Name: FRET Imaging in idrogel tridimensionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Impara l'imaging FRET in idrogel tridimensionali per studiare la segnalazione intracellulare in tempo reale. Questa tecnica consente analisi ad alto rendimento di cellule in microambienti che mimano i tessuti naturali.

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Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della School of Dental Medicine dell'Università di Pittsburgh, il premio K01 AR062598 del National Institutes of Health e la sovvenzione P30 DE030740. Gli autori ringraziano anche il Dr. Jin Zhang per il plasmide ICUE1, Wayne Rasband per lo sviluppo di ImageJ e Michael Cammer per la macro ImageJ.

Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.

Questo lavoro dimostra come l'imaging FRET possa essere utilizzato per analizzare la segnalazione cellulare negli idrogel 3D. Mentre studi precedenti hanno dimostrato l'imaging FRET di cellule seminate su substrati di idrogel35-37, di interazioni extracellulari con idrogel38 e di molecole intrappolate in idrogel39-41, questa è la prima pubblicazione a descrivere l'analisi intracellulare basata sull'imaging FRET di cellule incorporate in idrogel 3D. Il lavoro risolve diversi problemi di implementazione durante la traduzione dell'imaging FRET da 2D a 3D. In primo luogo, sono necessari obiettivi ad alta apertura numerica affinché l'imaging FRET raccolga un segnale di emissione sufficiente, ma limitano la profondità di campo. Le celle qui vengono lasciate depositare leggermente tramite centrifugazione per aumentare il numero di celle in un piano focale vicino al vetro per compensare questo. In secondo luogo, gli scaffold 3D in idrogel possono spostarsi attraverso il campo visivo durante l'imaging, complicando l'analisi. Gli idrogel qui sono legati al vetrino coprioggetti in modo che rimangano fissati per tutta la durata dell'esperimento. In terzo luogo, la selezione di composizioni di idrogel appropriate per il FRET 3D è essenziale perché gli idrogel possono ostacolare la visualizzazione delle cellule. Qui vengono utilizzati idrogel trasparenti di PC-gel e TR-gel. Tuttavia, la raccolta delle cellule con centrifugazione su un piano focale vicino al vetrino coprioggetti può essere utilizzata per visualizzare le cellule in idrogel con diffrazione più elevata. La scelta dell'idrogel dipende dalle condizioni del microambiente che devono essere simulate, che si possono trovare in una recensione sugli idrogel42. In quarto luogo, qui viene impiegato un calcolo alternativo per il rapporto FRET della sonda ICUE1 a catena singola (cioè EQE = QE/cAem) per ridurre al minimo il numero di canali di immagine necessari per l'analisi e quindi ridurre al minimo il fotosbiancamento. Il rapporto FRET medio per cella viene calcolato come la media dei rapporti per pixel all'interno di una cella per ridurre al minimo la sottostima del rapporto FRET effettivo. Infine, viene descritta un'analisi raziometrica lineare e i mezzi per calcolare la frazione attivata di sonde binarie a catena singola.
Ci sono diversi aspetti critici per eseguire esperimenti FRET di successo utilizzando la microscopia a campo largo. Per quanto riguarda l'hardware, la telecamera deve essere sufficientemente sensibile da risolvere piccoli cambiamenti di segnale, lasciando le nuove telecamere CMOS scientifiche e i CCD a moltiplicazione di elettroni più adatti rispetto ai CCD convenzionali. Per analizzare al meglio la distribuzione spaziale del rapporto FRET, la camera deve possedere almeno il doppio della risoluzione spaziale della funzione di diffusione del punto dell'obiettivo (criterio di Nyquist). Ciò rende i sistemi a doppia vista meno adatti all'attività. Più cruciale è selezionare un'esposizione appropriata e una velocità di acquisizione dell'immagine per la data coppia di FRET in modo da ridurre al minimo il fotobleaching dei fluorofori. Si consiglia di ridurre il tasso di acquisizione all'aumentare della durata dell'esperimento. L'uso di ruote portafiltri rapide aumenta la velocità di acquisizione e il numero di FOV per l'analisi, evitando i problemi di registrazione delle immagini con i cubi filtro a doppia visualizzazione e a torretta. Il campo di illuminazione disomogeneo complica la correzione della fluorescenza di fondo che deriva dall'autofluorescenza del campione e dal rumore del sistema di telecamere. Alcuni idrogel, in particolare quelli contenenti proteine collageniche, sono altamente autofluorescenti43,44. I rapporti FRET sono sottostimati senza correzione di fondo. Qui impieghiamo un semplice metodo di correzione dello sfondo che si basa sul campo di illuminazione relativamente piatto che spesso può essere configurato con l'illuminazione a epifluorescenza al centro dell'immagine (Figura 3B, Passaggio 7.2). Questo metodo quindi limita le celle di interesse a quelle all'interno di questo campo di illuminazione. La correzione di fondo qui descritta non tiene conto dell'autofluorescenza cellulare nelle lunghezze d'onda lette per la sonda binaria. In tal caso, le cellule non marcate (nessuna trasfezione della sonda) devono essere visualizzate nelle stesse condizioni e lo sfondo deve essere sottratto. È possibile utilizzare una combinazione di celle etichettate e non etichettate e selezionare le celle non etichettate per il ROI di base. I metodi alternativi che prevedono l'analisi delle cellule sull'intero campo dell'immagine includono l'uso di una maschera di ombreggiatura, ROI di sfondo multipli o campioni identici senza celle e un protocollo è disponibile su richiesta.
