Name: Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri il sequenziamento MBDCap-seq per analizzare la metilazione del DNA su larga scala in coorti di pazienti. Questo metodo computazionale identifica biomarcatori epigenetici per diagnosi e terapia clinica.

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Il lavoro è sostenuto da CPRIT Research Training Award RP140105, così come in parte sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01 GM114142 e da William &amp; Ella Owens Medical Research Foundation.

Tutti i tessuti sono ottenuti a seguito approvazione del comitato Institutional Review Board e quando tutti i partecipanti acconsentito ad entrambe le analisi molecolari e studi di follow-up. I protocolli sono approvati dal Comitato studi sugli esseri umani presso l&#39;Università del Texas Health Science Center a San Antonio. 1. Metil-legame al DNA di cattura (MBDCap) <ol><li> Raccolta dei campioni e l&#39;isolamento del DNA <ol><li> Raccogliere tumore alla rinfusa o normali campioni di tessuto da campioni di tessuto inclusi in paraffina paziente. </li><li> Utilizzare un mini DNA kit commerciale per isolare DNA genomico da campioni di tessuto inclusi in paraffina secondo il protocollo del produttore. </li><li> Utilizzare un kit di arricchimento DNA metilato con la procedura qui descritta secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Lavaggio tallone iniziale Nota: Le perle sono impiegati per accoppiare con MBD-biotina proteine, che rileva la metilazione del DNA sul genoma. Perle di solito sono sospesiin una soluzione madre. Utilizzare questa procedura per lavare questo liquido. <ol><li> Risospendere il magazzino di perline streptavidina (vedi Materiali Tavolo) pipettando gentilmente su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Non mescolare le perline nel vortex. </li><li> Per uno mg di DNA di ingresso, Add10 ml di perline per un tubo con 90 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio. Ruotare per 1 min. Non mescolare nel vortex. </li><li> Posizionare il tubo (s) su un sostegno magnetico per 1 min. </li><li> Rimuovere il liquido con una pipetta e scartare il liquido. </li><li> Aggiungere 250 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio ai talloni e ruotare per 1 min. </li><li> Ripetere i punti 1.2.3 - 1.2.5 due volte. </li></ol></li><li> Accoppiamento la proteina MBD-biotina alle perline <ol><li> Per 1.2 mg di DNA di input, aggiungere 7 ml (3,5 mg) di proteine ​​MBD-biotina ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere 93 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio alla proteina di fare un volume finale di 100 ml. </li><li> Mescolare il perline-proteinacomposto su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 1 h. </li></ol></li><li> Frammentato DNA (ingresso) <ol><li> DNA Sonicare con l&#39;aggiunta di 1,2 mg di DNA genomico totale in 96 ml di tampone TE e 24 ml di tampone di 5x / lavaggio Bind per ottenere una soluzione di 120 ml. Utilizzare 30 s ON potenza e 30 s OFF alimentazione durante sonicazione, 20 - 25 volte. </li><li> Eseguire 1 ml di soluzione di DNA sonicato utilizzando un sistema bioanalyzer con un kit commerciale DNA alta sensibilità per controllare la dimensione dei frammenti per essere nell&#39;intervallo di: 150 - 350 bp secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Lavare le MBD-perline <ol><li> Posizionare il tubo contenente MBD-perline su un sostegno magnetico per 1 