Name: Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Scopri come generare cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche da monociti per studi immunologici. Questo metodo consente di analizzare i profili metabolici e sviluppare vaccini efficaci.

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<ol><li>Jolles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paul+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paul Langerhans.</a> J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Steinman, R. M., Swanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+activity+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The endocytic activity of dendritic cells.</a> J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).</li>
<li>Hemmi, H., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+and+the+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">TLR signalling and the function of dendritic cells.</a> Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).</li>
<li>Mueller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+maintaining+peripheral+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms maintaining peripheral tolerance.</a> Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+phagocytosed+cellular+fragments+on+the+major+histocompatibility+complex+class+II+products+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells.</a> J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).</li>
<li>Paavonen, J., Lehtinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+human+papillomavirus+and+other+sexually+transmitted+agents+in+the+etiology+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer.</a> Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).</li>
<li>Ohtani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+target+of+rapamycin+and+glycogen+synthase+kinase+3+differentially+regulate+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells.</a> Blood. 112 (3), 635-643 (2008).</li>
<li>Wilde, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+renal+biopsies+of+patients+with+ANCA-associated+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).</li>
<li>Al-Hello, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enterovirus+strain+isolated+from+diabetic+child+belongs+to+a+genetic+subcluster+of+echovirus+11%2C+but+is+also+neutralised+with+monotypic+antisera+to+coxsackievirus+A9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9.</a> J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), 74-80 (2010).</li>
<li>Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+blood+CD11c%28%2B%29+dendritic+cells+and+monocyte-derived+dendritic+cells+differ+in+their+ability+to+stimulate+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes.</a> Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).</li>
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<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).</li>
<li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+double+gradient+centrifugation+and+their+differentiation+to+macrophages+in+teflon-coated+cell+culture+bags%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags.</a> J Vis Exp. (91), (2014).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+human+granulocyte+and+monocyte+isolation+procedures+on+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies.</a> Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Faresjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+guide+for+analysis+of+immune+markers+by+fluorochrome+%28Luminex%29+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique.</a> Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Defawe, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+qualification+of+a+multiplex+bead+array+to+assess+cytokine+and+chemokine+production+by+vaccine-specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells.</a> J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+self-healing+Langerhans+cell+histiocytosis+with+pulmonary+involvement%3A+spontaneous+regression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Assoc+Thai%22%5BJournal%5D)">Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression.</a> J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).</li>
<li>Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dendritic+cells+from+human+bone+marrow+mononuclear+cells%3A+advantages+for+clinical+application+in+comparison+to+peripheral+blood+monocyte+derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells.</a> Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).</li>
<li>Felzmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapharesis+products+for+the+generation+of+DCs+by+plastic+adherence%2C+or+by+positive+or+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection.</a> Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).</li>
<li>Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Langerhans+cell+histiocytosis+of+the+lacrimal+gland+in+an+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult.</a> Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).</li>
<li>Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaper+dermatitis%3A+a+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Diaper dermatitis: a review and update.</a> Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).</li>
<li>Gebhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cutaneous+Rosai-Dorfman+disease+refractory+to+imatinib+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy.</a> Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).</li>
<li>Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neural+tyrosine+hydroxylase%2C+via+modulation+of+endocrine+pancreatic+precursors%2C+is+required+for+normal+development+of+beta+cells+in+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas.</a> Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).</li>
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Questo documento descrive un metodo per generare da monociti moDCs immaturi, moDCs tolerogeniche e moDCs maturi. I passi importanti in questo protocollo sono discussi in dettaglio nei paragrafi successivi. È importante notare che il sangue periferico umano è utilizzato come materiale di partenza in questo protocollo e le precauzioni universali per la manipolazione del sangue umano dovrebbe essere praticata. Anche se è tecnicamente possibile ricavare DC dal midollo osseo nell&#39;uomo 24, in vitro DC differenziazione da cellule presenti nel sangue periferico è preferito a causa della disponibilità di sangue periferico rispetto al midollo osseo. Tra le cellule che si trovano nel sangue periferico, cellule e monociti CD34 + staminali ematopoietiche sono comunemente utilizzati per la generazione in vitro delle cellule dendritiche. CD34 + ematopoietiche cellule staminali sono coltivate con GM-CSF e TNF-α per derivare sottoinsiemi CD1a + e CD14 +, che vengono poi ulteriormente differenziate in Langerhanscome le cellule e cellule dendritiche. Viceversa, monociti sono coltivate in GM-CSF e IL-4 per generare moDCs immaturi. Diversi protocolli sono utilizzati per l&#39;arricchimento dei monociti da sangue periferico; per esempio, con l&#39;adesione a piatti di plastica, elutriation e kit di isolamento 25, 26 I vantaggi del protocollo aderenza sono minimo danno alle cellule e relativamente redditizio tuttavia cella purezza potrebbe essere compromessa.; e un passaggio aggiuntivo è necessaria per staccare le cellule per ulteriori esperimenti. Elutriation è una tecnica che separa le cellule in base alla loro dimensione e la densità. I vantaggi di elutriation sono vitalità cellulare e monociti possono essere usati facilmente per ulteriori esperimenti; Tuttavia questa tecnica è limitata dalla disponibilità di un elutriatore e l&#39;impossibilità di separare differenti popolazioni di cellule (cellule T e monociti) con parametri sedimentazione simili. In commercio kit di isolamento disponibili utilizzano microsfere magnetiche per selezionare sia positivo oselezionare negativamente la popolazione monocitica. Alcuni protocolli sono prevenuto verso l&#39;isolamento dei monociti utilizzando la selezione negativa come i monociti isolati restano &quot;intatti&quot; (non è vincolata da marcatori o microsfere). In questo protocollo, perline CD14 positivi sono stati usati per selezionare i monociti umani da PBMC. CD14 manca di un dominio citoplasmatico e vincolante di anticorpi CD14 non attiva la trasduzione del segnale. Inoltre, le microsfere si staccano dai monociti dopo coltura e quindi non ostacolare il processo di differenziazione. Inoltre, CD14 è fortemente espresso sulla maggior monociti e debolmente sui neutrofili e alcune cellule dendritiche mieloidi, quindi questo metodo di isolamento risultati in maggiore purezza cella rispetto agli altri metodi 17. monociti del sangue possono essere differenziati in DC o macrofagi e il destino dei monociti dipende in gran parte l&#39;ambiente di citochine. In questo lavoro, moDCs sono generati con l&#39;aggiunta di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) E interleuchina 4 (IL-4) per monociti del sangue periferico umano. GM-CSF è necessaria per la sopravvivenza monociti e IL-4 esercita un&#39;attività inibitoria sulla differenziazione dei macrofagi; e la combinatoria aggiunta di GM-SCSF e IL-4 per monociti cedere una maggiore percentuale di moDCs immaturi rispetto al citochina individuale 27. Ci sono altri protocolli che generano moDCs aggiungendo fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interferone alfa (IFN-α) e Interleuchina 13 (IL-13) di monociti del sangue periferico 28, 29, 30. La combinazione di GM-CSF e IL-4 è stato ottimizzato nel 1990 e ora un protocollo riconosciuto che genera DC immature plastica differenziate in moDCs immunogenico o tolerogeniche e polarizzate in Th1, Th2 o Th17 moDCs promuovono. moDCs immaturi vengono differenziate in moDCs tolerogeniche con l&#39;aggiunta di vitamina D3 e desametasone. Ci sono diversi protocolli per generare cellule dendritiche tolerogeniche per esempio, tramitefattore-kappa B nucleare (NF-kB) inibizione, l&#39;attivazione β-catenina, vitamina D3, desametasone e Rapamicina 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Sebbene sia la vitamina D3 e desametasone da solo sono stati segnalati per indurre un effetto tollerogenico sulle DC, la combinazione di vitamina D3 e desametasone risultato in una maggiore soppressione di alloproliferation rispetto a quando si utilizzano singoli farmaci. Pertanto, il protocollo esistente per la generazione di tollerogenica DC è stato modificato per una combinazione di vitamina D3 e desametasone. Questo metodo è attualmente in fase accettata come modello per DC tolerogeniche umani con un programma di utilità terapeutica. E &#39;anche importante notare che la vitamina D3 ricostituito e desametasone hanno una breve durata. In questo protocollo, Lipopolisaccaridi (LPS) è stata aggiunta come un induttore di maturazione DC. moDCs immaturi possono anche essere indotti a maturazione con cocktail pro-infiammatoria:(TNF-α), interleuchina 1 beta (IL-1β), interleuchina 6 (IL-6) e prostaglandina E2) o citochine pro-infiammatorie (TNF-alfa e interferone gamma (IFN-Γ)). Cocktail pro-infiammatorio genera moDCs maturi con funzioni di alta co-stimolazione e migratori ma producono livelli relativamente bassi di IL-12 38. TNF-α o IFN-Γ da solo non è in grado di indurre un fenotipo stabile dendritica 39. LPS stimola Toll-like receptor 4 (TLR4), media l&#39;attivazione di NF-kB e mitogeno activated protein chinasi (MAPK) per indurre la maturazione DC. DC maturazione indotta da LPS mostra un up-regulation di marcatori di maturazione DC (CD83, CD86, HLA-DR) e ha portato alla produzione di IL-12p70. Inoltre, questo passo può essere ulteriormente modificato per accoppiare LPS con agonisti TLR3 per produrre cellule dendritiche mature per cancro vaccini clinici. In questo lavoro, DC tolerogeniche sono dimostrato di essere resistente a maturazione in seguito al trattamento con LPS. Questi semi maturi come DC non sono immunogenica e non lo fanno ReleaSE citochine pro-infiammatorie 40. Le limitazioni di questo protocollo trovano nel processo di differenziazione. Il processo richiede 8 giorni dal giorno 0 al 7 ° giorno che pone una difficoltà per essere adattato in analisi di un elevato throughput. Una modifica nel protocollo è necessario per abbreviare il processo di differenziazione ancora produrre un elevato numero di cellule dendritiche vitali nei diversi stati. In secondo luogo, le cellule dendritiche sono generati mediante aggiunta di citochine in questo protocollo e queste citochine non sostengono popolazione DC per un lungo periodo di tempo. Inoltre, citochine sono usati in concentrazioni molto superiore in vivo e potrebbero causare lo sviluppo di parte di percorsi che non sono fisiologicamente identica a DC in vivo. Per esempio in colture in vitro di precursori DC hanno dimostrato di rispondere al GM-CSF, che non è una citochina essenziale per la normale differenziazione DC in vivo 41. Tuttavia, la stimolazione citochina può essere un metodo utile per geneAlto tasso di numero di DC in vitro per la sperimentazione. La possibilità di sottoporre queste cellule generate da questo protocollo per altre analisi, come immunofluorescenza, citometria a flusso, ALLO studi di reazione e studi metabolici aumenta l&#39;utilità di questo metodo. Queste cellule dendritiche in vitro servire come un buon modello per migliorare la conoscenza dello sviluppo DC, la maturazione e la presentazione dell&#39;antigene, che è in precedenza difficile da fare con rari numeri di DC in vivo. Capacità DC &#39;di regolare l&#39;immunità immunologica contro la tolleranza li rende i candidati attraenti in terapie contro il cancro e le malattie autoimmuni 42, 43, 44, 45. DC immunogeniche generati in questo protocollo può essere utilizzato per migliorare l&#39;efficacia della vaccinazione contro le malattie infettive e tumori; mentre DC tolerogeniche possono essere utilizzati per controllare le risposte delle cellule T indesiderati e prevenire il rigetto in seguito a trapianto. l&#39;intricataequilibrio tra immunità e tolleranza dipende dallo stato immensamente differenziazione DC. differenziazione DC è un programma coordinato cellulare che è governato da molteplici vie di segnalazione e destino metabolico. Diversi stati di differenziazione di DC si differenziano per le esigenze bioenergetica e biosintesi; per esempio, DC attivate richiedono adattamenti metabolici più energici importanti per la sopravvivenza e la migrazione rispetto ai PVS in stato di riposo. E &#39;importante notare che la vitamina D3, desametasone e rapamicina sono noti per la loro capacità di indurre DC tolerogeniche, sono stati descritti per influenzare il metabolismo DC. In questo lavoro, il metabolismo energetico del moDCs provenienti da diversi stati di differenziazione sono stati caratterizzati utilizzando gli analizzatori di flusso extracellulari e moDCs tolerogeniche esposto il più alto di maturazione metabolica plasticità e LPS-indotta è diminuita questa plasticità. Metabolismo anabolizzanti supporta DC maturazione mentre catabolici influenze metabolismo tollerogenico DC funziona 46. DCSgenerato da questo protocollo può essere utilizzato per valutare se modificare lo stato metabolico delle cellule dendritiche tenere premuto il tasto per modificare l&#39;immunità e la tolleranza nelle terapie. In conclusione, abbiamo presentato un protocollo per la generazione di immaturi, tollerogenico e moDCs maturi fondamentale per lo studio delle funzioni immunomodulanti PVS.