Specificamente per l'imaging FRET 3D, la risposta della sonda è altamente sensibile alla permeabilità dell'idrogel all'analita (Figura 6). Pertanto, le stesse regioni di idrogel vengono confrontate tra trattamenti sperimentali, preferibilmente in un punto di simmetria geometrica come vicino al centro dell'impalcatura come usato qui. In alternativa, possono essere impiegate camere microfluidiche/bioreattori per perfondere rapidamente e uniformemente l'idrogel con la soluzione di analita45. Un segnale FRET potrebbe non essere rilevato (il rapporto segnale/rumore è troppo basso) quando l'autofluorescenza dell'idrogel è troppo alta; Dovrebbe essere utilizzato un idrogel più sottile o una sonda diversa (fluorofori diversi). Per quanto riguarda l'imaging FRET 3D in idrogel fotoreticolati, si raccomanda l'uso di un'esposizione minima all'irradiazione e di lunghezze d'onda al di fuori degli spettri di eccitazione dei fluorofori della sonda. Il LAP può essere utilizzato con una sorgente di luce visibile a 405 nm per ridurre ulteriormente il potenziale danno cellulare31,46. Tuttavia, si consiglia di utilizzare il LAP con irradiazione a 365 nm perché riduce al minimo lo sbiancamento della sonda. 365 nm si trovano all'estremità finale dello spettro di eccitazione del donatore di CFP, mentre 405 nm si trovano al picco di eccitazione. In alternativa, l'espressione della sonda può essere lasciata recuperare per un giorno. L'uso di sonde binarie riduce al minimo i problemi di sensibilità alle differenze nei livelli di espressione e nella diffusione molecolare dei fluorofori donatori e accettori. Possono essere utilizzate sonde non binarie, ma con SE invece dell'imaging QE e correzione aggiuntiva per il bleed-through spettrale degli spettri di eccitazione ed emissione (vedi sotto). Inoltre, la scarsa disponibilità commerciale e la complessità nella progettazione delle sonde FRET possono essere un ostacolo. Il fattore più critico per il successo degli esperimenti rimane la corretta correzione e analisi dei segnali di fluorescenza.
Un calcolo alternativo del rapporto FRET viene utilizzato per diversi motivi aggiuntivi oltre alla minimizzazione del fotobleaching. Per le sonde binarie a catena singola, il rapporto comunemente riportato è l'emissione accettore sotto eccitazione del donatore (emissione sensibilizzata, SE) e l'emissione del donatore sotto eccitazione del donatore (emissione quenched, QE), cioè il rapporto FRET = SE/QE25,47,48. SE/QE non è lineare rispetto alle variazioni dell'efficienza FRET21,22,47. Vale a dire, il rapporto ha una relazione esponenzialmente non lineare con l'efficienza FRET intrinseca della sonda (Ei) (Donius, A. E., Taboas, J. M. lavoro non pubblicato. (2015)), con il rapporto più lineare per Ei inferiore a circa il 15%. SE/QE sottostimerà anche la frazione di sonde attivate (FAP, cioè frazione di analita legante le sonde). Pertanto, l'analisi di SE/QE richiede un ingombrante studio dose-risposta all'equilibrio e l'adattamento della curva. Fortunatamente, i rapporti tra SE o QE e l'emissione accettore sotto eccitazione accettore (Aem) sono lineari rispetto all'Ei e al FAP, cioè i rapporti FRET SE/Aem e QE/Aem. SE/Aem viene spesso utilizzato per le sonde binarie e richiede solo la calibrazione dell'endpoint (in assenza di attività della sonda e con piena attività della sonda), ma la segnalazione cellulare basale rende difficile questa operazione. Per eliminare la necessità di calibrazione del punto finale, l'SE può essere corretto (cSE) per la sovrapposizione spettrale degli spettri di eccitazione ed emissione del donatore e dell'accettore (spectral bleed-through) e per la resa quantica e la sensibilità spettrale (QS) dei fluorofori a sonda combinati e del sistema di imaging al microscopio. Il rapporto FRET SE corretto basato su cSE definisce l'efficienza FRET osservata delle sonde all'interno di ciascun pixel di un'immagine, ovvero ESE = cSE/Aem. Sono disponibili software commerciali e gratuiti per correggere SE per questi effetti e il lettore è rimandato al lavoro di Chen e Periasamy 2006 per una spiegazione dettagliata dei metodi50. Tuttavia, il calcolo di ESE richiede l'acquisizione di tre canali di immagine per punto temporale (SE, QE, Aem). Pertanto, in questo lavoro impieghiamo anche un rapporto FRET alternativo EQE = 1 - QE/cAem, che richiede l'acquisizione di soli due canali di immagine (QE e Aem). Il calcolo di EQE da questi canali richiede solo la correzione di Aem per QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem/Aem è facilmente stimabile utilizzando due immagini da un campione di calibrazione, dove Dem è l'emissione del donatore sotto eccitazione del donatore con accettore sbiancato. Il FAP in qualsiasi istante può essere calcolato confrontando ESE o EQE con l'Ei della sonda.
In definitiva, la selezione del rapporto FRET (ESE = cSE/Aem vs. EQE = QE/cAem) dovrebbe basarsi sulla considerazione del tipo di sonda e dei canali con il segnale migliore. Entrambi gli approcci includono la correzione del rumore di fondo delle immagini per fotogramma, come descritto sopra, per tenere conto dei cambiamenti nell'autofluorescenza nel tempo. Si presume che non ci sia alcuna sovrapposizione della luce di eccitazione Aem nello spettro di eccitazione Dem, cosa che spesso accade a causa del design della sonda e della configurazione del filtro del microscopio. Le sonde a catena singola possono utilizzare entrambi e la selezione si basa sul miglior segnale della sonda (luminosità) rispetto al rumore della telecamera e al segnale di fondo sui canali SE e QE. Per la sonda ICUE1 e le condizioni sperimentali utilizzate qui (tipi di cellule e idrogel), SE ha un segnale più forte del QE. Le sonde a doppia catena richiedono l'uso di ESE a causa della distribuzione non equimolare dei fluorofori donatori e accettori. Per le sonde che diminuiscono di FRET dopo il legame dell'analita, come ICUE1, l'efficienza FRET può essere "invertita" per presentare una variazione positiva del segnale dopo il legame dell'analita, come facciamo qui, con ESE = 1 - cSE/Aem o EQE = QE/(Aem x QS).
