Name: Un regime Fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati per studiare geni implicati in malattie umane di invecchiamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri un regime di fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati nello studio di geni associati a malattie umane legate all'invecchiamento. Questo metodo valuta la forza muscolare e i difetti neurologici.

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Il finanziamento per questa ricerca è venuto dal Rosebay Medical Foundation e un Fondo di ricerca di Yale Medical School Dean (JH). Ringraziamo il Dott Claire Koenig per un aiuto con esperimenti comportamentali. Geneticamente linee del mouse Engineered sono stati generati in Ozgene (Perth, Australia).

Etica dichiarazione: studi su animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del National Institutes of Salute nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (IACUC) presso la Yale University. 1. comportamentale test di topi geneticamente modificati Nota: Tutti i topi devono essere sottoposti a test lo stesso regime per limitare le differenze di assuefazione alla manipolazione. I test devono essere eseguiti nello stesso momento della giornata ogni volta. <ol><li> Neonatale degli arti posteriori di prova Nota: Il test di arto posteriore è condotto tutti i giorni dalle giorno postnatale (P) da 4 a P10 per valutare prossimale forza muscolare degli arti posteriori, debolezza e affaticamento. <ol><li> topi di trasporto per zona test e permettono di riposare per 30 minuti prima del test. </li><li> Preparare apparecchiatura di prova pulendo un tubo da 50 ml con etanolo al 70%, spingendo due (-P8 P4) o uno (P9-P10) batuffoli di cotone per il fondo del tube e fissaggio in posizione verticale. </li><li> Rimuovere un cucciolo dalla gabbia e registrare il peso. Mantenere cucciolo in azienda vassoio sul rilievo di calore ogni volta che non prova. </li><li> sospendere delicatamente gli arti posteriori del neonato sul bordo del tubo conico, in modo tale che sia rivolta verso i batuffoli di cotone. Contare il numero di tentativi di tiro fatte e la latenza misura rientri utilizzando un cronometro. </li><li> Ripetere ancora una volta quindi etichettare il cucciolo con un pennarello. In seguito, identificare i cuccioli P6 da amputazione delle falangi. Strofinare delicatamente cuccioli con biancheria da gabbia a casa prima della sostituzione. </li><li> Pulire tubo conico con il 70% di etanolo. </li><li> Ripetere il test sul prossimo cucciolo fino a quando l&#39;intera cucciolata è stato testato. </li><li> Smaltire batuffolo di cotone e tubo conico. Pulire gli attrezzi con il 70% di etanolo. </li></ol></li><li> Weanling osservazione di prova Nota: Il test di osservazione weanling viene somministrato quotidianamente da P19 a P21 a segnare i livelli di movimento e l&#39;attività generale. <ol><li> topi di trasporto per zona di collaudo di unnd lascia a riposo per 30 minuti prima del test. </li><li> Preparare scatola test plexiglas segnato con una griglia 6x6 di 2 pollici quadrati sulla base pulendo con il 70% di etanolo. Impostare apparecchiature video al lato in modo tale che l&#39;intera scatola è nel campo di visualizzazione. Tenere il set up e dintorni lo stesso ogni giorno per evitare di introdurre novità. </li><li> Rimuovere una weanling dalla gabbia e posto in una tazza tenuta pulita. peso record. </li><li> Iniziare la registrazione video riprese della carta di identificazione di prova, con il numero di identificazione del mouse, l&#39;età e la data del test. Trasferire mouse dalla holding tazza alla piazza centrale. Tempo per tre minuti, contando il numero di linee percorse da entrambe le zampe anteriori del mouse durante la prova. </li><li> Rientro mouse per una gabbia e fine registrazione video pulito. </li><li> Pulire l&#39;apparecchio di prova con il 70% di etanolo. </li><li> Ripetere fino a quando tutti i rifiuti è testato, per poi tornare tutti i cuccioli alla gabbia casa. </li><li> Pulire tutte le apparecchiature di prova con il 70% di etanolo. </li><li&gt; Utilizzando i video, quantificare il numero di allevamento eventi dal conteggio dopo l&#39;osservazione visiva, in cui un topo sta con entrambe le zampe anteriori chiari di sostegno, e di governare gli eventi, in cui entrambe le zampe anteriori sono impegnati nella pulizia. </li></ol></li><li> Rete metallica presa di forza di prova Nota: La prova di forza di presa è condotta a giorni alterni tra P22 e P26, per valutare la resistenza neuromuscolare. <ol><li> topi di trasporto per zona test e lasciar riposare in gabbia a casa per 30 minuti prima del test. </li><li> Preparare apparecchiatura per la pulizia di una scatola e rete griglia di plexiglas con il 70% di etanolo. Mettere pluriball nella parte inferiore della scatola e coprire con carta. </li><li> topi separati in gruppi di tre, ponendo in coppe individuali Holding. </li><li> Posizionare primo mouse sul centro