minuto. </li><li> Rimuovere e gettare il liquido con una pipetta senza toccare le perline. </li><li> Risospendere le sfere con 250 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio. </li><li> Mescolare le perline su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Ripetere i punti 1.5.1 - 1.5.4 due volte. </li&gt; </ol></li><li> Reazione di cattura del DNA frammentato (1 mg DNA di ingresso) <ol><li> Trasferire la miscela di DNA / Buffer alla provetta contenente le MBD-perline. </li><li> Mescolare le MBD-perline con il DNA su un agitatore rotante per 1 ora a RT. In alternativa, mescolare O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Rimozione di DNA non catturato dalle perline <ol><li> Dopo la miscelazione il DNA e MBD-perline, posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min di concentrare tutte le perline sulla parete interna del tubo. </li><li> Rimuovere il surnatante con una pipetta e salvarlo in un free-DNasi provetta pulita microcentrifuga come DNA nonmethylated. Conservare questo campione sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 200 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio per le perline per lavare le perline. </li><li> Mescolare le perline su un agitatore rotante per 3 min. </li><li> Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min. </li><li> Rimuovere il liquido con una pipetta e salvarlo in una provetta. </li><li> per capture reazioni di ≤1 mg di DNA di ingresso, ripetere i punti 1.7.3 - 1.7.6 per altre 2 frazioni di lavaggio in totale. </li></ol></li><li> Eluizione frazione singolo <ol><li> Mescolare buffer di basso contenuto di sale con tampone alto contenuto di sale (1: 1) per ottenere tampone di eluizione (1.000 mm NaCl). </li><li> Risospendere le sfere in 200 microlitri di tampone di eluizione (1.000 mm NaCl). </li><li> Incubare le perline su un miscelatore rotante per 3 min. </li><li> Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min. </li><li> Con il tubo in posizione sulla griglia magnetica, rimuovere il liquido con una pipetta senza toccare le perle con la punta della pipetta, e salvarla in un 1,5 ml provetta senza DNasi pulito. Conservare questo campione sul ghiaccio. </li><li> Ripetere i punti 1.8.1 - 1.8.4 volta, raccogliendo il secondo campione nella stessa provetta (volume totale sarà di 400 microlitri). Conservare il campione in pool sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Etanolo precipitazioni (cleanup DNA) <ol><li> Per ogni noncaptured, lavaggio, e eluizione frazione from i passaggi precedenti, aggiungere 1 ml di glicogeno (20 mg / mL, incluso nel kit), il volume 1/10 campione di sodio acetato 3M, pH 5.2 (ad esempio, 40 ml per 400 ml di campione) e 2 volumi di campione di 100% etanolo (ad esempio, 800 microlitri per 400 microlitri di campione). Il volume totale è di 1.241 ml. </li><li> Mescolare bene e incubare a -80 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Centrifugare la provetta per 15 min a 11.363 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 500 ml di freddo il 70% di etanolo. </li><li> Centrifugare la provetta per 5 minuti a 11.363 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Ripetere i punti 1.9.6 - 1.9.7 volta e rimuovere ogni residuo di surnatante rimanente. </li><li> Far asciugare il pellet per ~ 5 min. Non asciugare completamente il pellet. </li><li> Risospendere il pellet di DNA in 37,5 ml di acqua priva di DNasi o altroadeguato volume di tampone. </li><li> Posizionare