Un regime Fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati per studiare geni implicati in malattie umane di invecchiamento
14 luglio 2016
Viene presentato un approccio di genetica inversa per comprendere le famiglie di geni associate alle malattie umane, utilizzando il topo come sistema modello, e viene descritto il successivo programma di fenotipizzazione del topo. Poiché i topi difettosi in un gene di interesse, HtrA2, manifestavano sintomi parkinsoniani , il regime di fenotipizzazione si concentra sull'identificazione dei difetti neurologici.
L'obiettivo generale di questo regime di test è quello di stabilire una serie di semplici test che possono essere utilizzati come pipeline di fenotipizzazione iniziale per indirizzare successive indagini dettagliate sui fenotipi comportamentali e sulla struttura e la funzione dei tessuti. Se i fenotipi comportamentali e cellulari delle malattie umane sono ricapitolati nel modello murino. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i test possono essere eseguiti in laboratori senza alcuna esperienza precedente in tali esperimenti, senza investimenti significativi, ma comunque informati su ulteriori studi dettagliati.
Condurre il test degli arti posteriori ogni giorno dal quarto al decimo giorno postnatale per valutare la forza, la debolezza e l'affaticamento dei muscoli prossimali degli arti posteriori. Per iniziare, lascia che i topi si acclimatino all'area di prova per 30 minuti. Nel frattempo preparate un nuovo tubo conico da 500 millilitri lavandolo con etanolo al 70% e poi spingendo uno o due batuffoli di cotone sul fondo del tubo.
Fissare questo tubo in posizione verticale per il test. Quando non vengono testati, tieni i cuccioli con la madre per mantenere la loro temperatura. Dopo l'acclimatazione di mezz'ora, rimuovi un cucciolo dalla gabbia e registra il suo peso.
Quindi sospendi delicatamente il neonato per gli arti posteriori sopra il bordo del tubo, in modo che il cucciolo sia rivolto verso il cotone. Quindi conta il numero di tentativi di pull effettuati dal cucciolo e misura la sua latenza per diminuire. Dopo aver atteso 30 secondi, ripetere il test.
Dopo il secondo test, etichettare il cucciolo con un pennarello. Quindi strofina delicatamente il cucciolo con la lettiera della gabbia di casa e rimettilo alla diga. Poiché i cuccioli P8 più anziani non possono essere contrassegnati, identificarli con un tosatura del piede.
Prima di procedere con il cucciolo successivo, pulisci la provetta con etanolo al 70%. Somministrare il test di osservazione dello svezzamento ogni giorno da P19 a P21 per valutare i livelli di movimento e di attività generale. Inizia lasciando che i topi si acclimatino all'area di prova per 30 minuti.
Mentre i cuccioli si acclimatano, prepara l'arena. Segna una scatola di prova in plexiglass con una griglia di sei per sei quadrati da due pollici. Prima di utilizzare la scatola, pulirla con etanolo al 70%.
Quindi posiziona una videocamera in modo che una vista laterale dell'intera scatola riempia il campo visivo. Standardizzare l'aspetto dell'ambiente circostante per evitare di introdurre novità. Prima del test, trasferire lo svezzamento in una tazza di tenuta pulita e registrarne il peso.
Poi è iniziata la registrazione video. Per prima cosa, filma una carta d'identità del test con il numero di identificazione del topo, la sua età e la data corrente. Quindi trasferisci il mouse dalla tazza di supporto al quadrato centrale.
Per tre minuti, conta il numero di linee attraversate da entrambe le zampe anteriori. Dopo tre minuti, rimetti il mouse in una gabbia pulita e termina la registrazione video. Tra un test e l'altro, pulire la scatola con etanolo al 70%.
Dai video, conta gli eventi di allevamento, ovvero quando un topo si trova con entrambe le zampe anteriori libere dal supporto. Conta anche gli eventi di toelettatura, che si verificano quando entrambe le zampe anteriori sono impegnate nella pulizia. Condurre il test della forza di presa a giorni alterni tra P22 e P26 per valutare la forza neuromuscolare.
