Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente
31 ottobre 2016
Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di studiare sistematicamente il panorama della metilazione del DNA a livello di genoma in grandi coorti di pazienti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo epigenetico, in particolare per quanto riguarda quali regioni nel panorama della metilazione del DNA vengono deregolate nei pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di pazienti può essere studiato in modo economico.
Questa tecnologia può avere implicazioni positive nella terapia e nella diagnosi del paziente perché possiamo studiare i biomarcatori esistenti e anche identificare nuovi biomarcatori. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla coorte di pazienti, può essere applicato anche ad altri sistemi come la metilazione del DNA in cellule derivate da linee cellulari coltivate da campioni derivati da topi. A dimostrare questa procedura insieme al Dr.Ya-Ting Hsu sarà il signor Joseph Liu, un tecnico del nostro laboratorio.
La parte di sequenziamento sarà dimostrata dalla signora Dawn Garcia, che è un tecnico del nostro nucleo di sequenziamento. Dopo aver isolato il DNA genomico dal tumore o dal tessuto normale secondo il protocollo di testo, aggiungere 1,2 microgrammi di DNA genomico totale a 96 microlitri di tampone TE e 24 microlitri di tampone di lavaggio con legame 5X per ottenere una soluzione da 120 microlitri. Sonicare la soluzione di DNA per 30 secondi, quindi lasciarla riposare per 30 secondi.
Ripetere la sonicazione per un totale di 20-25 volte. Utilizzare un sistema di bioanalizzatore con un kit di DNA ad alta sensibilità in commercio secondo il protocollo del produttore per eseguire un microlitro di soluzione di DNA sonicato per verificare le dimensioni dei frammenti. Dovrebbero essere compresi tra 150 e 350 coppie di basi.
Per eseguire l'eluizione a frazione singola, preparare il tampone di eluizione preparando una soluzione uno a uno di tampone a basso contenuto di sale e tampone ad alto contenuto di sale. Utilizzare 200 microlitri di tampone di eluizione per risospendere il DNA metilificante o le microsfere MBD e incubare la sospensione su un miscelatore rotante per tre minuti. Dopo l'incubazione, posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica per un minuto, quindi pipettare accuratamente il liquido senza toccare la punta della pipetta sulle perle e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pulita e priva di DNasi.
Conservare questo campione sul ghiaccio. Ripetere l'eluizione per il secondo campione e raccoglierlo nella stessa provetta del primo campione. A ciascuna frazione di lavaggio e diluizione non catturata, aggiungere un microlitro di glicogeno, un decimo del volume di tre molari di acetato di sodio, pH 5,2 e due volumi di campione di etanolo al 100%.
Dopo aver mescolato bene la soluzione, incubare a meno 80 gradi Celsius per almeno due ore. Quindi centrifugare la reazione a 11, 363 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70%.
Girare nuovamente il tubo prima di ripetere il lavaggio con etanolo. Asciugare il pellet all'aria per cinque minuti. Quindi utilizzare acqua priva di DNasi o tampone per risospenderlo.
Verificare che la quantità totale di DNA sia superiore a 20 nanogrammi secondo il protocollo di testo. Quindi posizionare il DNA su ghiaccio o conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Per la preparazione delle librerie di sequenziamento del DNA, utilizzare un sistema di costruzione delle librerie completamente automatizzato e seguire il protocollo standard fornito dal produttore.
Selezionare frammenti di DNA di lunghezza compresa tra 200 e 400 coppie di basi per la preparazione della libreria. Dopo aver preparato la libreria di sequenziamento del DNA, rimuovere la reazione e utilizzare un sistema di quantificazione fluorimetrica per quantificare la libreria di sequenziamento del DNA. Per impostare una reazione di amplificazione PCR, in una provetta PCR aggiungere 15 microlitri di libreria di sequenziamento del DNA, 25 microlitri di master mix PCR, due microlitri di primer mix PCR e otto microlitri di acqua.
Utilizzare il programma descritto nel protocollo di testo, apportando le modifiche necessarie in base alle raccomandazioni del produttore della miscela PCR. Eseguire cicli sufficienti per produrre da due a 10 millimolari di DNA di libreria. Dopo aver ripulito le reazioni PCR, codificare ogni campione con un codice a barre e riunire quattro campioni in una corsia di una cella a flusso.
Utilizza il protocollo standard a lettura singola a 50 coppie di basi del nostro sequenziamento. Eseguire la bioinformatica secondo il protocollo del testo. Utilizzando il cap MBD per cercare di identificare le isole CpG in diverse regioni genomiche che sono metilate in modo differenziale nel tumore rispetto al tessuto normale, questo studio ha rivelato che delle isole CpG totali situate nei promotori genici, il 19,5% ha mostrato una metilazione differenziale nei tumori rispetto al normale.
Allo stesso modo, il 55,2% delle isole CpG intrageniche studiate ha mostrato una metilazione differenziale. I promotori intragenici hanno mostrato il 28,1% e per i promotori genici senza isole CpG, l'1,8% ha mostrato una metilazione differenziale. Questa mappa di calore mostra chiaramente le regioni differenzialmente metilate in 77 tumori al seno, 10 tessuti normali al seno e 38 linee cellulari di cancro al seno.