il DNA su ghiaccio o conservare il DNA a -20 ° C o al di sotto fino a nuovo uso. </li><li> Verificare che la quantità totale di DNA è superiore a 20 ng, (ad esempio, usare il sistema di quantificazione fluorimetrica, vedi Materiali Tavolo). </li></ol></li></ol> 2. Sequencing <ol><li> Utilizzare i frammenti di DNA recuperati dalla procedura MBDCap per il sequenziamento. Per ogni campione da sequenziato, un importo totale di 20 - 40 ng DNA è necessario per la preparazione biblioteca. </li><li> Per la preparazione biblioteca DNA-Seq usare un sistema di costruzione di biblioteche completamente automatizzato (vedi Materiali Tavolo) e seguire il protocollo standard fornito dal produttore. Selezionare i frammenti di DNA di dimensioni 200-400 bp per la preparazione biblioteca. Il sistema di preparazione biblioteca di automazione permette di standardizzare la procedura di preparazione biblioteca e riducendo al minimo la variazione tra i campioni a causa di preparazione manuale. </li><li> Utilizzare l&#39;adattatore Primers e portare a concentrazione 100x. Di questo, utilizzare 10 microlitri per ogni campione. </li><li> Seguendo passo 2.2, prendere la reazione, e quantificare la libreria di DNA-ss utilizzando un sistema di quantificazione fluorimetrico (vedi Materiali Tavolo). <ol><li> Impostare procedura di amplificazione PCR. La scelta di PCR master mix è di migliorare l&#39;efficienza della PCR di GC arricchito regione del genoma. In un tubo di PCR, aggiungere biblioteca 15 microlitri di DNA-ss, 25 microlitri PCR Master Mix (vedi Materiali Tavolo), 2 microlitri PCR Primer Mix (vedi Materiali Tavolo), e 8 ml H 2 O. </li></ol></li><li> Seguire raccomandazione PCR dal produttore del master mix PCR, alterando i tempi di ciclismo e le temperature per diversi materiali di partenza: 98 ° C per 45 s, X cicli di 98 ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s, quindi 72 ° C per 1 min. Tenere a 4 ° C. <ol><li> Perform abbastanza cicli di finire con 2-10 nM di DNA biblioteca (8 - 10 cicli). </li></ol></li><li> Pulire reazione PCR con rapporto 1: 1 di PCR perline purificazione secondo il protocollo del produttore (vedi Materiali Tavolo). </li><li> Eluire con 20 - 30 microlitri di tampone di eluizione. </li><li> Codice a barre ogni campione e piscina 4 campioni insieme in una corsia di una cella di flusso. Utilizzare il 50 bp unico protocollo lettura standard per il sequenziamento (vedi Materiali Tavolo). </li></ol> 3. Analisi Bioinformatica Nota: ulteriore processo i file FASTQ grezzi ottenuti dal sequenziamento per eseguire il controllo qualità e la mappatura delle brevi sequenze di DNA (legge) al genoma. <ol><li> Usa Bowtie breve lettura di allineamento, strumento di mappatura del genoma su ciascun file di esempio FASTQ per mappare la legge per il genoma di riferimento. Molti strumenti di mappatura di lettura sono a disposizione per eseguire questo passaggio e può essere utilizzato in base alle preferenze individuali. <ol><li> Attendere fino a 2 disallineamenti nel da te legge mentre la mappatura del genoma di riferimento. Segnala fino a 20 migliori allineamenti per ogni lettura. Ad esempio, utilizzare papillon -v 2 --migliore -k 20 --chunkmbs 200 &lt;ebwt&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;. </li></ol></li><li> Utilizzare LONUT 9 di recuperare il moltiplicano mappato legge per migliorare l&#39;individuazione delle regioni arricchite. Per ogni lettura, al più un allineamento