L'analisi del FAP è sensibile alla corretta correzione dei rapporti FRET e alla stima dell'Ei. Può essere stimato con lo stesso campione di calibrazione utilizzato per il QS e un saggio di efficienza FRET con endpoint convenzionale come Ei = 1-(QE/Dem) (immagine QE seguita da fotobleaching accettore e un'immagine Dem)28, ma è necessario prestare attenzione per ridurre al minimo lo sbiancamento accidentale del donatore. Descriviamo una versione modificata in cui viene sostituita la stima di Dem basata su Aem rettificato per QS, ovvero Ei = 1 - (QE/(Aem x QS)). In alternativa, è possibile utilizzare Ei = cSE/Aem. La stima dell'Ei nelle cellule viventi richiede che tutte le sonde siano guidate al FRET completo. Questo è difficile da ottenere nella pratica per le sonde, come ICUE1, che diminuiscono di FRET dopo aver legato l'analita. Un calcolo in vitro dell'Ei utilizzando lisati cellulari e analita purificato è il migliore, ma al di fuori dell'ambito di questo lavoro. Qui si consiglia di utilizzare la 2',5'-dideossiadenosina per ridurre il cAMP nelle cellule. Tuttavia, un FAP relativo può essere calcolato utilizzando una stima dell'Ei derivata dal livello di riferimento della segnalazione. Per questi motivi, gli studi riportano più spesso il rapporto FRET (come fatto qui) o un FAP relativo basato sulla calibrazione dell'endpoint, dove la linea di base di segnalazione prima dell'aggiunta dell'agonista è il limite inferiore e il segnale dopo l'aggiunta di un secondo agonista che satura la segnalazione è il limite superiore. La forskolina è spesso usata come agonista di controllo per saturare il segnale del cAMP. In alternativa, può essere utilizzato un analogo del cAMP come l'8-bromoadenosina 3',5'-monofosfato ciclico. Si raccomandano controlli positivi utilizzati al completamento degli studi per identificare potenziali cambiamenti nella via di segnalazione tra i trattamenti sperimentali.
Il calcolo della risposta media di segnalazione per cella richiede la considerazione di diversi fattori. Innanzitutto, il rapporto FRET medio deve essere calcolato come la media dei rapporti in ogni pixel all'interno di una cella, ad esempio (∑(QE⁄cAem))/(numero di pixel), anziché il rapporto tra il QE medio e l'Aem in una cella, ad esempio (∑QE)⁄(∑cAem). Sebbene quest'ultimo non richieda un'attenta mascheratura poiché il rumore di fondo è basso, sottostima gravemente il vero rapporto FRET medio. Tuttavia, i rapporti dei pixel richiedono un calcolo in virgola mobile e un attento mascheramento binario dell'area della cella per definire le ROI ed evitare l'inclusione di rapporti spuri generati dal rumore di fondo all'esterno della cella. L'intera area cellulare deve essere quantificata per evitare di distorcere i risultati sulla forma della cellula. Potrebbe essere necessario ridefinire il mascheramento nel tempo a seconda dei cambiamenti nella forma e nella migrazione delle cellule. In alternativa, è possibile utilizzare ROI superiori alla cella se vengono definiti criteri di esclusione per rimuovere i rapporti di pixel dai segnali QE e Aem che scendono ben al di sotto dei livelli cellulari e sono vicini ai livelli di fondo. I metodi di analisi descritti descrivono in dettaglio i passaggi di base utilizzati in questo lavoro per l'analisi FRET senza software/plug-in specializzati. I produttori di microscopi e altri fornitori vendono moduli aggiuntivi per il loro software per microscopi, che supportano l'analisi raziometrica e FRET automatizzata. Allo stesso modo, il software ImageJ di pubblico dominio ha diversi plug-in disponibili per l'analisi di particelle e FRET, come RiFRET. In secondo luogo, il rapporto FRET medio basato sui pixel sottostima il vero rapporto medio della struttura cellulare 3D perché viene utilizzata un'immagine 2D. I segnali 2D rappresentano e fanno la media lungo l'asse z. Il calcolo della distribuzione spaziale 3D dei rapporti FRET nelle cellule vive non è possibile senza l'imaging 3D ad alta velocità (ad esempio, utilizzando la microscopia confocale a disco rotante). Questo è un problema sia per le colture 2D che per quelle 3D, ma ha un effetto maggiore nelle 3D poiché la maggior parte della struttura cellulare esiste fuori dal piano. Questo è di grande preoccupazione per le sonde che si localizzano nelle strutture cellulari, come la sonda EPAC1 della membrana plasmatica PM-ICUE. Vedi Spiering et al. 2013 per suggerimenti per correggere gli effetti dello spessore delle celle sui calcoli del rapporto24. L'analisi della distribuzione di Aem può essere utilizzata per rilevare se la sonda si accumula nelle regioni della cella e se il piano di imaging è regolato. Ciò aiuterà anche a interpretare la distribuzione spaziale dei rapporti FRET e ad eliminare i risultati spuri, ad esempio l'identificazione della saturazione della sonda (ad esempio, una regione Aem bassa avrà una bassa concentrazione della sonda e potrebbe mostrare una saturazione della sonda e un rapporto FRET elevato). In terzo luogo, diversi livelli basali di FRET possono indicare una differenza nell'efficienza di trasfezione, nell'espressione della sonda o nella segnalazione basale tra i gruppi sperimentali. L'"Analisi relativa" (Passaggio 10.1.1) aiuta a rimuovere la deriva nel rapporto FRET nel tempo, se presente. Facilita il confronto dell'entità relativa delle risposte tra i campioni, ma impedisce il confronto con l'andamento temporale della risposta per il campione di riferimento (il grafico di controllo è una linea piatta). L'"analisi assoluta" (passaggio 10.1.2) facilita il confronto del tasso di risposta tra i campioni, ma ostacola il confronto dell'entità della risposta perché ogni riga è scalata da una costante dissimile. Gli studi utilizzano spesso una regressione lineare sulla linea di base per correggere la deriva del rapporto FRET nel tempo.
Il metodo FRET 3D descritto è un modo utile e pratico per fabbricare ed eseguire l'imaging time-lapse di idrogel 3D carichi di cellule, che può essere applicato ad altre sonde e modalità di imaging. Altri sistemi FRET oltre alle sonde binarie a catena singola richiederanno una correzione più complessa dei segnali basati sull'intensità, come discusso sopra. In alternativa, l'imaging a fluorescenza del tempo di vita di FRET (FLIM-FRET) può essere utilizzato per calcolare l'efficienza FRET tramite una variazione della durata di emissione del donatore della sonda. A differenza del FRET basato sull'intensità, FLIM-FRET è insensibile al rumore di fondo, al bleed-through spettrale, all'efficienza quantistica e alla sensibilità spettrale del rivelatore2. Tuttavia, i sistemi FLIM sono costosi, complessi e rari e funzionano meglio con fluorofori con decadimento a singolo espone e nessun deflusso FLIM 49. Il metodo descritto può essere utilizzato anche con piattaforme di microscopio più avanzate (ad esempio, FRET-TIRF, anisotropia a fluorescenza e FRET a correlazione spettrale). L'applicazione di questo metodo all'imaging 3D con microscopia confocale e multifotone ad alta velocità faciliterà l'analisi della distribuzione subcellulare della risposta di segnalazione e aumenterà l'accuratezza dell'analisi di segnalazione. Questo metodo FRET 3D consentirà studi avanzati di biologia cellulare in microambienti cellulari 3D simulati. In quanto tale, può essere facilmente applicato alle esigenze di farmacologia e medicina rigenerativa, compreso lo studio della segnalazione intercellulare e lo screening della risposta ai farmaci in microtessuti ingegnerizzati a base di idrogel.