DC è stato descritto da Paul Langerhans (cellule di Langerhans) alla fine del XIX secolo come riferimento da Jolles 1 e caratterizzato da Ralph Steinman e Zanvil Cohn nel 1973 che li ha riconosciuti come cellule presentanti l&#39;antigene professionali 2. DC si trovano nel sangue periferico e nel maggior parte dei tessuti del corpo, particolarmente abbondante nei tessuti che sono esposti all&#39;ambiente esterno come la pelle (presente come cellule di Langerhans) e nei rivestimenti del naso, polmoni, stomaco e dell&#39;intestino che consentono loro di incontrare gli antigeni estrinseci. Immaturo DC dispone di funzionalità endocitico ma relativamente bassa capacità di stimolare le cellule T 3. Immaturo DC esprimono vari recettori pattern recognition (PRR) che cattura i modelli associati ai patogeni molecolari (PAMPs) o modelli molecolari di danno-associato (smorza) 4. Attivazione segnali di pericolo di auto maturazione verso DC immunogenico mentre auto-molecole determinano unresponsivene cellule Tss e apoptosi 5. DC immunogenici si caratterizzano per l&#39;up-regolazione delle molecole MHC e molecole di superficie co-stimolazione e la loro capacità di cellule T naive primi 6,7. Immaturo DC può anche essere maturato verso uno stato Treg che inducono o tollerogenico in risposta alla vitamina D3 metabolita 1a, 25 (O) 2 D 3 e di alcuni agenti immunosoppressori come l&#39;interleuchina-10 (IL-10), desametasone e rapamicina 8-9. DC tollerogenico si caratterizzano per la loro espressione di motivi basati su inibitori della tirosin-immunoreceptor (ITIMs) contenenti recettori di superficie e leganti. Trasduzione del segnale di ITIMs contenenti familiari ILT, ILT3 e ILT4 nei PVS tolerogeniche inibire alloproliferation e guidare l&#39;espansione Foxp3 + Treg 10,11. Queste proprietà uniche di DC tolerogeniche portano alla loro profonda potenza in vivo, cioè la capacità di indurre la tolleranza durevole per innesti allogenici trapiantati e supprEss lo sviluppo di malattie autoimmuni. Tollerogenico DC può essere visto quindi come un sottotipo di cellule dendritiche mature polarizzato che funzionano nella inibizione di attivazione immunitaria. Attualmente, ci sono due sottoinsiemi generali di cellule dendritiche in sangue periferico umano: le DC plasmacitoidi e mieloidi DC 12. DC circolanti sono rari costituendo a meno del 2% dei leucociti nel sangue umano e questo pone una difficoltà per l&#39;isolamento di un numero adeguato di DC per studiare le loro funzioni immunomodulanti. Per superare questo problema, monociti differenziati DC sono utilizzati come un modello in vitro per lo studio della funzione delle cellule dendritiche. Queste cellule dendritiche in vitro hanno recettori e funzioni simili rispetto a DC in vivo. Confronto dettagliato dei PVS in vivo e in vitro monociti derivati ​​da cellule dendritiche generate (moDCs) sono indagato da altri laboratori 13, 14, 15. Si segnala inoltre che moDCs e CD1c + DC erano equivalenti a presentanti l&#39;antigene e inducendo la funzione delle cellule T 15. In questo articolo, si descrive un metodo per generare moDCs immaturi da monociti del sangue periferico e poi differenziarsi in cellule dendritiche immunogenico e tolerogeniche. Queste cellule dendritiche derivate da monociti (moDCs) sono caratterizzate da marcatori di superficie, il profilo di citochine, le funzioni immunomodulanti e stati metabolici. cellule dendritiche immunogenico e tolerogeniche producono diverse citochine che provocano l&#39;espansione di entrambi cellule T allogeniche o cellule T regolatorie. In questo lavoro, citochina profilatura viene eseguita con sistemi che utilizzano la tecnologia multiplex. terreno di coltura di cellule vengono incubate con codice colore perline anticorpo immobilizzato e leggere in un analizzatore compatto. stati metabolici di DC vengono analizzati utilizzando gli analizzatori di flusso extracellulari che misurano tasso di consumo di ossigeno, un indicatore della respirazione cellulare, e il tasso di acidificazione extracellulare che riflette glycolyticflusso in cellule dendritiche. La misurazione di questi tassi di bioenergetica fornisce un mezzo per monitorare i cambiamenti nel metabolismo cellulare, che sono di vitale importanza per lo sviluppo delle cellule dendritiche e la funzione.