potrebbe essere recuperato quando è abbastanza vicino a qualsiasi delle sopra dette picchi. Ad esempio, utilizzare: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 &lt;alignFile&gt; &lt;OutputPath&gt;. LONUT eseguirà le seguenti operazioni. <ol><li> allineamenti diviso in mappati in modo univoco legge e si moltiplicano mappati legge. Picco di chiamate sulla mappata univocamente legge utilizzando picco chiamante nastro 11. L&#39;opzione -w 250 e -p 99 nel comando esempio sono per la cintura. </li><li> Combina in modo univoco mappato legge con il recuperato letture ottenuto da LONUT, e il combinato legge, in formato LETTO, verranno utilizzati in ulteriori analisi. Calcolare il numero di CombinEd legge per il futuro la normalizzazione. </li></ol></li><li> Bin la legge. Estratto di legge nella regione di interesse utilizzando script perl: perl methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; up &lt;estende a monte lunghezza&gt; -dn &lt;valle lunghezza si estende&gt;. Per ogni file letto elencato nel sampleInfoFile, lo script perl esegue i compiti di seguito. Nota: Vedere file di codifica supplementare per lo script Perl. <ol><li> Bin la legge in formato bin fisso, ad esempio, 100 bp, per 24 cromosomi. </li><li> Per ogni gene specificato nel refGeneFile, estrarre i cassonetti intorno sito di inizio della trascrizione (TSS), fino alla lunghezza estensione specificata da un&#39;opzione up e -dn. Ad esempio, estrarre i dati nella regione che è a monte ea valle 4 kb di TSS. A bin dimensioni 100 bp, questo estratto i dati hanno 81 bidoni, e il bidone centrale corrisponde al TSS. </li><li> Per il gene sul filamento antisenso, capovolgere la regione estratta da sinistra a destra in modo che bidoni monte sono sempre placed sulla sinistra con lo script Perl. </li><li> Ulteriori dividere il TSS ± ​​regione 4 kb in tre regioni sub: a sinistra, a monte 4 kb a monte 2 kb; Medio, a monte ea valle 2 kb; A destra, a valle 2 kb a 4 KB. </li><li> Per ogni campione, dividere il conteggio di legge in ogni bin per il numero totale di combinati mappato letture calcolato 3.3.3. La normalizzazione eliminerà la specifica del campione leggere differenze e permette di confrontare la legge attraverso diversi campioni. </li></ol></li><li> Eseguire lo script bash (come indicato nel file script) per eseguire test statistico sul normalizzato letture ottenuti nella regione sinistra, per individuare metilazione differenziale tra normale e cassa gruppo nelle regioni descritti come nella regione del fianco. Nota: Vedere il file di codifica supplementare per lo script bash. Sulla base delle regioni che sono differenzialmente metilati, vi sono sette combinazioni: Tutta la regione: metilazione differenziale in tutta la TSS ± ​​regione 4 kb middleLeft: differenziale metilazione sia in regione centrale e di sinistra MiddleRight: differenziale metilazione nella regione sia centro e destra Fianco: differenziale metilazione sia in regione a destra ea sinistra A sinistra: metilazione differenziale nella regione solo a sinistra A destra: differenziale metilazione nella regione solo a destra Medio: differenziale metilazione nella regione centrale solo </li><li> Utilizzare lo stesso script bash per visualizzare la metilazione differenziale in una trama tornado. Tracciare le iper e ipo geni metilati su un pannello separato, e ordinare nell&#39;ordine della combinazione regione come descritto in 3.4, rispettivamente. </li></ol>