della rete metallica e invertire lentamente 10-20 cm sopra la superficie morbida nel fondo della scatola plexiglass. Misurare la latenza a cadere con un cronometro. Termina il test dopo 60 secondi sono trascorsi se il mouse non lo faautunno. </li><li> Rientro mouse per tazza tenuta, pulire maglia con il 70% di etanolo e sostituire la carta sopra il pluriball. Eseguire il test sui rimanenti due topi nel gruppo prima di tornare al primo. Ripetere fino ogni topo è stato testato un totale di tre volte. </li><li> Riportare il gruppo ad una gabbia pulita e proseguire con i gruppi rimanenti. Se ci sono meno di tre topi in qualsiasi gruppo, in modo che a 5 min inter-trial intervallo di recupero è permesso. </li><li> Rientro tutti i topi alla gabbia casa, disporre di carta e attrezzature di prova pulita con il 70% di etanolo. </li></ol></li></ol> 2. Esame della struttura della retina <ol><li> Anaesthetize animali a P30-35 mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Valutare profondità dell&#39;anestesia pizzicando la zampa e procedere solo in assenza di una risposta, in linea con le linee guida IACUC. Profumato con il 4% PFA / PBS 48. </li><li> Per rimuovere gli occhi, pulire la pelle al SI dell&#39;incisioneTE con il 70% di etanolo, prima di tagliare attraverso la pelle alla base del cranio. Sbucciare indietro la pelle per esporre il cranio e pulita con il 70% di etanolo. Utilizzando strumenti puliti, con attenzione tagliare attraverso il cranio per raggiungere le orbite ed esporre gli occhi. Recidere il nervo ottico, rimuovere delicatamente l&#39;occhio dalla presa e lavare in PBS. </li><li> Fix occhi in 4% PFA / PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mettere gli occhi in una piccola capsula di Petri contenente PBS. Fai una piccola incisione nel centro della cornea con le forbici di rimozione dei punti. Rimuovere la cornea tagliando il bordo tra la cornea e sclera. Usare pinze per rimuovere l&#39;iride. Infine, staccare gli strati RPE, lasciando intatta la retina e la lente a posto. Nota: il 4% PFA / PBS fissaggio causerà RPE distacco consenta l&#39;RPE di essere facilmente sfogliato dall&#39;esterno della retina. </li><li> Re-fix in 4% PFA / 30% di saccarosio / PBS per 15 minuti a temperatura ambiente prima di tornare l&#39;occhio ad una piastra di Petri contenente PBS. Estrarre il lens usando pinze, portando il corpo vitreo con esso. </li><li> Cryoprotect nel 30% di saccarosio notte a 4 ° C. </li><li> occhi Cappotto in Optimum composto di taglio temperatura (OCT) e trasferimento in uno stampo embedding contenente fresco ottobre. Orientare lo sguardo che il piano sagittale è parallelo alla faccia di taglio, utilizzando come pochi movimenti possibili ed evitando l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria. Flash freeze immergendo lo stampo in un bagno di ghiaccio / etanolo anidro. blocchi di conservare a -80 ° C. </li><li> Utilizzando un criostato, tagliare 20 micron sezioni sagittali e raccogliere su vetrini predepurata. </li><li> Sezioni macchia con ematossilina e eosina secondo protocolli standard 49. Immagine utilizzando un microscopio ottico attrezzato per la microscopia in campo chiaro. </li></ol> 3. istochimica colorazione <ol><li> Preparazione del campione <ol><li> Eutanasia animali a P30-35 utilizzando overdose isoflurano (30% in glicole propilenico) via aperta per inalazione goccia. Valutare l&#39;eutanasia con la cessazionedel respiro, il battito cardiaco e la mancanza di risposta a pizzicare la zampa. Confermare la morte per dislocazione cervicale e prelievo di organi, in linea con gli orientamenti IACUC. </li><li> Per rimuovere il cervello, pulire la pelle al sito di incisione con il 70% di etanolo, prima di tagliare attraverso la pelle alla base del cranio. Sbucciare indietro la pelle per esporre il cranio e pulita con il 70% di etanolo. Utilizzando gli strumenti puliti, accuratamente tagliate attraverso il cranio e rimuovere per esporre il cervello. Rimuovere le membrane, e rimuovere delicatamente il cervello dalla cavità del cranio. Sciacquare in PBS. </li><li> Cappotto il cervello in OCT e trasferimento in uno stampo embedding contenente fresco ottobre Orientare il cervello che il piano sagittale è parallelo alla faccia di taglio, utilizzando come pochi movimenti possibili ed evitando l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria. Flash congelamento immergendo lo stampo in un ghiaccio / bagno di etanolo secco e conservare a -80 ° C. </li><li> Utilizzando un criostato, tagliare 10 micron sezioni sagittali e raccogliere su vetrini predepurata. </li></ol></li> &lt;li&gt; NADH diaforasi colorazione <ol><li> Preparare 0,05 M tampone Tris, pH 7,6 sciogliendo 5,72 g Tris-HCl e 1,66 g Tris base in acqua 1L-deionizzata. Conservare a 4 ° C per un massimo di sei settimane. </li><li> Preparare la soluzione di NADH (2.25 mM NADH a 0,05 tampone M Tris). Aliquota e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare la soluzione