segnalazione cellulare è al tempo stesso complessa e consequenziale per numerosi campi, tra cui la farmacologia, l&#39;ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. strumenti di sperimentazione utili sono necessari per migliorare la nostra comprensione della biologia cellulare e di sviluppare materiali ottimali per la rigenerazione dei tessuti. Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) di imaging è uno strumento essenziale che consente l&#39;analisi di attivazione del recettore, la conformazione molecolare, e le interazioni supramolecolari (ad es., Proteine ​​/ DNA complessazione) in cellule vive. FRET è un tipo di trasferimento di energia non radiativa tra fluorofori 1. Ha una efficienza che è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra un fluoroforo donatore e accettore fluoroforo. Quindi, può fornire informazioni sulla distanza spaziale tra due molecole differenti o tra le regioni di una molecola alla scala nanometrica (tipicamente 1 - 10 nm) 2. I fluorofori donatore e accettore possono essere diversi mtipi olecule (etero-FRET), in cui il donatore ha la emissione di energia più elevata (più corta lunghezza d&#39;onda), o dello stesso tipo (omo-FRET). FRET di immagini può essere eseguita su cellule fissate o vivi, ma in generale cellule fissate sono utilizzati per l&#39;imaging di interazioni molecolari ad alta risoluzione spaziale quando i sistemi confocale ad alta velocità sono disponibili. Cellule vive sono utilizzati per studiare le interazioni ei processi che sono inibiti o alterato da fissaggio, come ad esempio il tempo reale di segnalazione intracellulare di risposta 3. studi cellule vive che impiegano FRET uso di immagini bidimensionali (2D) colture cellulari in parte a causa della semplicità e minore sfondo (nessuna emissione di fuori delle cellule piane). Tuttavia, culture 2D alterano anche numerosi processi cellulari rispetto al microambiente fisiologica e tridimensionali (3D) coltura 4,5. Ad esempio, la cella originaria cellula e cellula di interazioni della matrice extracellulare sono drasticamente alterato nella cultura 2D che porta alle easglia cambiamenti nella morfologia cellulare e la polarità 6 osservato. Microdomini di membrana (ad es., Caveolae e lipidi zattere) e segnalazione dei recettori sono fortemente regolati dalla cultura ambiente, in parte perché si legano i componenti del citoscheletro 7,8 e la struttura delle cellule e la forma del citoscheletro sono fortemente regolati dalla cultura ambiente spaziale 9. Meccanotrasduzione non solo è influenzata dalla matrice 3D, ma più complesse condizioni di carico secondarie generato in ambienti 3D rispetto alle colture 2D 10. Infine, la permeabilità delle matrici 3D è inferiore al mezzo di coltura, in generale, con diminuzione diffusione e aumentato legame della cellula molecole di segnalazione rispetto alle colture 2D. Con culture 3D si è in grado di creare e osservare un microambiente più simile alla fisiologica rispetto al collante, chimica, e segnali meccanici. Cella per le interazioni delle cellule può essere promosso e le proprietà adesive possono essere controllati with la struttura, composizione e architettura (patterning) del materiale 3D 11-13. Le proprietà meccaniche del materiale possono altresì essere adattati dalla composizione e struttura 14,15. Coltura di cellule in idrogel pertanto permessi Fret studi su cellule primarie che sarebbero altrimenti de-differenziare o variazione fenotipo utilizzando tecniche convenzionali, ad es., Le cellule dalla cartilagine articolare. Pertanto, è necessario un metodo per consentire test FRET in colture 3D vivi. ponteggi idrogel sono ideali per studi basati 3D FRET perché possono essere resi otticamente trasparente e adattati per controllare il microambiente e per fornire segnali cellulari. Gli idrogel a base di polimeri naturali sono stati utilizzati in coltura cellulare per decenni, tra gelatina e fibrina 16. Maggiore controllo microambiente cellulare può essere raggiunto con la modificazione chimica di questi polimeri e con l&#39;uso di polimeri sintetici 17,18. hydrogel rigidità meccanica e permeabilità può essere controllata cambiando la composizione polimerica e dimensione (polimero e densità di reticolazione) 19,20 maglia. Inoltre, gli idrogel possono essere fatte bioattivo attraverso l&#39;incorporazione di fattori di crescita e ligandi cellulari. A causa di queste possibilità, lo sviluppo di idrogel per biosensing, somministrazione di farmaci, e applicazioni di ingegneria tissutale è un&#39;area di ricerca molto attiva 21. Stampa 3D di idrogel è inoltre in fase di sviluppo per la realizzazione di micro-tessuti e -organs 15. Così, FRET imaging cellule in idrogel non è solo utile come mezzo per approssimare comportamento cellulare fisiologica, ma anche come strumento per studiare e ottimizzare la crescita tessutale. Binary sonde FRET raziometriche sono molto utili nello studio segnalazione cellulare e possono essere utilizzati in idrogel culture. Per un elenco parziale di fluorescenza pubblicato e ti agiti sonde, consultare il sito web del Consorzio cellulare migrazione <sup&gt; 22. Il tipo di sonda più comune contiene due fluorofori diversi che sono associati o collegati da un elemento di riconoscimento (s) (regione sensibile analita). Queste regioni subiscono un cambiamento conformazionale, associazione o dissociazione al rilevamento dell&#39;analita (ad es., Legame di uno ione o molecola, taglio enzimatico della regione) che altera la distanza tra fluorofori e quindi la grandezza FRET (superiori o inferiori) 23. Un tipo di sonda meno comune ma utile si basa su un cambiamento sensibile analita nella sovrapposizione spettrale dei due fluorofori, che altera FRET grandezza. &quot;Single-chain&quot; sonde raziometriche utilizzano una coppia fluoroforo legato su una singola molecola. &quot;Dual-catena&quot; sonde utilizzano coppie fluorofori su molecole separate, ma la loro espressione possono essere accoppiati con lo stesso cassetta di espressione 24. A differenza di studi con l&#39;espressione unico fluoroforo (ad es., Proteine ​​di fusione fluorescenti), studi con raziometricosonde FRET non richiedono doppio trasfezione per il controllo di efficienza di trasfezione o vitalità cellulare. Sonde raziometriche FRET sono relativamente insensibili a efficienza di trasfezione quando espresso di sopra di una soglia minima (concentrazione insensitive) 23,25. Essi sono insensibili alle fluttuazioni sorgente di eccitazione e di altri fattori