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</ol>

Questo protocollo è stato sviluppato nei laboratori del Dr. Tim Huang e il Dr. Victor Jin presso l&#39;Università del Texas Health Science Center a San Antonio.

La tecnica MBDCap-seq è un approccio arricchimento affinità 3, considerata un&#39;alternativa economica nell&#39;ambito delle indagini coorti con un grande numero di pazienti 15. Il gasdotto presentato qui descrive un approccio globale da approvvigionamento di esempio per l&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei dati. Uno dei passi più importanti è la creazione di una procedura di amplificazione PCR per migliorare l&#39;efficienza della PCR delle regioni GC arricchito nel genoma come questo è dove si verifica la metil...

Regolazione epigenetica di geni attraverso metilazione del DNA è uno dei meccanismi essenziali necessari per determinare il destino della cellula dalla differenziazione stabile di diversi tipi di tessuto nel corpo 1. Disregolazione di questo processo è stato conosciuto per causare varie malattie tra cui il cancro 2. Questo processo comporta principalmente l&#39;aggiunta di gruppi metilici sul residuo citosina in dinucleotidi CpG del DNA 3. Esistono alcune tecniche diverse attualmente utilizzate per indagare questo meccanismo, ciascuno con i propri vantaggi come indicato in molti studi 2-8. Qui discuteremo una di queste tecniche chiamati Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), dove utilizziamo una tecnica di affinità arricchimento per identificare le regioni metilato del DNA. Questa tecnica si basa sulla capacità metil-legame della proteina MBD2 per arricchire i frammenti di DNA genomico contenenti denaturato siti CpG. Utilizziamo un kit di arricchimento DNA metilato commercialeper l&#39;isolamento di tali regioni metilati. Il nostro laboratorio ha proiettato in centinaia di campioni di pazienti con questa tecnica e qui mettiamo a disposizione un protocollo ottimizzato completo, che può essere utilizzato per studiare grandi coorti di pazienti. Come evidente con qualsiasi tecnologia di sequenziamento di prossima generazione, MBDCap-ss richiede anche un approccio bioinformatico specifiche al fine di quantificare con precisione i livelli di metilazione attraverso i campioni. Ci sono stati molti studi recenti, nel tentativo di ottimizzare il processo di normalizzazione e l&#39;analisi dei dati di sequenziamento 9, 10. In questo protocollo, dimostriamo uno di questi metodi di attuazione di un approccio unico di recupero lettura - LONUT - seguita dalla normalizzazione lineare di ogni campione, al fine di consentire il confronto imparziali attraverso gran numero di campioni di pazienti.

<table><tbody><tr><td>Kit di arricchimento del DNA Methylminer</td><td>Invitrogen</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus Dispositivo di sonicazione</td><td>diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato di sodio, pH 5,2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks Sistema di libreria di frammenti I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>Sistema di costruzione di librerie completamente automatizzato</td></tr><tr><td>Adattatori Primer</td><td>Bioo Scientific</td><td>514104</td><td>Miscela di primer per PCR</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Sistema di quantificazione fluorimetrica</td></tr><tr><td>Miscela master per PCR</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>Miscela master per PCR</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Perle di purificazione per PCR Tampone</td></tr><tr><td>EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sistema di sequenziamento</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metil-binding cattura sequenziamento del dna per tessuti del paziente

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

La metilazione è una delle modificazioni epigenetiche essenziali al DNA, che è responsabile per la precisa regolazione dei geni necessari per lo sviluppo stabile e differenziazione dei diversi tipi di tessuto. Disregolazione di questo processo è spesso il segno distintivo di varie malattie come il cancro. Qui, si delineano uno dei recenti tecniche di sequenziamento, Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), utilizzato per quantificare la metilazione in vari tessuti normali e di malattia per i grandi coorti di pazienti. Descriviamo un protocollo dettagliato di questo approccio arricchimento affinità con un oleodotto bioinformatica per raggiungere quantificazione ottimale. Questa tecnica è stata utilizzata per sequenziare centinaia di pazienti in vari tipi di cancro come parte del progetto 1.000 methylome (Cancer Methylome System).

Abbiamo usato MBDCap-seq per studiare alterazioni di metilazione del DNA in un gran numero di pazienti da diversi tipi di cancro compresi seno 12, dell&#39;endometrio 13, prostata 14, e tumori del fegato, tra gli altri. Qui mostriamo alcune informazioni dallo studio del cancro al seno pubblicato di recente 12. In questo caso, abbiamo utilizzato l&#39;intero approccio di sequenziamento del genoma per identificare isole CpG che sono differenziale metilato nei tumori rispetto al normale nelle diverse...

Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è studiare in modo sistematico il panorama della metilazione del DNA a livello genoma intero in ampie coorti di pazienti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epigenetica, in particolare riguardo a quali regioni del panorama della metilazione del DNA risultano deregolate nei pazienti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che un elevato numero di pazienti può essere analizzato in modo economicamente conveniente.Questa tecnologia può avere implicazioni positive nella terapia e nella diagnosi del paziente, poiché possiamo indagare biomarcatori esistenti e identificare anche nuovi biomarcatori. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui gruppi di pazienti, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la metilazione del DNA in cellule derivate da linee cellulari coltivate da campioni di origine murina. A dimostrare questa procedura insieme al dottor Ya-Ting Hsu sarà il signor Joseph Liu, un tecnico del nostro laboratorio.La parte relativa al sequenziamento sarà dimostrata dalla signora Dawn Garcia, tecnico del nostro laboratorio di sequenziamento. Dopo aver isolato il DNA genomico da