Come al solito, dai ai topi 30 minuti per adattarsi all'area del test. L'apparato di prova è una scatola di plexiglass con una griglia a maglie. Pulisci entrambi con etanolo al 70%.
Quindi foderare il fondo della scatola con uno strato di pluriball per l'imbottitura e coprire il pluriball con carta per assorbire le escrezioni. Procedi a separare i topi di prova e caricali in tazze individuali. Ora, posiziona il primo mouse al centro della rete metallica e capovolgi lentamente la rete a 10-20 centimetri sopra la superficie morbida della scatola.
Misura la latenza per cadere o terminare il test dopo 60 secondi, se il mouse non cade. Quindi rimetti il primo mouse nella tazza di contenimento. Tra un test e l'altro, pulire la rete con etanolo al 70% e sostituire la carta sopra il pluriball.
Quindi condurre il test sugli altri due topi del gruppo. Dopo che ogni mouse è stato testato una volta, ripetere il processo altre due volte per tre prove per topo. Se ci sono meno di tre topi in un gruppo, assicurarsi che ci sia un tempo di recupero tra le prove di almeno cinque minuti.
Per un colorante per diaforasi NADH, combinare volumi uguali di soluzione NADH appena prodotta e di soluzione NBT appena fatta. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione colorante a ciascun vetrino e incubare i vetrini in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per una colorazione con succinato idrogenasi, preparare una soluzione di succinato di sodio 0,1 molare, NBT 1,25 molare e tampone fosfato 0,2 molare.
Quindi aggiungere un millilitro a ciascun vetrino. Imballare i vetrini in una camera umidificata e incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione con uno dei due coloranti, aspirare la soluzione colorante e lavare i vetrini tre volte con acqua distillata.
Quindi lavare i vetrini attraverso una serie di bagni di acetone che aumentano e diminuiscono la concentrazione. Ad ogni concentrazione di acetone, eseguire tre lavaggi per due minuti per lavaggio. Infine, sciacquare tre volte i vetrini in acqua distillata.
Quindi montare i vetrini con un mezzo acquoso. I topi senza espressione di HTRA2 sono stati esaminati utilizzando la batteria di test descritta e confrontati con i controlli del compagno di cucciolata. Non è stato osservato alcun cambiamento nel numero di pull o nella latenza di caduta tra P4 e P6. Tra P7 e P10 è stata osservata una riduzione della forza neuromuscolare.
Nel test di attività, c'era una ridotta attività dei topi knockout per HTRA2. I topi knockout HTRA2 hanno anche mostrato una riduzione della forza nel test di presa della rete metallica. La colorazione H ed E mostra che i topi knockout per HTRA2 non avevano cambiamenti apparenti nella struttura retinica rispetto ai controlli a P35.
Infine, la colorazione istochimica per l'attività del complesso della catena di trasporto degli elettroni è stata utilizzata per identificare i cambiamenti nelle funzioni degli enzimi respiratori. C'è stata una diminuzione della colorazione nei topi knockout HTRA2 rispetto ai controlli. Questo è stato notato nel cervelletto e nello striato, ma non nella corteccia.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'attività e la forza neuromuscolare dei topi geneticamente modificati, nonché di come combinare questi studi con gli assi cellulari. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un approccio di genetica inversa per indagare famiglie geniche associate a malattie umane, utilizzando un modello murino. L'attenzione è rivolta al gene HtrA2, associato a sintomi parkinsoniani, e viene delineato un protocollo di fenotipizzazione per identificare difetti neurologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Modelli murini
Sfondo
- Comprendere le funzioni dei geni è fondamentale per collegarli alle malattie umane.
- I modelli murini sono comunemente utilizzati per studiare i disturbi genetici.
- HtrA2 è stato associato alla malattia di Parkinson.
- Il fenotipaggio aiuta nell'identificare difetti neurologici specifici.
Scopo dello studio
- Stabilire una pipeline di fenotipizzazione per le valutazioni iniziali dei fenotipi comportamentali e cellulari.
- Determinare se i modelli murini riflettono accuratamente i fenotipi della malattia umana.
