubo da centrifuga pulito. Dopo aver centrifugato il soprannatante a 168.000 × g per un'ora, decantare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet di membrane. Raccogliere il pellet di membrane ottenuto da un litro di coltura e risospendere in Buffer A, integrato con il 10% di glicerolo, fino a un volume finale di 50 millilitri.

Aggiungere 0,5 grammi di DDM alla sospensione di membrane e agitare delicatamente per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo la solubilizzazione delle membrane, rimuovere i detriti cellulari dal lisato mediante centrifugazione a 168.000 ×g per un'ora. Nel frattempo, preparare la resina di amilosio.

Trasferire tre millilitri di resina mediante pipetta in una colonna cromatografica vuota in polipropilene. Lavare la resina passando 10 volumi di letto di acqua per tre volte, seguiti da 10 volumi di letto di Buffer A, contenente DDM 0,5 millimolare. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente il sopranatante mediante pipetta e trasferirlo in un tubo conico pulito da 50 millilitri.

Per il legame in batch, aggiungere la resina di amilosio pre-equilibrata al tubo conico. Legare la proteina estratta alla resina di amilosio agitando la miscela per due ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, far passare l'intera sospensione attraverso una colonna cromatografica e raccogliere il flusso in uscita.

Diluire la proteina GLIC con 10 millilitri di Buffer A contenente 40 millimolari di maltosio in aggiunta a 0,5 millimolari di DDM e 0,5 millimolari di TCEP. Il TCEP previene l'ossidazione delle catene laterali della cisteina. Raccogliere l'intero eluato.

Concentrare la proteina eluita utilizzando un concentratore centrifugo fino a una concentrazione compresa tra quattro e sei milligrammi per millilitro. Aggiungere la proteasi HRV 3C e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Per eseguire l'etichettatura con spin site-dipendente, aggiungere innanzitutto un eccesso molare dieci volte superiore dell'etichetta con spin MTSL al campione digerito dalla proteasi, ottenendo un rapporto molare monomero GLIC:MTSL di 1:10.

Dopo un'incubazione di un'ora, aggiungere un'ulteriore quantità di spin label in eccesso molare cinque volte e incubare per un'ulteriore ora. Far passare il campione attraverso una colonna di cromatografia a esclusione molecolare con fast protein liquid chromatography (FPLC), pre-equilibrata con Buffer A e DDM 0,5 millimolare, per separare il tag MBP scisso e l'eccesso di spin label libera dai pentameri di GLIC. Concentrare la soluzione proteica utilizzando un concentratore centrifugo fino a una concentrazione finale di circa otto-dieci milligrammi per millilitro e porla sul ghiaccio.

Il campione è ora pronto per la ricostituzione. Per preparare i liposomi, risciacquare un pallone da 25 millilitri pulito e a fondo rotondo con cinque millilitri di cloroformio e asciugare il pallone con un flusso continuo di gas azoto nella cappa. Successivamente, trasferire 10 milligrammi di asolecitina nel pallone e asciugare i lipidi sotto un flusso continuo di gas azoto.

Una volta evaporato il cloroformio, collocare il pallone sotto vuoto per un'ora per garantire un'essiccazione completa. Successivamente, aggiungere un millilitro di tampone di ricostituzione A al lipide essiccato e vortexare vigorosamente il pallone per portare il pellet lipidico in sospensione. Per preparare vescicole unilamellari piccole, sottoporre la sospensione lipidica a sonicazione in un bagno a ultrasuoni freddo fino a quando la soluzione delle vescicole diventa più o meno traslucida e non si osservano grumi.

A questa miscela, aggiungere DDM fino a una concentrazione finale di quattro millimolari e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Per ricostituire la proteina, aggiungere la proteina purificata alla miscela lipidica. Dopo l'incubazione del campione a quattro gradi Celsius per un'ora con rotazione delicata, diluire il campione fino a 15 millilitri con Buffer A. Rimuovere il detergente residuo nella sospensione utilizzando perle di polistirene con pori idrofobici che intrappolano il detergente.