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Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Immunoprecipitazione DNA metilato

Il gold standard per l'analisi di metilazione del DNA è il sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito. Questo metodo sfrutta l'accresciuta sensibilità della citosina rispetto ai 5-metilcitosina (5-MEC) di bisolfito deaminazione in condizioni acide. Cytosines non metilato può essere distinto dal cytosines metilato dopo amplificazione del DNA genomico di destinazione.

Metilazione del DNA: Modifica bisolfito e analisi

Un flusso di lavoro semplificato per studiare la metilazione del DNA e le variazioni di espressione genica su prime fasi di vita di stress viene mostrato. Partendo dalla separazione materna di topi neonati ed isolamento di tessuti cerebrali discreti, si rappresenta un protocollo per isolare simultaneamente DNA e RNA dai punzoni tessuto cerebrale per sequenziamento bisolfito successivo e RT-PCR.

Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l&#39;espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l'arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l'arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

Questo video dimostra la procedura di modifica del bisolfito del DNA genomico da campioni di cancro gastrointestinale. La tecnica è utile per studiare la relazione tra i modelli di metilazione dei geni e stabilire il loro contributo alla cancerogenesi.

Conversione del bisolfito del DNA genomico: un metodo per studiare la metilazione del DNA in campioni di DNA genomico da tessuto tumorale gastrointestinale

Il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta potenziata è un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento per l'analisi della metilazione del DNA basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la conversione del bisolfito di citosina. Questo protocollo richiede 50 ng di materiale di partenza e produce dati di risoluzione delle coppie di basi in regioni genomiche ricche di GC.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

Il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito (BSAS) è un metodo per quantificare la metilazione della citosina in regioni genomiche mirate di interesse. Questo metodo utilizza la conversione del bisolfito abbinata all'amplificazione PCR delle regioni target prima del sequenziamento di nuova generazione per produrre una quantificazione assoluta della metilazione del DNA a livello base-specifico.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

Questo lavoro descrive un protocollo di sequenziamento del dominio di binding di metil-CpG (MBD) ottimizzato e una pipeline computazionale per identificare le regioni ricche di CpG riccamente differenziate in pazienti con leucemia linfocitaria cronica (CLL).

Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

Qui, descriviamo il protocollo e l'implementazione di metil-Seq, una piattaforma di epigenomic, utilizzando un modello del ratto per identificare i cambiamenti epigenetici associati all'esposizione a stress cronico. I risultati dimostrano che la piattaforma di metil-Seq ratto è in grado di rilevare differenze di metilazione che derivano dall'esposizione di sforzo in ratti.

Una piattaforma di metil-Seq ratto per identificare i cambiamenti epigenetici connessi con l'esposizione di sforzo

Qui descriviamo una procedura per l'analisi a livello genomico della metilazione del DNA nei tumori gastrointestinali. La procedura è rilevante per studi che studiano le relazioni tra i modelli di metilazione dei geni e i fattori che contribuiscono alla carcinogenesi nei tumori gastrointestinali.

Analisi a livello genomico della metilazione del DNA nel cancro gastrointestinale

Qui, presentiamo un protocollo per la selezione in vitro di repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) con un'efficienza di silenziamento alta, a lungo termine, stabile, on-target e bassa attività a livello di genoma, off-target. Questo flusso di lavoro consente di ridurre un repertorio iniziale e complesso di ETR candidati a un breve elenco, adatto per un'ulteriore valutazione in contesti terapeuticamente rilevanti.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Scopri il sequenziamento MBDCap-seq per analizzare la metilazione del DNA su larga scala in coorti di pazienti. Questo metodo computazionale identifica biomarcatori epigenetici per diagnosi e terapia clinica.

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

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