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td> di isolamento PBMC <td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>Isolamento PBMC Tubo</td></tr><tr><td>da centrifuga da 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Tubo Falcon da 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Falcon</td><td>352070</td> ML <td>Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC isolamento</td></tr><tr><td>0,2 &; micro; m filter</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td><td>Kit di MAC di isolamento PBMC</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>Arricchimento di monociti</td></tr><tr><td>Separatore MiniMACS</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>Arricchimento di monociti</td></tr><tr><td>Acqua di grado per colture cellulari</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Phosphate Soluzione salina tamponata</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Vitamina D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>tripano blu</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>PerCP-coniugato HLADR&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>PE coniugato CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>PE coniugato CD83&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>PE-coniugato CD86&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD11c coniugato con APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD14 coniugato con PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>PE-coniugato BDCA3&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>ILT3 coniugato APC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>Isotipo abbinato PerCP- coniugato Mab</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>Isotipo abbinato PE- coniugato Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>Isotipo abbinato APC- coniugato Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>BD LSR II Citometro a flusso</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&nbsp;</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>citofisso/citopermanente</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD25 coniugato APC/CY7</td><td>BD pharmingen</td><td>557753</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD4 coniugato PE/CY7</td><td>Biolegend</td><td>300512</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD3 coniugato PerCP</td><td>Biolegend</td><td>300428</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>EasySep Kit per l'arricchimento di cellule T CD4+ umane</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>Studio delle alloreazioni</td></tr><tr><td>Magnete EasySep&nbsp;</td>Studio di <td>alloreazione</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td></tr><tr><td>Kit di proliferazione cellulare CFSE Cell Trace</td><td>Sonde molecolari</td><td>C34554</td><td>Studio di alloreazione</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Studio di alloreazione</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-coniugato FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine pannello a sfere magnetiche</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td>Analisi delle citochine</td></tr><tr><td>Tubo in polistirene da 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Analisi delle citochine</td></tr><tr><td>Luminex Sheath Fluid&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>Analisi delle citochine</td></tr><tr><td>Sistema FLEXMAP 3D con software xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP Analisi delle</td><td>citochine</td>3D</tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>Attività mitocondriale</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Attività mitocondriale</td></tr><tr><td>XF Assay Medium (OCR)</td><td>Cavalluccio marino Bioscience</td><td>102352-000</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>Glucosio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>XF Base Medium (ECAR)</td><td>Cavalluccio marino Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>Calibrante</td><td>Cavalluccio marino</td><td>Bioscience 100840-000&nbsp;</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>Kit XF Cell Mito Stress</td><td>Cavalluccio Marino</td><td>Bioscience 103015-100</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>XF Kit Glycolysis Stress</td><td>Cavalluccio Marino</td><td>Bioscience 103020-100</td><td>Adattamento metabolico</td></tr><tr><td>Cavalluccio Marino&nbsp;</td><td>Cavalluccio marino Bioscience</td><td>XFe96</td><td>Adattamento metabolico</td></tr></tbody></table>