ambientali intracellulare (ad es., PH, ioni) così a lungo in quanto entrambi i fluorofori sono altrettanto reattivo. Inoltre, la risposta non è soggetta a ritardi trascrizionale, a differenza fluorescenti e bioluminescenti promotore-reporter di costrutti 26,27. sonde raziometriche FRET sono facilmente e frequentemente utilizzati nei sistemi microscopio widefield epifluorescenza convenzionali. microscopi grandangolari sono preferiti rispetto ai sistemi confocale a scansione linea per l&#39;imaging cellulare dal vivo a causa di preoccupazioni per i costi di sistema, fluoroforo candeggio, e la cattura di cambiamenti di segnale con risoluzione temporale sufficiente. Inoltre, singola cella analeYsis su una vasta popolazione di cellule è possibile con uno stadio e l&#39;immagine di acquisizione motorizzato su più campi di vista. Widefield microscopia richiede un&#39;analisi basata intensità dei segnali delle sonde etero-tasto. Anche se l&#39;analisi intensità non richiede hardware complesse come altri metodi tasto, è necessario un maggiore lavoro di post-acquisizione per correggere gli effetti di comportamenti fluoroforo e configurazioni di sistema microscopio / di imaging 28. L&#39;intensità di emissione catturato di un fluoroforo è una funzione dell&#39;energia di eccitazione, fluoroforo resa quantica, e il filtro combinato e fotocamera / rivelatore di sensibilità spettrale e linearità 2. Questi possono essere dissimile per il donatore e accettore e richiederanno di calibrazione per l&#39;analisi quantitativa. Inoltre, l&#39;imaging dell&#39;emissione accettore è influenzata dalla sovrapposizione spettrale dei fluorofori (eccitazione di accettore da donatore luce di eccitazione e sanguinare-through di emissione del donatore in spettri di emissione accettore) 2.4, a catena singola &quot;sonde sono internamente normalizzati perché i loro fluorofori sono equimolare su scala nanometrica, mentre i fluorofori di&quot; &quot;possono esistere sonde in diversi stoichiometries tutta una cella 25,28 Se i fluorofori di.&quot; Dual-catena a catena singola &quot; sonde di luminosità simile (funzione del coefficiente di estinzione e la resa quantica), gli effetti di sensibilità del rivelatore non lineari sono piccole e solo correzione per la fluorescenza di fondo e il quantum sensibilità rendimento / rivelatore accoppiato è necessario 23. Così &quot;single-chain&quot; sonde raziometriche FRET sono più facilmente implementati in widefield microscopia a 24. Questo articolo descrive una tecnica semplice per eseguire FRET immagini di cellule vive in culture idrogel 3D utilizzando un microscopio convenzionale widefield epifluorescente. Può essere facilmente adottata dai laboratori già conducendo esperimenti FRET in 2D, ma anche laboratori interessati in Intersegnalazione cellulare in microtissues. Qui mostriamo il metodo con misurazione a base di imaging tasto della monofosfato ciclico adenosina (cAMP) livelli in condrociti vivi all&#39;interno photocrosslinking (PC-gel, polietilene glicole dimetacrilato) e thermoresponsive (TR-gel, Matrigel) idrogel. Una sonda FRET raziometrica è utilizzato sulla base di EPAC1 (ICUE1) per rilevare i livelli di cAMP in risposta a forskolin, un agonista chimico per ciclasi che catalizza la conversione di ATP al campo. Camp è uno dei principali secondi messaggeri che mediano G protein-coupled segnalazione dei recettori e attiva vari fattori, tra cui le proteine ​​di scambio a valle direttamente attivati ​​da cAMP (EPACs). I fluorofori allontanano upon cAMP legame al dominio EPAC conseguente diminuzione FRET. Qui descritto è la preparazione dei materiali idrogel, trasfezione delle cellule con la sonda ICUE1, e l&#39;inclusione delle cellule in idrogel 3D. La procedura esperimento 3D tasto e l&#39;analisi delle immagini necessarieper valutare l&#39;attività della sonda per cella sono spiegati. Discutiamo anche i limiti intrinseci di analisi FRET in 2D e 3D utilizzando la microscopia widefield. La tecnica qui presentata è un miglioramento rispetto ai metodi 2D esistenti in quanto consente l&#39;analisi in un contesto più fisiologico e richiede meno correzione dell&#39;immagine e la calibrazione. Grande utilità consiste nel fatto che molti materiali trasparenti possono essere utilizzati durante preferenze cellulari e trasfezione possono essere mantenute.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS) [Kit elastomero Sylgard 184]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Polietilenglicole dimetacrilato (PEGDM)</td><td>Preparato secondo Lin-Gibson con PEG di Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>3- Glicidossipropiltrimetossisilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Dimetilfenilfosfonito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>2,4,6-trimetilbenzoilcloruro</td> Fisher <td>Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Bromuro di litio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Sigmacote (reagente siliconizzante)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Toluene&nbsp;</td>Fisher <td>Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Reagenti Hyclone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero ridotto Medium, senza rosso fenolo (terreno privo di fenolo e siero)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti FuGENE HD Transfection Reagent (reagente di trasfezione)</td><td>Reagenti Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper (cellulare Corning</td><td></td> <td>25-056-CI</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Fattore di crescita Matrigel ridotto, senza fenolo</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (10.200,1.000 &; l)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Guanti da esplorazione senza polvere</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto prerivestiti (epossisilano)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Fiale sterili (15 ml, 50 ml conico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari (6- </td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza con tavolino motorizzato</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE invertito)</td><td>Attrezzatura da laboratorio grande/non monouso</td></tr><tr><td>Supporto per campioni regolabile per tavolino XY</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Obiettivo 60X (1,3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Sorgente</td></tr><tr><td>luminosa CFP/YFP e portafiltri di eccitazione/emissione (sorgente luminosa e ruota Lambda, sistema