Aggiungere 80 milligrammi di perle pulite e incubare la sospensione di liposomi tutta la notte su un nutatore a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire i liposomi in un tubo da ultracentrifuga da 25 millilitri utilizzando un filtro a colonna per rimuovere le perle e ulteriormente diluire il campione fino a 25 millilitri. Dopo aver centrifugato i campioni a 168.000 ×g per due ore, decantare il soprannatante e risospendere il pellet utilizzando 100 microlitri di tampone B. Per eseguire la spettroscopia EPR in onda continua, trasferire prima la sospensione di liposomi in un tubo da 200 microlitri e pellettizzare i campioni utilizzando una centrifuga.

Dopo aver scartato il surnatante, il campione è pronto per le misurazioni di RPE. Rimuovere quanta più buffer possibile dal campione di liposomi. Per eseguire lo scambio di buffer, trasferire 20 microlitri del pellet di liposomi in un tubo da microcentrifuga utilizzando una pipetta.

Aggiungere 180 microlitri di Buffer D e incubare a 42 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare il campione, rimuovere il soprannatante utilizzando una pipetta e ripetere il processo tre volte per garantire un completo scambio del buffer. I capillari di plastica permeabili ai gas sono adatti per le misurazioni delle forme delle righe spettrali e della accessibilità al solvente.

Toccare la capillare sul proteoliposoma pellettizzato per aspirare il campione all'interno e sigillare l'estremità con cera d'osso. Qui è mostrata la caratterizzazione biochimica di mutanti di GLIC marcati con spin mediante il cromatogramma di filtrazione su gel di GLIC marcato con spin dopo il clivaggio proteolitico del tag MBP. I picchi corrispondono al pentamero di GLIC e al MBP libero.

La gel elettroforesi SDS-PAGE mostra la proteina di fusione monomerica GLIC-MBP non tagliata prima della filtrazione in gel, nonché le frazioni di MBP e GLIC raccolte mediante filtrazione in gel. È stato eseguito un saggio basato sul FRET per monitorare lo stato di aggregazione di GLIC ricostituito in vari lipidi di membrana. Le misurazioni di FRET sono state effettuate su campioni dopo la ricostituzione notturna e dopo diversi cicli di congelamento-scongelamento dei campioni.

In una configurazione "inside-out" ottenuta da vescicole di asolectina recostituite, GLIC viene attivato da salti di pH mediante uno scambiatore rapido di soluzioni. I canali si attivano in circa 10 millisecondi e si desensibilizzano con una costante di tempo di uno-tre secondi. Durante l'attivazione del canale si osservano riorganizzazioni strutturali.

Qui, gli spettri di risonanza paramagnetica elettronica in onda continua per una posizione nell'elica M2 rivolta verso il poro mostrano variazioni di ampiezza e modifiche di forma in risposta a cambiamenti di pH. La spettroscopia EPR è un approccio strutturale insuperabile per misurare i cambiamenti conformazionali delle proteine di membrana nel loro ambiente naturale, fornendo un'anteprima dei dettagli molecolari della dinamica proteica che risultano oscurati dalle strutture ad alta risoluzione ottenute tramite raggi X o criomicroscopia elettronica. Nel lavorare con questa tecnica, è importante tenere presente che le mutazioni portano spesso a una bassa stabilità oligomerica e a una scarsa stabilità della proteina.

Pertanto, potrebbe essere necessario elaborare una strategia per affrontare tali problemi. Combinando questi risultati provenienti dagli studi di RPE con le misurazioni funzionali, è possibile ottenere un quadro più completo per lo studio della relazione struttura-funzione, e i futuri progressi tecnologici mirano a utilizzare questo approccio potente per studiare canali umani più complessi in condizioni lipidiche più sofisticate.