generazione di immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

i risultati di risposta immune da una complessa interazione tra il sistema immunitario innato antigene non specifici e l&#39;antigene specifico sistema immunitario adattativo. Il sistema immunitario è un equilibrio costante nel mantenere la tolleranza di auto-molecole e reagire rapidamente agli agenti patogeni. Le cellule dendritiche (DC) sono potenti cellule professionali presentanti l&#39;antigene che collegano il sistema immunitario innato per il sistema immunitario adattativo e bilanciano la risposta adattativa tra sé e non sé. A seconda dei segnali di maturazione, le cellule dendritiche immature possono essere selettivamente stimolati a differenziarsi in cellule dendritiche immunogenico o tolerogeniche. cellule dendritiche immunogenico forniscono segnali di proliferazione di cellule T antigene-specifiche per l&#39;espansione clonale; mentre le cellule dendritiche tolerogeniche regolano tolleranza antigene-specifica delezione di cellule T o l&#39;espansione clonale delle cellule T regolatorie. A causa di questa proprietà unica, le cellule dendritiche sono molto richiesti come agenti terapeutici per il cancro e dise autoimmuniAS. Le cellule dendritiche possono essere caricati con antigeni specifici in vitro e iniettate nel corpo umano per montare una risposta immunitaria specifica sia immunogenica e tollerogenica. Questo lavoro presenta un mezzo per generare in vitro da monociti, cellule dendritiche monociti immaturo derivati ​​(moDCs), tollerogenico e moDCs maturi che si differenziano per l&#39;espressione marcatore di superficie, la funzione e fenotipi metabolici.