di filtro emissione Lambda)</td><td>Nikon (rivenditore Sutter Instrument)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Set di filtri CYF/YFP</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Fotocamera (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu rivenditore)</td><td>77054076</td><td>Attrezzature da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 software per microscopi</td>)<td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Prism (foglio di calcolo e software grafico)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Versione 6</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Sistema di lampade per polimerizzazione a punti UV OmniCure S1000 con filtro da 365 nm o altra sorgente luminosa (&lambda; = 365 o 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Attrezzatura da laboratorio grande/non monouso</td></tr><tr><td>Pipette Aid&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>DP-100</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Camera essiccante/degasatore sottovuoto</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>attrezzatura da laboratorio di grandi dimensioni/non monouso</td></tr><tr><td>Cappuccio per coltura tissutale&nbsp;</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>attrezzatura da laboratorio di grandi dimensioni/non monouso</td></tr><tr><td>Cappa</td> chimica<td>Qualsiasi</td><td></td><td>attrezzatura da laboratorio grande/non usa e getta</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Attrezzatura da laboratorio grande/non usa e getta</td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Attrezzatura da laboratorio non monouso</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Attrezzatura da laboratorio non usa e getta</td></tr><tr><td>Incubatrice&nbsp;</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>attrezzatura da laboratorio di grandi dimensioni/non monouso</td></tr></tbody></table>

fret imaging in idrogel tridimensionali

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è un potente strumento per l&#39;esame biologia cellulare in tempo reale. Studi utilizzando FRET comunemente impiegano cultura bidimensionale (2D), che non imitano tridimensionale (3D) microambiente cellulare. Un metodo per eseguire le emissioni spento l&#39;imaging FRET usando la microscopia convenzionale widefield epifluorescenza delle cellule all&#39;interno di un ambiente idrogel 3D è presentato. Ecco un metodo di analisi per sonde FRET raziometriche che produce rapporti lineare nell&#39;ambito delle di attivazione della sonda è descritta. La misurazione dei livelli intracellulari adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è dimostrato in condrociti sotto stimolazione forskolina utilizzando una sonda per EPAC1 attivazione (ICUE1) e la capacità di rilevare le differenze di cAMP segnalazione dipende dal tipo di materiale idrogel, qui un idrogel photocrosslinking (PC-gel, polietilene glicole dimetacrilato) e un idrogel thermoresponsive (TR-gel). Rispetto ai metodi 2D FRET,questo metodo richiede poco lavoro supplementare. Laboratori già utilizzano immagini FRET in 2D possono facilmente adottare questo metodo per eseguire studi cellulari in un microambiente 3D. Può inoltre essere applicato a vaglio di farmaci ad alto rendimento in microtissues 3D ingegnerizzati. Inoltre, è compatibile con le altre forme di immagini FRET, come la misurazione anisotropia e di imaging di fluorescenza vita (FLIM), e con le piattaforme avanzate di microscopia confocale utilizzando, ad impulsi, o l&#39;illuminazione modulata.

Tutti i precursori dell'idrogel, le cellule e gli stampi per la colatura sono stati preparati come descritto in precedenza. Le soluzioni precursori cariche di cellule sono state versate negli stampi in PDMS e successivamente centrifugate prima della gelificazione/fotocrosslinking per immobilizzare le cellule vicino al coprioggetto e facilitare l'analisi mediante imaging FRET (Figura 1). Gli idrogel con i coprioggetti attaccati sono stati posizionati all'interno di pozzetti di imaging in PDMS preparati per l'acquisizione microscopica (Figura 2). Le configurazioni ottiche e i parametri di acquisizione delle immagini sono stati quindi impostati come mostrato in Figura 3A. È illustrata l'acquisizione di tutti e quattro i canali di immagine relativi al FRET per coppie di fluorofori CFP-YFP (vedi sotto «Config. Ott.» in Figura 3), necessaria per sonde non binarie. Tuttavia, in questo studio sono richieste solo due immagini per la sonda binaria monocatenaria ICUE1, QE = «CFP CFP» e Aem = «YFP YFP» (eccitazione emissione). Sono stati selezionati diversi campi visivi (posizioni xy) in cui erano presenti più cellule all'interno di un'area di illuminazione omogenea (Figura 3B). Dopo l'acquisizione in time-lapse, i dati del segnale della sonda sono stati esportati. Le ROI per la correzione del fondo dei segnali dei canali e per l'analisi cellulare sono state definite utilizzando le immagini Aem sogliate all'inizio degli esperimenti (Figura 4). Le cellule sono state selezionate dal pool cellulare in base all'espressione sufficiente (non troppo debole), ma non eccessivamente elevata (troppo intensa) della sonda (Figura 4B). I rapporti FRET QE e SE per ogni pixel ad ogni acquisizione sono stati calcolati mediante divisione in virgola mobile dei canali di immagine corretti per il fondo. Il rapporto FRET medio per cellula (ossia, per ROI) è stato calcolato, normalizzato rispetto al segnale di base prima della stimolazione (ossia, una regressione sulla baseline sottratta da tutti i punti temporali) e rappresentato graficamente con barre di errore pari all'errore standard della media (SEM). Sia i rapporti FRET basati su QE che su cSE rilevano l'aumento dell'attività di cAMP nei condrociti sotto stimolazione con forskolina (100 nM, Figura 5). Il rapporto FRET QE è risultato più sensibile alla correzione del fondo rispetto al rapporto FRET cSE poiché il segnale QE era più basso a causa del livello basale ridotto di attività di cAMP nei condrociti inclusi negli idrogel. Entrambi i tipi di idrogel (TR-gel e PC-gel) hanno mostrato un aumento del rapporto FRET nel tempo (Figura 6), indicando una maggiore risposta del segnale di cAMP all'aggiunta di forskolina. Come indicato dal rapporto FRET QE, i condrociti negli idrogel PC-gel mostrano un cambiamento maggiore nel cAMP (mostrato) e un livello basale più elevato di cAMP (EQE = 0,19 nel PC-gel vs. EQE = 0,09 nel TR-gel, non mostrato nella figura con baseline sottratta).