In questa figura, la metilazione è quantificata in due sottogruppi di cancro dell'endometrio, non ricorrente vs. ricorrente, in due pazienti in diversi siti CpG nell'isola del promotore CpG del gene bersaglio identificato SFRP1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque giorni se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare prima la qualità di un DNA genomico in fase di test. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi come il pirosequenziamento per rispondere a domande come: quali sono i CpG esatti nelle regioni differenzialmente arricchite identificate che sono state alterate? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare la metilazione del DNA in grandi coorti di pazienti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la metilazione del DNA a livello di genoma nei campioni dei pazienti utilizzando la tecnica di sequenziamento del tappo MBD. Tenete presente che a volte può essere difficile catturare l'alta qualità del DNA da campioni di FFP e DNA, quindi viene sempre effettuata una corretta valutazione del DNA genomico quando eseguiamo la procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per lo studio della metilazione del DNA a livello genoma in ampie coorti cliniche di pazienti mediante la tecnologia MBDCap-seq. Il metodo mira a svelare informazioni fondamentali sul paesaggio epigenetico e sulle sue implicazioni per la diagnosi e la terapia dei pazienti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Epigenetica
- Genomica
- Ricerca clinica
Sfondo
- La metilazione del DNA svolge un ruolo cruciale nella regolazione genica.
- Comprendere i modelli di metilazione può rivelare biomarcatori per le malattie.
- Studi su larga scala possono aumentare la potenza statistica dei risultati.
- MBDCap-seq è un metodo economico per analizzare la metilazione del DNA.
Scopo dello studio
- Studiare sistematicamente il panorama della metilazione del DNA in coorti di pazienti.
- Identificare regioni deregolate nel panorama della metilazione del DNA.
- Esplorare biomarcatori esistenti e nuovi per la terapia e la diagnosi.
Metodi Utilizzati
- Sequenziamento con cattura del DNA legato alla metilazione (MBDCap-seq)
- Pipeline di analisi bioinformatica
- Applicazione a campioni derivati da pazienti e linee cellulari in coltura
- Collaborazione con tecnici di laboratorio per la dimostrazione del protocollo
Risultati principali
- Identificazione di modifiche chiave della metilazione in campioni di pazienti.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo a diversi sistemi biologici.
- Potenziale scoperta di nuovi biomarcatori per l'uso clinico.
- Approccio economico per studi epigenetici su larga scala.
Conclusioni
- MBDCap-seq è uno strumento prezioso per comprendere la metilazione del DNA in contesti clinici.
- Il metodo può portare a progressi nella diagnosi e nel trattamento dei pazienti.
- Studi futuri potranno ampliare i risultati ottenuti per esplorare altri contesti biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
MBDCap-seq consente un'analisi della metilazione del DNA su larga scala e conveniente in coorti di pazienti, sostenendo la scoperta di biomarcatori e la validazione di bersagli epigenetici in oncologia e in altre aree di patologia. Il metodo fornisce dati quantitativi sulla metilazione che possono guidare la riduzione del rischio dei bersagli e le strategie di biomarcatori traslazionali. La sua applicazione a centinaia di campioni di pazienti dimostra l'utilità per lo screening epigenetico rilevante per il portafoglio e la generazione di approfondimenti meccanicistici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della disregolazione epigenetica in tessuti rilevanti per la malattia, supportando la verifica di ipotesi sui bersagli.
- Valore operativo: Fornisce dati di metilazione a livello del genoma da campioni di pazienti per chiarire il coinvolgimento delle vie biologiche e prioritizzare i bersagli.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico identificando regioni diversamente metilate associate a fenotipi tumorali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative della metilazione delle isole CpG in promotori, regioni intrageniche e promotori non-CpG per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Fornisce un profilo di metilazione riproducibile e scalabile, compatibile con studi su ampie coorti e con l'integrazione in biobanche.
- Valore scientifico: Consente la preparazione di dataset epigenetici validati per flussi di lavoro di screening successivi e per la validazione di biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i risultati della metilazione nella fase di scoperta alla rilevanza clinica attraverso l'analisi di tessuti derivati da pazienti.
- Valore operativo: Favorisce la continuità traslazionale consentendo l'analisi della metilazione in modelli normali, tumorali e di linee cellulari.
- Valore scientifico: Facilita decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio collegando i cambiamenti di metilazione a sottogruppi di malattia (ad esempio, cancro endometriale ricorrente rispetto a non ricorrente).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
MBDCap-seq si inserisce nel percorso dalla scoperta alla traduzione fornendo un profilo epigenetico che orienta la validazione degli obiettivi, la prontezza dei saggi e i processi decisionali preclinici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi epigenetici nell'insorgenza tumorale e nei percorsi di differenziazione.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e riproducibili sulla metilazione, consentendo confronti affidabili tra sistemi di pazienti e modelli.
- Analisi: Genera metriche di metilazione differenziale (ad esempio, il 19,5% delle isole CpG promotoriali, il 55,2% delle isole intrageniche) per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i cambiamenti di metilazione nei tessuti dei pazienti a fenotipi clinici, favorendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di profilazione epigenetica riutilizzabile applicabile a diversi tipi di cancro e contesti patologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi rivelando alterazioni epigenetiche nei tessuti malati.
- Valore operativo: Consente un'analisi della metilazione ad alto rendimento ed economicamente vantaggiosa per ampie coorti di pazienti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione degli obiettivi epigenetici.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sul rischio attraverso la scoperta quantitativa di biomarcatori nei paesaggi di metilazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in epigenetica, biologia molecolare e bioinformatica per l'esecuzione del protocollo e l'interpretazione dei dati.
- È dipendente dalla sonificazione, dal catturaggio basato su microsferette magnetiche e da infrastrutture di sequenziamento per la preparazione e l'analisi delle librerie.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la valutazione della qualità del DNA, la verifica delle dimensioni dei frammenti e la coerenza dell'eluzione.
- Richiede considerazioni adattative quando applicato a diversi tipi di campioni, come FFPE, cellule in coltura o tessuti derivati da topo.
- Limite pratico: il successo dipende dall'input di DNA genomico di alta qualità, in particolare da campioni clinici difficili.