Monociti Purificazione e dendritiche cellule differenziazione I monociti sono stati purificati da PBMC dalla densità centrifugazione del sangue periferico (Figura 1A), seguita da CD14 + selezione positiva separazione magnetica (Figura 1B) e coltivate in terreno completo in presenza di GM-CSF e IL-4 per ottenere cellule dendritiche immature ( Figura 2A). L&#39;aggiunta di vitamina D3 e desametasone alberino GM-CSF e IL-4 portato alla differenziazione delle moDCs immaturi in moDCs tolerogeniche (Figura 2B). LPS è stato aggiunto per indurre la maturazione di moDCs immaturi per maturare moDCs (Figura 2C) e moDCs tolerogeniche sono state stimolate con LPS per verificare la resistenza alla maturazione (Figura 2D). I campioni di sangue utilizzati in questo lavoro sono stati ottenuti da donatori sani con precedente informaticonsenso. MODC Caratterizzazione Surface Marker Caratterizzazione mediante citometria a flusso L&#39;analisi dei marcatori di superficie DC ha mostrato che moDCs mature esprimono i più alti livelli di markers di maturazione HLA-DR, CD83 e CD86 rispetto al moDCs tolerogeniche LPS-trattati, moDCs tolerogeniche e moDCs immaturi (Figura 3). Questi risultati hanno dimostrato che moDCs tolerogeniche erano resistenti alla maturazione rispetto ai moDCs immaturi seguenti stimolazione LPS. Inoltre, LPS-trattato moDCs tolerogeniche e moDCs tolerogeniche visualizzata aumentata espressione di CD14, BDCA3 (CD141) e immunoglobulina simile trascrizione (ILT) 3 rispetto al moDCs immaturi e maturi. Le moDCs tolerogeniche che abbiamo generato qui è coerente con precedenti relazioni 23. Caratterizzazione funzionale di moDCs moDCs indotte per la maturazione diventano immunogenico e rilasciano citochine che favoriscono la proliferazione di cellule CD4 + T-cellule. Abbiamo valutato l&#39;immunogenicità dei diversi sottotipi MODC misurando la proliferazione delle cellule T co-coltura. MoDCs tollerogenico erano scarsamente immunogenico rispetto al moDCs maturi, come mostrato da un basso alloproliferation di CD4 + T-cellule (Figura 4A). MoDCs tollerogenico si caratterizzano per il loro basso IFN-Γ, basso IL-12p40, e di alta IL-10 la produzione di citochine in alloreaction co-colture con CD4 + T-cellule (Figura 4B). Inoltre, allospecific aumento del numero di moDCs tolerogeniche in co-culture di moDCs maturi indotta CD4 + T-cellule aumentato la frequenza di alta Foxp3 + cellule T regolatorie CD25 (Figura 4C). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Analisi delle attività mitocondriale Red CMXRos viene utilizzato per riflettere l&#39;attività mitocondriale di analizzare i mitocondriale potenziali livelli di membrana in moDCs. Sono stati osservati moDCs tollerogenico di avere una maggiore attività mitocondriale rispetto agli altri sottotipi MODC differenziati (Figura 5A). Successivamente, il tasso di consumo di ossigeno mitocondriale (OCR) è valutata per i diversi sottotipi MODC utilizzando un Bioanalyzer. misurazioni OCR permettono intuizioni ad alta risoluzione al profilo metabolico, che fornisce informazioni incluso ma non limitato alla respirazione basale, la capacità respiratoria di riserva, perdita di protone e la respirazione non mitocondriale. La misurazione di OCR fornisce un mezzo per valutare la capacità delle cellule di rispondere allo stress. Le cellule sono metabolicamente perturbati mediante l&#39;aggiunta di tre diversi composti in successione. La prima iniezione è Oligomycin (ATP accoppiatore), che inibisce complesso V della catena di trasporto degli elettroni (ETC), inibendo la sintesi di ATP. Questo passaggio distingue la percentuale di ossigeno consumato per la sintesi di ATP e la percentuale di ossigeno consumato per superare protoni perdita attraverso la membrana mitocondriale interna. La seconda iniezione è FCCP (ETC acceleratore) che interrompe la sintesi di ATP trasportando ioni idrogeno attraverso la membrana mitocondriale anziché attraverso il canale protone V. Complesso Il crollo del potenziale di membrana mitocondriale porta ad un rapido consumo di energia e ossigeno, senza generazione di ATP. trattamento FCCP può essere usato per calcolare la capacità respiratoria di riserva di cellule. Mantenimento della capacità respiratoria di riserva in condizioni di stress è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. Questa capacità è determinata da diversi fattori, compresa la disponibilità di substrato e capacità funzionale degli enzimi coinvolti nella ECC La terza iniezione è una combinazione di Rotenone, un Complex I Inhibitor, e Antimicina A, un complesso III inibitore. Questa combinazione spegne respirazione mitocondriale e OCR è osservato a diminuire a causa della ridotta funzione mitocondriale (Figura 5C). MoDCs tollerogenico visualizzati più alti livelli basali di OCR moDCs maturi (Figura 5D). Inoltre, tollerogenico, LPS-tollerogenico e moDCs immaturi ha mostrato un aumento della capacità respiratoria di riserva rispetto a moDCs maturi (Figura 5e). Caratterizzazione metabolica di moDCs Poiché l&#39;acido lattico e protoni vengono rilasciati dalle cellule durante glicolisi, abbiamo analizzato l&#39;attività glicolitica di moDCs mediante un&#39;analisi in tempo reale della velocità di acidificazione extracellulare (ECAR) (Figura 6B). In presenza di glucosio, la glicolisi di tutti moDCs aumentata rispetto alla fase basale, conmoDCs maturi che presentano il più alto tasso di glicolisi moDCs immature (Figura 6D). Tollerogenico e moDCs immaturi esposte superiore glicolisi massima (indotta da oligomicina in presenza di glucosio) rispetto a moDCs LPS-trattati (Figura 6b). La capacità glicolitica di moDCs tolerogeniche e immaturi era superiore moDCs maturi (Figura 6 sexies). In contrasto con il loro alto tasso di glicolisi, riserva glicolitico è stato il più basso in moDCs maturi (Figura 6F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> Figura 1:. Purificazione monociti del sangue periferico (A) 25 ml di sangue è attentamente stratificato su 15 ml di Ficoll per tubo da 50 ml prima della centrifugazione. PBMC sono concentrate in un livello sottostante plasma dopo centrifugazione densità. (B) PBMC sono incubate con microsfere che sono conj<html> ugated agli anticorpi monoclonali CD14 umani (isotipo: IgG2a del mouse). e poi caricato su una colonna che si trova nel campo magnetico di un separatore per isolare CD14 + monociti <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> Figura 2: caratterizzazione morfologica di moDCs. (A) 200 ng / ml di GM-CSF e IL-4 è aggiunto monociti CD14 + purificate al giorno 0, 4 e 6 per generare moDCs immaturi; e (B) un ulteriore passaggio di stimolazione con 100 nM vitamina D3 e 10 nM desametasone il giorno 5 genera moDCs tolerogeniche. MoDCs immaturi e moDCs tolerogeniche vengono stimolati con 1 mg / ml LPS il giorno 6 di generare (C) moDCs maturare e moDCs (D) LPS-tolerogeniche.TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> Figura 3:. Surface Marker Caratterizzazione mediante citometria di flusso livelli di espressione di marcatori di superficie HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 e LT3 a tollerogenico (verde), LPS-tolerogeniche (nero), immaturo (rosso), maturo (blu) moDCs. controlli isotipo sono mostrati in grigio. istogramma individuale per ogni tipo di cellula è tracciata con conta delle cellule asse Y contro log asse X di intensità fluoroforo e sovrapposti. Tutti gli istogrammi sono rappresentativi di quattro esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso di copyright. Copyright 2015. L&#39;American Association ofImmunologi, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> Figura 4: caratterizzazione funzionale di moDCs. (A) Quantificazione di frequenza alloproliferation di CD4 + T-cellule indotte da co-coltura con un numero crescente di tollerogenico (TOL, verde), LPS-tollerogenico (L-TOL, nero), immaturo (IMM, rosso) e maturo (MAT ; blu) moDCs. I dati sono stati pool da quattro esperimenti indipendenti; significare differenze statistiche + SEM tra tutti moDCs rispetto moDCs maturi sono stati analizzati da ANOVA a due vie con Dunnett confronto multiplo post-test. (B) analisi di citochine di IFN-Γ (pannello di sinistra), IL-12p40 (pannello centrale) e Il- 10 (riquadro a destral) nei supernatanti da alloreactions tra CD4 + T-cellule co-coltura con un numero crescente di una tollerogenico (verde), immaturo (rosso) o blu) moDCs (maturi. I dati sono stati raggruppati da sei esperimenti indipendenti; media ± SEM alloproliferation + (C) cellule T CD4 e regolamentare l&#39;espansione di cellule T indotta dalla co-coltura con moDCs maturi in presenza di un numero crescente di moDCs tolerogeniche. Sinistra asse Y, la frequenza di CD4 + proliferazione T-cellule. Destra asse Y, la frequenza di CD25 alta Foxp3 + cellule gated sul proliferativa CD4 + T-cellule. I dati sono stati riuniti da tre esperimenti indipendenti; media ± SEM differenze statistiche tra presenza contro l&#39;assenza di moDCs tolerogeniche sono stati analizzati da una via ANOVA con Dunnett confronto multiplo post-test. (D) alloproliferation + CD4 T-cell (a sinistra) e la frequenza di cellule CD25highFoxP3 + (Destra) indotta da co- cultura con moDCs tolerogenichein presenza di un numero crescente di moDCs maturi. I dati sono stati riuniti da due a tre esperimenti indipendenti; media ± SEM differenze statistiche tra la presenza contro l&#39;assenza di moDCs maturi sono stati analizzati da ANOVA a due vie con Dunnett confronto multiplo post-test. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso d&#39;autore. Copyright 2015. L&#39;American Association of immunologi, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> Figura 5: Analisi di mitocondriale attività di moDCs. (A) I livelli di potenziale di membrana mitocondriale (Red CMXRos) in moDCs sono stati ottenuti da fanalisi di citometria basso. I dati di quattro esperimenti indipendenti sono stati riuniti. Media ± SEM (B) Rappresentazione schematica di una respirazione mitocondriale tempo reale. analisi OCR partendo dalla respirazione basale e dopo l&#39;aggiunta di oligomicina (inibizione complesso V), FCCP (massima induzione respirazione), e rotenone / antimicina Una miscela (catena di trasporto degli elettroni inibizione [ETC]). Il mitocondriale SRC (basale massima sottratto respirazione massima) è derivato dalla curva OCR. (C) Rappresentante studio cinetico di mitocondri OCR (pmol / min) a tollerogenico (TOL, verde), LPS-tollerogenico (L-TOL, nero) , immaturo (IMM, rosso) e maturo (MAT, blu) moDCs utilizzando sequenziale aggiunta di oligomicina (Olig), FCCP, e rotenone / antimicina A (Rot-AA). (D) OCR quantificazione della respirazione basale di moDCs e ( E) risparmia capacità respiratoria di moDCs. I dati sono stati riuniti da cinque esperimenti indipendenti. Media ± SEM. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso d&#39;autore. Copyright 2015. L&#39;American Association of immunologi, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> Figura 6: Caratterizzazione metabolica di moDCs. (A) Rappresentazione schematica di tempo reale glicolisi. analisi ECAR parte da ECAR basale, in cui le cellule sono state incubate in terreno senza-glucosio seguire l&#39;aggiunta di glucosio (induzione glicolisi), oligomicina (che induce glicolisi cellule massima inibizione complesso V), e infine 2-deossi-D- glucosio(Inibizione glicolisi). Glicolisi (induzione glicolisi sottratto per ECAR basale), la capacità glicolitico (glicolisi massima sottratto per basale ECAR), e riserva glicolitico (glicolisi massima sottratto per l&#39;induzione glicolisi) sono derivati ​​dalla curva ECAR. (B) Rappresentante studio cinetico della glicolisi-dipendente ECAR (mph / min) a tollerogenico (TOL, verde), LPS-tollerogenico (L-TOL, nero), immaturo (IMM, rosso), e maturo (MAT, blu) moDCs utilizzando sequenziale aggiunta di glucosio (Gluc), oligomicina (Olig), e 2-DG. Bars (C) mostrano livelli basali ECAR (D) glicolisi (e) capacità glicolisi, e (F) riserva glicolitico di moDCs. I dati sono stati riuniti da tre esperimenti indipendenti; significare 6 SEM. Le differenze statistiche sono stati analizzati mediante ANOVA con Tukey confronto multiplo post-test. Questa cifra è stata modificata dal J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 giugno 2015). Riprodotto e ripubblicato con il permesso d&#39;autore. Copyright 2015. L&#39;American Association of immunologi, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare cellule dendritiche tollerogeniche e mature da monociti per la sperimentazione o lo sviluppo di vaccini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia fornendo un modello per studiare lo sviluppo, la maturazione e la presentazione dell'antigene delle cellule dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la generazione di un numero elevato di cellule dendritiche in vitro per la sperimentazione.Iniziare l'arricchimento dei monociti mescolando 20 microlitri di cellule mononucleali del sangue periferico precedentemente preparate, o sospensione di cellule PBMC, con 20 microlitri di tripan blue, per contare il numero di cellule vive utilizzando un citometro. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare. Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 80 microlitri di tampone colorante per 10-sette cellule.Aggiungere 20 microlitri di microsfere CD-4 per 10 alla settima cella. Mescolare bene e incubare le cellule per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule con un millilitro di tampone di colorazione ogni 10-settima cella e centrifugare le cellule.Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare. Ottenere una colonna media per un massimo di due volte 10 fino all'ottavo totale delle celle e posizionare la colonna nel campo magnetico del separatore. Successivamente, risciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone colorante.Pipettare la sospensione cellulare sulla colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna in una provetta da 15 millilitri. Sostituire un nuovo tubo da 15 millilitri sotto la colonna e lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone colorante. Assicurarsi che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di aggiungere un nuovo tampone di colorazione tra un lavaggio e l'altro.Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo nuovo da 15 millilitri. Pipettare un millilitro di tampone di colorazione sulla colonna e sciacquare immediatamente le cellule marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna. Quindi, ripetere i passaggi di separazione magnetica utilizzando la frazione illusa in una nuova colonna per aumentare la purezza delle celle CD14 plus.Seminare quattro serie di CD14 più monociti in una concentrazione da zero virgola tre a zero virgola cinque volte da 10 a sesto per millilitro di terreno di coltura cellulare di IL-4 in piastre a sei pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius con il cinque percento di CO2. Il quarto giorno, rimuovere 850 microlitri di terreno dalla coltura e centrifugare.Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno di coltura cellulare. Aggiungere nuovamente la miscela di cellule alla coltura. Il quinto giorno, aggiungere un microlitro di brodo di vitamina D3 e un microlitro di brodo di desametazone per un litro di terreno a due dei set, per generare moDC tollerogenici.Il sesto giorno, aggiungere 200 nanogrammi per millilitro di GMCSF e 200 nanogrammi per millilitro di IL-4 a tutti i set. Aggiungere un microgrammo per millilitro di LPS a uno dei set trattati solo con GMCSF e IL-4 per generare moDC maturi. Aggiungere un microgrammo per millilitro di LPS a un set di moDC tollerogenici per generare moDC tollerogenici di LPS.Infine, il settimo giorno, raccogli i diversi tipi di moDC lavando la piastra di coltura con PVS EDTA. Le moDC immature sono state generate aggiungendo GMCSF e IL-4 a CD-14 purificato e monociti nei giorni zero, quattro e sei. L'aggiunta di vitamina D3 e desametazone post-GMCF e IL-4 ha portato alla differenziazione delle moDC immature in moDC tollerogeniche.L'LPS è stato aggiunto per indurre la maturazione di moDC immature in moDC mature. E le moDC tollerogeniche sono state stimolate con LPS per verificare la resistenza alla maturazione. Un'analisi dei marcatori di superficie delle DC ha rivelato che le moDC mature esprimono i livelli più elevati di marcatori di maturazione HLA-DR, CD80, CD83 e CD86.Al contrario, le moDC tollerogeniche hanno mostrato una maggiore espressione di CD14, BDCA3 e trascritti immunoglobuline-like rispetto alle moDC immature e mature. Utilizzando CMXRos rossi per riflettere l'attività mitocondriale, è stato osservato che le moDC tollerogeniche hanno un'attività mitocondriale più elevata rispetto agli altri sottotipi differenziati di moDC. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare le caratteristiche metaboliche nelle cellule dendritiche per lo sviluppo di vaccini e immunoterapia.