<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 
Figura 1: Distribuzione delle cellule nel gel idrofilo fotopolimerizzato (PC-gel) 
A: Il precursore del gel idrofilo caricato con cellule è stato centrifugato per massimizzare il numero di cellule in un piano focale vicino al coprioggetto. B: Questo aumenta il numero di cellule nel campo visivo (FOV) e minimizza il segnale di fondo derivante da cellule fuori piano. (Barra della scala = 200 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 
Figura 2: Idrogel in una piastra in PDMS 
L'idrogel è stato posizionato all'interno di un pozzetto alto in PDMS (volume pari a 10x quello dell'idrogel) con base in coprivetrino per l'analisi microscopica e la stimolazione dell'analita. Gli idrogel in PC-gel sono trasparenti e legati al coprivetrino in modo da rimanere fissi per tutta la durata del saggio. Il pozzetto in PDMS può essere realizzato con dimensioni maggiori, in modo da contenere un volume di mezzo pari a 10x quello dell'idrogel, utilizzando una punta da biopsia più larga e un foglio di PDMS più spesso. (Barra della scala = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 
Figura 3: Configurazione dell'acquisizione per l'immagine FRET 
A: L'acquisizione è stata configurata per la cattura delle immagini ogni 7 sec in più posizioni. Per il calcolo del rapporto FRET QE, sono necessari solo due canali di immagine per la sonda ICUE1 utilizzata in questo caso (sonda monocatenaria binaria), QE = &#34;CFP CFP&#34; e Aem = &#34;YFP YFP&#34; (eccitazione emissione) nella colonna &#34;Config. Ottica&#34; della scheda&#160;λ del software del microscopio. B: Sono stati selezionati campi visivi (&#34;posizioni XY&#34;) in cui diverse cellule si trovavano all'interno dell'area di illuminazione omogenea. Il grafico sotto l'immagine mostra l'intensità di illuminazione lungo la linea indicata dalla freccia blu che attraversa il centro del campo visivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 
Figura 4: Selezione delle aree di interesse (ROI) per l'analisi di imaging FRET 
A: È stata selezionata un'area di interesse (ROI) priva di cellule per correggere il segnale di fondo su ogni canale. Un'immagine di un idrogel senza cellule può essere utilizzata alternativamente per la sottrazione del fondo se la densità cellulare o la migrazione sono elevate, o se una maschera di schiarimento non viene utilizzata quando le cellule non si trovano all'interno di un campo di illuminazione omogeneo. B: Le ROI cellulari sono state selezionate mediante sogliatura dell'immagine e mascheratura binaria del canale Aem. La selezione di una ROI più grande rispetto alle cellule influirà negativamente sul calcolo del rapporto FRET medio per cellula a causa dell'inclusione di rapporti extracellulari generati dal rumore di fondo. Non si raccomanda il calcolo del rapporto FRET cellulare utilizzando la media di ciascun canale per cellula, poiché ciò sottostima il rapporto. (Barra della scala = 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 
Figura 5: Confronto dei rapporti FRET nel gel idrofilo termoresponsivo (TR-gel) 
Sia i rapporti FRET basati su QE che su SE rilevano l'aumento dell'attività di cAMP nei condrociti sotto stimolazione con forskolina. La forskolina è un agonista dell'adenilato ciclasi che induce la produzione di cAMP. Il FRET diminuisce quando la sonda ICUE1 si lega al cAMP, quindi il rapporto FRET QE (EQE&#160;= sQE/(sAem x QS)) aumenta. Al contrario, il rapporto FRET SE diminuisce ed è pertanto rappresentato come ESE&#160;= 1 - cSE/sAem. Nei condrociti inclusi nel gel idrofilo, il rapporto FRET QE è più sensibile alla correzione del fondo che il rapporto FRET SE, poiché il segnale QE è basso a causa della bassa attività basale di cAMP. Barre di errore = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 
Figura 6: Confronto del rapporto FRET in diversi idrogeli 
I condrociti in entrambi i tipi di idrogel hanno risposto alla stimolazione con forskolina con un aumento dell'attività di cAMP, come dimostrato dall'aumento nel tempo del rapporto FRET QE. Il tipo di idrogel influenza la risposta cellulare attraverso diversi effetti, tra cui le differenze di permeabilità alla forskolina e l'attività basale di cAMP cellulare (EQE = 0.19 nel PC-gel vs. EQE = 0.09 nel TR-gel, non mostrato). Le barre di errore corrispondono all'ERL, n per il TR-gel = 25, n per il PC-gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

L'imaging FRET (Förster resonance energy transfer) è un potente strumento per studi di biologia cellulare in tempo reale. Qui viene presentato un metodo per l'imaging di cellule FRET in microambienti fisiologici tridimensionali (3D) di idrogel utilizzando la microscopia a epifluorescenza convenzionale. Viene descritta un'analisi per le sonde FRET raziometriche che produce rapporti lineari nell'intervallo di attivazione.

