Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica
22 giugno 2016
Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare cellule dendritiche tollerogeniche e mature da monociti per la sperimentazione o lo sviluppo di vaccini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia fornendo un modello per studiare lo sviluppo, la maturazione e la presentazione dell'antigene delle cellule dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la generazione di un numero elevato di cellule dendritiche in vitro per la sperimentazione.
Iniziare l'arricchimento dei monociti mescolando 20 microlitri di cellule mononucleali del sangue periferico precedentemente preparate, o sospensione di cellule PBMC, con 20 microlitri di tripan blue, per contare il numero di cellule vive utilizzando un citometro. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare. Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 80 microlitri di tampone colorante per 10-sette cellule.
Aggiungere 20 microlitri di microsfere CD-4 per 10 alla settima cella. Mescolare bene e incubare le cellule per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule con un millilitro di tampone di colorazione ogni 10-settima cella e centrifugare le cellule.
Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare. Ottenere una colonna media per un massimo di due volte 10 fino all'ottavo totale delle celle e posizionare la colonna nel campo magnetico del separatore. Successivamente, risciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone colorante.
Pipettare la sospensione cellulare sulla colonna e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso la colonna in una provetta da 15 millilitri. Sostituire un nuovo tubo da 15 millilitri sotto la colonna e lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone colorante. Assicurarsi che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di aggiungere un nuovo tampone di colorazione tra un lavaggio e l'altro.
Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo nuovo da 15 millilitri. Pipettare un millilitro di tampone di colorazione sulla colonna e sciacquare immediatamente le cellule marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna. Quindi, ripetere i passaggi di separazione magnetica utilizzando la frazione illusa in una nuova colonna per aumentare la purezza delle celle CD14 plus.
Seminare quattro serie di CD14 più monociti in una concentrazione da zero virgola tre a zero virgola cinque volte da 10 a sesto per millilitro di terreno di coltura cellulare di IL-4 in piastre a sei pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius con il cinque percento di CO2. Il quarto giorno, rimuovere 850 microlitri di terreno dalla coltura e centrifugare.
Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno di coltura cellulare. Aggiungere nuovamente la miscela di cellule alla coltura. Il quinto giorno, aggiungere un microlitro di brodo di vitamina D3 e un microlitro di brodo di desametazone per un litro di terreno a due dei set, per generare moDC tollerogenici.
Il sesto giorno, aggiungere 200 nanogrammi per millilitro di GMCSF e 200 nanogrammi per millilitro di IL-4 a tutti i set. Aggiungere un microgrammo per millilitro di LPS a uno dei set trattati solo con GMCSF e IL-4 per generare moDC maturi. Aggiungere un microgrammo per millilitro di LPS a un set di moDC tollerogenici per generare moDC tollerogenici di LPS.
Infine, il settimo giorno, raccogli i diversi tipi di moDC lavando la piastra di coltura con PVS EDTA. Le moDC immature sono state generate aggiungendo GMCSF e IL-4 a CD-14 purificato e monociti nei giorni zero, quattro e sei. L'aggiunta di vitamina D3 e desametazone post-GMCF e IL-4 ha portato alla differenziazione delle moDC immature in moDC tollerogeniche.
L'LPS è stato aggiunto per indurre la maturazione di moDC immature in moDC mature. E le moDC tollerogeniche sono state stimolate con LPS per verificare la resistenza alla maturazione. Un'analisi dei marcatori di superficie delle DC ha rivelato che le moDC mature esprimono i livelli più elevati di marcatori di maturazione HLA-DR, CD80, CD83 e CD86.
Al contrario, le moDC tollerogeniche hanno mostrato una maggiore espressione di CD14, BDCA3 e trascritti immunoglobuline-like rispetto alle moDC immature e mature. Utilizzando CMXRos rossi per riflettere l'attività mitocondriale, è stato osservato che le moDC tollerogeniche hanno un'attività mitocondriale più elevata rispetto agli altri sottotipi differenziati di moDC. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare le caratteristiche metaboliche nelle cellule dendritiche per lo sviluppo di vaccini e immunoterapia.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche e mature a partire da monociti, utilizzabili per la ricerca immunologica e lo sviluppo di vaccini. Il metodo consente la differenziazione di cellule dendritiche derivate dai monociti immature (moDCs) in fenotipi distinti con caratteristiche metaboliche diverse.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia delle cellule dendritiche
- Differenziamento cellulare
Sfondo
- Le cellule dendritiche svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dell'immunità e della tolleranza.
- Comprendere la differenziazione delle moDC può fornire informazioni sulle risposte immunitarie.
