FRET Imaging in idrogel tridimensionali

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è quello di consentire lo studio in tempo reale della segnalazione intracellulare utilizzando l'imaging FRET di cellule incorporate all'interno di idrogel tridimensionali che imitano i tessuti naturali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, della farmacologia e della medicina rigenerativa, come lo sviluppo di biomateriali ottimali e lo screening di farmaci ad alto rendimento in microtessuti 3D ingegnerizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che FRET può essere utilizzato su un gran numero di cellule in numerosi tipi di idrogel utilizzando sistemi di microscopio convenzionali ad ampio campo.

Dopo aver fabbricato gli stampi per la colata di idrogel e aver sospeso le cellule coltivate in soluzione di idrogel, secondo il protocollo di testo, in una cappa di coltura tissutale, aggiungere la cellula contenente il precursore agli stampi di colata utilizzando una tecnica sterile. Prima della reticolazione, centrare le cellule sospese nel precursore dell'idrogel per ottimizzare l'imaging confinando le cellule su un singolo piano focale e riducendo al minimo il segnale fuori dal piano. Successivamente, per reticolare gli idrogel di PC, utilizzare una sorgente di luce UVA per un tempo di esposizione pari a 3,2 joule per centimetro quadrato per millimetro di spessore per irradiare la cella contenente il precursore.

In alternativa, utilizzare una lampada dentale portatile meno costosa. Evitare di sovraesporre l'idrogel, perché ciò ridurrà la vitalità cellulare. Gli idrogel reticolanti fisicamente sono invece posizionati a 37 gradi Celsius.

Dopo la reticolazione, rimuovere lo stampo di colata in idrogel PDMS e sostituirlo con il piatto PDMS precedentemente preparato. Utilizzare una spatola sterile per premere il PDMS sul vetro per farlo aderire. Aggiungere un terreno privo di fenolo e privo di siero o un terreno chimicamente definito al pozzetto creato nel piatto PDMS con un vetrino coprioggetti per mantenere l'idrogel immerso.

Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta che la capsula PDMS con l'idrogel è stata fissata sul tavolino del microscopio e l'olio è stato applicato all'obiettivo, utilizzare la luce trasmessa per trovare almeno 15 cellule per l'imaging e verificare la trasfezione con l'imaging a fluorescenza. Nel software del microscopio, configurare le impostazioni della fotocamera per i canali immagine FRET scegliendo tra alcune celle vicino al centro del campo visivo e ottimizzare l'esposizione e il guadagno per canale immagine secondo il protocollo di testo.

Scegli celle vicine al centro dell'idrogel, all'interno del campo di illuminazione relativamente piatto che non siano né troppo luminose né troppo deboli e con un rapporto FRET compreso tra 00 e 1,0. Quindi, selezionare più campi visivi per acquisire immagini per almeno 15 celle trasfettate. Al termine, spegnere la luce per limitare l'esposizione.

Per configurare la velocità di acquisizione per l'acquisizione di immagini time lapse, immettere la periodicità delle acquisizioni. Utilizzare una velocità rapida per l'acquisizione del segnale di base, ad esempio ogni cinque secondi per campo visivo, e una velocità più lenta per la successiva cinetica di segnalazione a lungo termine. Selezionare Esegui ora per avviare l'acquisizione delle immagini e acquisire le immagini per cinque minuti per stabilire una linea di base per la risposta della sonda nel campo visivo designato.

Dopo i cinque minuti di acquisizione dell'immagine, pipettare l'agonista o l'antagonista desiderato, miscelare pipettando e continuare con l'imaging. Dopo aver eseguito la calibrazione FRET secondo il protocollo di testo, nel software del microscopio selezionare la freccia sull'icona della regione di sfondo di interesse e scegliere Disegna regione di sfondo ellittica di interesse. Disegna e designa un'area di interesse, o ROI, per campo visivo vicino alle celle per definire il livello di sfondo.