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Presentazione dell'antigene in organi linfatici secondari da parte delle cellule dendritiche è cruciale per l'avvio della cellula T mediata risposta immunitaria adattativa. Qui mostriamo la cultura del midollo osseo derivate le cellule dendritiche murine, di attivazione e di etichettatura per 2-fotoni imaging.

Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l&#39;uso in 2-fotone Imaging

Questo video dimostra la generazione di cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche, o DC, da monociti umani. L'incubazione di monociti con fattori di crescita e citochine porta alla produzione di DC immature. In risposta alle molecole regolatorie immunitarie, le DC immature si differenziano in DC tollerogeniche e mature.

Generazione di cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche da monociti

Questo video mostra un metodo per convertire le cellule dendritiche (DC) in DC tollerogeniche (TolDCs) utilizzando un agente farmacologico immunomodulatore. Questa conversione è confermata dalla valutazione della funzione di TolDC attraverso il loro effetto immunosoppressivo sulle cellule T CD4+.

Effetto di un agente farmacologico immunomodulatore sull'interazione tra cellule dendritiche e cellule T CD4+

Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Qui forniamo un protocollo per lo screening di potenziali fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo di cellule dendritiche (DC) utilizzando la trasduzione lentivirale di shRNA per ottenere linee cellulari di knockdown stabili per la differenziazione DC in vitro .

Studio dello sviluppo delle cellule dendritiche mediante knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in una linea cellulare ematopoietica e progenitrice in vitro

Viene presentato un protocollo unico e completo per generare cellule dendritiche (mo-DC) derivate da monociti umani desialilati da cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC) utilizzando un trattamento con sialidasi. Inoltre, vengono descritti metodi per valutare la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle mo-DC e valutare come il trattamento con sialidasi migliora il livello di maturazione delle mo-DC.

Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14+ umani

Scopri come generare cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche da monociti per studi immunologici. Questo metodo consente di analizzare i profili metabolici e sviluppare vaccini efficaci.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

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