- Le cellule dendritiche tollerogeniche possono essere utili nello sviluppo di terapie per le malattie autoimmuni.
- Le cellule dendritiche mature sono essenziali per una presentazione efficace dell'antigene.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per generare in vitro elevate quantità di cellule dendritiche.
- Esplorare le caratteristiche metaboliche delle cellule dendritiche durante la differenziazione.
- Fornire un modello per lo studio della maturazione e della funzione delle cellule dendritiche.
Metodi Utilizzati
- Arricchimento di monociti da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs).
- Separazione magnetica per isolare monociti CD14+.
- Coltura dei monociti con citochine e composti specifici per indurre la differenziazione.
- Analisi dei marcatori di superficie delle cellule dendritiche e dell'attività metabolica.
Risultati principali
- Le moDC tollerogeniche hanno mostrato un'attività mitocondriale più elevata rispetto ad altri sottotipi.
- Le moDC mature hanno espresso livelli aumentati di marcatori di maturazione come HLA-DR e CD80.
- Le moDC tollerogeniche hanno mostrato un'espressione aumentata di CD14 e trascritti simili a immunoglobuline.
- Il protocollo di differenziazione ha generato con successo popolazioni distinte di cellule dendritiche per la ricerca.
Conclusioni
- Questo metodo consente la generazione efficace di cellule dendritiche per studi immunologici.
- La comprensione dei profili metabolici delle cellule dendritiche può contribuire allo sviluppo di vaccini.
- I risultati contribuiscono alla conoscenza della biologia delle cellule dendritiche e del loro ruolo nella regolazione immunitaria.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La generazione di cellule dendritiche con fenotipi immunogenici o tollerogenici definiti consente un'analisi precisa dei meccanismi immunitari rilevanti per l'immunoterapia e lo sviluppo di vaccini. Questa capacità sostiene una valutazione predittiva affidabile nella validazione precoce dei bersagli e riduce i rischi nei programmi traslazionali fornendo modelli cellulari standardizzati e scalabili. L'approccio è direttamente rilevante per i team di portafoglio che intendono allineare la biologia della scoperta con la traduzione clinica successiva nella modulazione immunitaria.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette studi meccanicistici delle vie di maturazione delle cellule dendritiche e di presentazione dell'antigene.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli immunitari generando fenotipi distinti di cellule dendritiche in vitro.
- Semplifica la riduzione del rischio biologico chiarificando l'impatto dello stato metabolico sulla funzione immunitaria.
- Fornisce un sistema riproducibile per l'interrogazione basata su ipotesi dei meccanismi di tolleranza immunitaria.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce popolazioni di cellule dendritiche fenotipicamente distinte e validate per flussi di lavoro di screening successivi.
- Standardizza la caratterizzazione dei marcatori di superficie e del fenotipo metabolico per garantire la riproducibilità del saggio.
- Consente una valutazione quantitativa del potenziale di presentazione dell'antigene e di attivazione delle cellule T.
- Permette la preparazione scalabile di cellule dendritiche per piattaforme di screening di composti o antigeni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli di DC in vitro a strategie di modulazione immunitaria pertinenti alla malattia.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di immunoterapie e interventi tollerogeni.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio fornendo dati predittivi sulla funzione delle DC e sul fenotipo metabolico.
- Facilita l'esplorazione di biomarcatori traslazionali associati alla maturazione e alla tolleranza delle DC.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la generazione e la caratterizzazione di sottotipi di cellule dendritiche per studi di modulazione immunitaria.
- Biologia della scoperta: Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi sulla maturazione delle DC, sulla presentazione dell'antigene e sull'induzione della tolleranza.
- Screening: Fornisce DC riproducibili e fenotipicamente definite per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Fornisce letture quantitative dei marcatori di superficie e dell'attività metabolica per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici di intervento immunitario e sviluppo di vaccini.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per la generazione di DC in diversi programmi di immunologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi immunitari e nella riduzione del rischio meccanicistico.
- Valore operativo: Standardizza la generazione e la caratterizzazione delle cellule dendritiche per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) nei programmi di immunomodulazione e riduce il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio delle risorse per l'immunomodulazione e dei candidati traslazionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento dei monociti, nella coltura cellulare e nell'immunofenotipizzazione.
- Necessita dell'accesso alla citometria a flusso e ai saggi di attività metabolica per la caratterizzazione delle cellule dendritiche.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale dei protocolli per citochine e maturazione, al fine di garantire la riproducibilità.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse fonti di donatori o modelli di malattia.
- Le limitazioni includono la variabilità delle fonti di cellule primarie e il potenziale effetto di lotto.