Assicurati che l'opzione Continua ad aggiornare lo scostamento dello sfondo sia selezionata, quindi attiva la visualizzazione dell'area di sfondo di interesse facendo clic sull'icona Area di sfondo di interesse. In alternativa, scegliere l'icona della regione di interesse e impostare le proprietà della regione di interesse come Usa come sfondo Regione di interesse e Le regioni di interesse sono diverse in ogni Multi Point. Utilizzando l'icona di sfondo della regione di interesse, selezionare Sottrai sfondo utilizzando la regione di interesse.

Nella finestra pop-up, in Sottrai area di sfondo di interesse, seleziona Ogni immagine e in Applica a, seleziona Tutti i fotogrammi. Per ogni campo visivo, per definire una regione di interesse intorno alla cella utilizzando il canale di emissione accettore e una maschera binaria, utilizzare il menu Binario, Definisci soglia e selezionare Applica al fotogramma corrente. Quindi, regola la soglia inferiore per selezionare le celle.

Quindi, utilizzare la funzione Chiusura binaria per riempire i buchi nella maschera binaria, se necessario. Quindi, utilizzare l'icona Regione di interesse per selezionare Copia file binario nella regione di interesse per salvare la maschera binaria come regioni di interesse. Aggiungere le regioni di interesse per i campi visivi successivi al pool esistente di regioni di interesse.

Elimina tutte le regioni spurie di interesse. Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse sulle regioni di interesse e verifica che le loro proprietà siano Usa come regione di interesse standard e che le regioni di interesse siano diverse in ogni Multi Point. La regione cellulare di interesse può essere disegnata a mano, ma è necessario prestare attenzione a rimuovere i valori spuri.

Il protocollo contiene procedure per le cellule che si trovano al di fuori del campo di illuminazione piatto e per i microscopi che non hanno un campo piatto. La centrifugazione dei precursori dell'idrogel prima della gelificazione ha massimizzato il numero di cellule su un piano focale vicino al vetrino coprioggetti. Ciò ha ridotto al minimo il rumore di fondo e aumentato la produttività delle immagini.

In questo esperimento FRET, per il calcolo dell'emissione estinta, o QE, del rapporto FRET, sono state necessarie solo due immagini per la sonda ICUE1 binaria a catena singola, tra cui QE uguale a CFP CFP per eccitazione ed emissione e emissione accettore uguale a YFP YFP per eccitazione ed emissione. Sono stati selezionati più campi visivi in cui diverse celle risiedevano all'interno dell'area di illuminazione omogenea, come mostrato qui. Le ROI per la correzione dello sfondo dei segnali dei canali e per l'analisi delle celle sono state designate utilizzando immagini di emissione accettore a soglia fin dall'inizio degli esperimenti.

Inoltre, come mostrato qui, sono state selezionate cellule che esprimevano una sonda sufficiente. Sono stati calcolati i rapporti FRET QE e di emissione sensibilizzata per pixel e il rapporto FRET medio per cella. È stato calcolato l'inverso del rapporto SE ed entrambi i rapporti sono stati normalizzati.

Sotto la stimolazione della forskolina , sia i rapporti Fret basati su QE che SE rilevano l'aumento dell'attività ciclica dell'AMP nei condrociti. Sia i gel reticolati fisicamente che quelli reticolati chimicamente hanno mostrato un aumento del rapporto FRET QE nel tempo, indicando un aumento della risposta di segnalazione AMP ciclica all'aggiunta di forskolina. Questa procedura può essere utilizzata con altre tecniche di microscopia come FRAP, flim fret e fret e misurazione dell'anisotropia, per rispondere a domande come quali sono le differenze di permeabilità e singling cellulare tra diversi tipi di microtessuti.

Poiché la reticolazione viene temprata vicino al PDMS, è importante ricordare di progettare gli stampi per gli idrogel fotoreticolanti di diametro leggermente più grande degli idrogel stessi.