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è consentire lo studio in tempo reale della segnalazione intracellulare mediante imaging FRET di cellule inglobate in idrogeli tridimensionali che imitano i tessuti naturali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, della farmacologia e della medicina rigenerativa, come ad esempio lo sviluppo di biomateriali ottimali e lo screening ad alto rendimento di farmaci in microtessuti ingegnerizzati tridimensionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la FRET può essere utilizzata su un elevato numero di cellule in numerosi tipi di idrogel impiegando sistemi microscopici convenzionali a campo largo.Dopo aver realizzato gli stampi per la colatura dell'idrogel e sospeso le cellule coltivate nella soluzione di idrogel, secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere in condizioni sterili, all'interno di una cappa a flusso laminare, il precursore contenente le cellule negli stampi di colatura. Prima dell'indurimento, centrifugare le cellule sospese nel precursore dell'idrogel per ottimizzare l'analisi mediante microscopia, confinando le cellule in un singolo piano focale e riducendo al minimo il segnale fuori piano. Successivamente, per indurre l'indurimento degli idrogel in PC, utilizzare una sorgente di luce UVA con un tempo di esposizione pari a 3,2 joule per centimetro quadrato per millimetro di spessore, per irradiare il precursore contenente le cellule.In alternativa, utilizzare una lampada dentale portatile meno costosa. Evitare un'eccessiva esposizione dell'idrogel, poiché ciò ridurrebbe la vitalità cellulare. Gli idrogel a reticolazione fisica vengono invece posti a 37 gradi Celsius.Dopo il crosslinking, rimuovere lo stampo in PDMS utilizzato per la colatura dell'idrogel e sostituirlo con la piastra in PDMS preparata in precedenza. Utilizzare una spatola sterile per premere il PDMS contro il vetro in modo che aderisca. Aggiungere al pozzetto creato nella piastra in PDMS un mezzo senza siero e privo di fenolo o un mezzo chimicamente definito, insieme a un coverslip, per mantenere l'idrogel immerso.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta fissata la piastra in PDMS con l'idrogel sul supporto del microscopio e applicato l'olio sull'obiettivo, utilizzare la luce trasmessa per individuare almeno 15 cellule da acquisire e verificare la trasfezione mediante imaging a fluorescenza. Nel software del microscopio, configurare le impostazioni della fotocamera per i canali di immagine FRET selezionando alcune cellule vicine al centro del campo visivo ed ottimizzare l'esposizione e il guadagno per ogni canale di immagine seguendo il protocollo indicato nel testo.Scegliere cellule posizionate vicino al centro dell'idrogel, all'interno di un campo di illuminazione relativamente uniforme, che non siano né troppo brillanti né troppo deboli, e con un rapporto FRET compreso tra 0,0 e 1,0. Quindi, selezionare più campi di osservazione per acquisire immagini di almeno 15 cellule trasfettate. Spegnere la luce al termine per limitare l'esposizione.Per configurare la frequenza di acquisizione per l'acquisizione di immagini in time lapse, inserire la periodicità delle acquisizioni. Utilizzare una frequenza rapida per l'acquisizione del segnale di base, ad esempio ogni cinque secondi per ogni campo visivo, e una frequenza più lenta per la successiva cinetica del segnale a lungo termine. Selezionare "Esegui ora" per avviare l'acquisizione delle immagini e catturare immagini per cinque minuti al fine di stabilire un valore di base per la risposta della sonda nel campo visivo designato.Dopo cinque minuti di acquisizione delle immagini, aggiungere con la pipetta l'agonista o l'antagonista desiderato, mescolare pipettando ed eseguire ulteriori acquisizioni. Dopo aver eseguito la calibrazione FRET seguendo il protocollo descritto nel testo, nel software del microscopio selezionare la freccia sull'icona della regione di interesse di sfondo e scegliere Disegna regione di interesse ellittica di sfondo. Disegnare e definire una regione di interesse, o ROI, per ogni campo visivo vicino alle cellule per stabilire il livello di sfondo.Assicurarsi che sia selezionata l'opzione Mantieni aggiornamento offset di fondo, quindi attivare la visualizzazione della regione di interesse per lo sfondo facendo clic sull'icona Regione di interesse per lo sfondo. In alternativa, selezionare l'icona della regione di interesse e impostare le proprietà della regione di interesse su Utilizza come regione di interesse per lo sfondo e Le regioni di interesse sono diverse in ogni punto multiplo. Utilizzando l'icona della regione di interesse per lo sfondo, selezionare Sottrai sfondo utilizzando la regione di interesse.Nella finestra a comparsa, sotto Sottrai Regione di Interesse di Sfondo, selezionare Ogni Immagine e sotto Applica A, selezionare Tutti i Fotogrammi. Per ogni campo visivo, per definire una regione di interesse attorno alla cellula utilizzando il canale di emissione dell'accettore e una maschera binaria, utilizzare il menu Binario, Definisci Soglia e selezionare Applica Al Fotogramma Corrente. Successivamente, regolare la soglia inferiore per selezionare le cellule.Successivamente, utilizzare la funzione Binary Close per riempire eventuali fori nella maschera binaria. Quindi, utilizzare l'icona Area di Interesse per selezionare Copia Binario in Area di Interesse al fine di salvare la maschera binaria come aree di interesse. Aggiungere le aree di interesse per i successivi campi di osservazione al pool esistente di aree di interesse.Eliminare eventuali regioni di interesse spurie. Quindi, fare clic con il tasto destro sulle Regioni di interesse e verificare che le loro proprietà siano "Utilizza come regione di interesse standard" e che le Regioni di interesse siano diverse in ciascun punto multiplo. Le regioni di interesse cellulari possono essere disegnate manualmente, ma è necessario prestare attenzione a rimuovere i valori spurii.Il protocollo contiene procedure per cellule situate al di fuori del campo di illuminazione uniforme e per microscopi che non dispongono di un campo piatto. La centrifugazione dei precursori dell'idrogel prima della gelificazione ha massimizzato il numero di cellule in un singolo piano focale vicino al coprioggetto. Ciò ha minimizzato il rumore di fondo e aumentato la produttività dell'acquisizione delle immagini.In questo esperimento FRET, per il calcolo del rapporto FRET relativo all'emissione quenched, o QE, erano necessarie soltanto due immagini per la sonda binaria monocatenaria ICUE1, comprendenti QE uguale a CFP eccitazione e CFP emissione, e emissione dell'accettore uguale a YFP eccitazione e YFP emissione. Sono stati selezionati diversi campi visivi in cui diverse cellule si trovavano all'interno dell'area di illuminazione omogenea, come mostrato qui. Le ROI per la correzione del fondo dei segnali dei canali e per l'analisi cellulare sono state definite utilizzando le immagini di emissione dell'accettore sogliate registrate all'inizio degli esperimenti.Inoltre, come mostrato qui, sono state selezionate le cellule che esprimevano una quantità sufficiente della sonda. Sono stati calcolati i rapporti FRET di QE e di emissione sensibilizzata per pixel e il rapporto FRET medio per cellula. &Egrave; stato calcolato l'inverso del rapporto di emissione sensibilizzata e entrambi i rapporti sono stati normalizzati.Sotto stimolazione con forskolina, entrambi i rapporti FRET basati su QE e SE rilevano un aumento dell'attività di AMP ciclico nei condrociti. Sia i gel fisicamente che chimicamente reticolati hanno mostrato un incremento del rapporto FRET QE nel tempo, indicando una risposta di segnalazione aumentata di AMP ciclico all'aggiunta di forskolina. Questa procedura può essere utilizzata insieme ad altre tecniche di microscopia, come FRAP, FLIM-FRET e misurazioni di anisotropia, per rispondere a domande quali: quali sono le differenze di permeabilità e di segnalazione cellulare tra diversi tipi di microtessuti?Poiché il reticolaggio viene inibito vicino al PDMS, è importante ricordare di progettare gli stampi per gli idrogeli reticolati fotochimicamente leggermente più grandi in diametro rispetto agli idrogeli stessi.

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Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

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