- Facilitare ulteriori indagini dettagliate sugli effetti delle mutazioni genetiche.
Metodi Utilizzati
- Eseguire il test degli arti posteriori per valutare la forza muscolare e l'affaticamento.
- Test giornalieri dal quarto al decimo giorno post-natale.
- Abituare i topi all'area di prova prima delle valutazioni.
- Preparare l'equipaggiamento per i test in condizioni sterili.
Risultati principali
- Stabilire un regime di test semplice per il fenotipaggio.
- Identificazione di difetti comportamentali e neurologici nei topi privi di HtrA2.
- Dimostrazione della fattibilità dei test in laboratori alle prime armi.
- Approfondimenti sulla relazione tra mutazioni geniche e sintomi della malattia.
Conclusioni
- La pipeline di fenotipizzazione è efficace per le valutazioni iniziali.
- I modelli murini possono riprodurre aspetti delle malattie umane.
- Questo approccio può orientare le future ricerche sui disturbi genetici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La creazione di una pipeline standardizzata per il fenotipaggio consente la rilevazione precoce di fenotipi comportamentali e cellulari nei modelli murini geneticamente modificati, sostenendo la validazione degli obiettivi per malattie legate all'età come la DMLA e il morbo di Parkinson. Questo approccio riduce l'ambiguità meccanicistica collegando le modifiche genetiche a esiti funzionali osservabili, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici. La semplicità del protocollo ne permette un'ampia adozione tra i team di scoperta, migliorando la riproducibilità e l'allineamento tra funzioni diverse negli sforzi di riduzione del rischio degli obiettivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche mediante la valutazione della forza neuromuscolare e dei livelli di attività nei topi privi di HtrA2.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli attraverso un'analisi comportamentale sistematica senza richiedere competenze specialistiche.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando fenotipi che potrebbero riflettere i meccanismi delle malattie umane.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per saggi successivi, stabilendo parametri di base per la funzione comportamentale e tissutale.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso protocolli definiti di ambientazione, test e sanificazione.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma in diversi laboratori grazie ai ridotti requisiti di attrezzature ed a un'esecuzione semplice.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega modifiche genetiche a fenotipi rilevanti per le malattie nei sistemi nervoso e muscolare, supportando l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo letture quantificabili e ripetibili.
- Contenimento del rischio: Informa le decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio evidenziando deficit nella funzione motoria e nell'attività mitocondriale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il regime di fenotipizzazione si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione precoce del bersaglio fino all'identificazione del capostazione, consentendo la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando la forza degli arti posteriori, la latenza alla caduta e i comportamenti di alzata in piedi e toeletta come indicatori della funzione neurologica.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso output standardizzati e quantitativi come il numero di trazioni, le misurazioni di latenza e il punteggio di attività.
- Analisi: Genera set di dati confrontabili tra diversi genotipi e punti temporali, consentendo la valutazione statistica di deficit neuromuscolari e comportamentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica identificando un malfunzionamento mitocondriale in regioni cerebrali rilevanti per la patologia di Parkinson.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per la valutazione di diversi modelli geneticamente modificati in varie aree di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella mappatura da gene a fenotipo.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità tra diversi siti e team.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione, l'efficienza del capitale e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei programmi di target.
- Impatto sul portafoglio: Permette di prendere decisioni di priorità e avanzamento corrette rispetto al rischio, basate su screening fenotipici precoci.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio dei topi, nei test neonatali e nelle tecniche di colorazione istologica di base.
- Si basa su attrezzature di laboratorio standard, tra cui provette coniche, arene in plexiglass, sistemi di registrazione video e incubatrici per la colorazione istochimica.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i periodi di ambientamento, i tempi dei test e le procedure di sanificazione, al fine di garantire la comparabilità dei dati.
- Richiede considerazioni adattative quando si applica il protocollo a diversi sistemi modello, età o background genetici.
- Limitato ai fenotipi comportamentali e cellulari osservabili; potrebbe non rilevare processi cognitivi complessi o degenerativi ad insorgenza tardiva senza l'ausilio di saggi supplementari.