NBT (2,5 mm Nitro-Blue Tetrazolium a 0,05 tampone M Tris). Conservare a 4 ° C fino a sei settimane in una bottiglia di vetro. </li><li> Combinare volumi uguali di soluzione di NADH e la soluzione NBT per rendere soluzione colorante e aggiungere 1 ml di ogni diapositiva. Incubare a 37 ° C in una camera umidificata per 30 min. </li><li> Aspirare soluzione colorante e lavare tre volte con dH 2 O. </li><li> Lavare tre volte ciascuno in ordine ascendente e discendente concentrazioni di acetone / DH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare tre volte in dH 2 O e montare sezioni con mezzo acquoso. Immagine utilizzando un microscopio ottico attrezzato per luminoso fmicroscopia ield. Blu colorazione corrisponde all&#39;attività enzimatica. </li></ol></li><li> Succinato deidrogenasi istochimica colorazione <ol><li> Preparare 0.2 M sodio fosfato monobasico / DH 2 O e 0,2 M sodio fosfato bibasico / DH 2 O. </li><li> Rendere 0,2 M tampone fosfato, pH 7,6 combinando 3 parti fosfato monobasico con 20 parti di sodio fosfato bibasico. </li><li> Preparare la soluzione di colorazione (0,1 M di sodio succinato, 1,25 m NBT in 0.2 M tampone fosfato) e aggiungere 1 ml di ogni diapositiva. Incubare a 37 ° C in una camera umidificata per 60 min. </li><li> Aspirare soluzione colorante e lavare tre volte in DH 2 O. </li><li> Lavare tre volte ciascuno crescente e decrescente concentrazioni di acetone / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare tre volte in dH 2 O e montare sezioni con mezzo acquoso. Immagine utilizzando un microscopio ottico attrezzato per la microscopia in campo chiaro. Blu colorazione corrisponde itl&#39;attività enzimatico. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

trattamenti robusti sono necessari per limitare l&#39;impatto di condizioni legate all&#39;invecchiamento umano debilitante, ma rimangono sfuggente per molte condizioni. Per identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento, le cause e la patologia di malattie associate con l&#39;invecchiamento devono prima essere capiti. Non tutti i topi geneticamente modificati immediatamente presenti con fenotipi chiari che sono legati alla malattia di interesse, anche se questi geni sono stati precede...

malattie età-associate stanno diventando sempre più diffusi nella società moderna. Come la scienza medica migliora e aumenta l&#39;aspettativa di vita, la popolazione continua a invecchiare e l&#39;onere di queste malattie cresce. sono necessarie per ridurre l&#39;impatto di condizioni debilitanti trattamenti efficaci ma rimangono sfuggente, in molti casi. Solo attraverso la comprensione delle cause e patologia delle malattie associate con l&#39;invecchiamento possono gli scienziati cominciare a identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento. Condizioni legate all&#39;età comuni includono malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD) e la degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD). PD è il disturbo del movimento più comune causata da neurodegenerazione negli esseri umani. La maggior parte dei pazienti parkinsoniani mostrano sintomi come tremore a riposo, bradicinesia e la rigidità dopo 50 anni di età. esordio precoce è stato osservato anche in circa il 10% dei casi. AMD è la principale causa di cecità neigli anziani, progressivamente danneggiando fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) negli occhi. visione centrale è compromessa ma la visione periferica è generalmente inalterata. Ci sono due forme di AMD. Nella forma &quot;a secco&quot;, depositi di proteine ​​extracellulari conosciuti come forma drusen tra l&#39;RPE e la membrana di Bruch (BM), che porta alla atrofia geografica e offuscamento della visione centrale. I più gravi &quot;wet&quot; del modulo risultati di neovascolarizzazione della coroide attraverso BM negli strati RPE e fotorecettori e può portare a hamorrhaging sotto la retina che provoca danni permanenti al tessuto retinico. ampi studi di associazione Genome hanno precedentemente identificato loci che sono associati con una maggiore suscettibilità a questa malattia e ha identificato due regioni di interesse: fattore complemento H (CFH) sul cromosoma 1 e il 10q26 locus, dove l&#39;età-correlate maculopatia suscettibilità 2 (ARMS2) e ad alta temperatura fattore requisito A1 (HtrA1) geni sono localizzati 1-5 </sup&gt;. Le combinazioni di questi alleli aumentano la probabilità di AMD in modo dose-dipendente e SNP specifici possono essere preferenzialmente associate sia con le forme umido oa secco di AMD 3-6. CFH agisce come regolatore negativo della via alternativa (AP) del sistema del complemento inibendo l&#39;attivazione di C3. Un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) è stato collegato a un aumentato rischio di AMD, causando lo scambio di tirosina 402 in esone 9 con istidina a causa di una T di C sostituzione 1. In AMD si ritiene che l&#39;AP è misregulated causa di una perdita di funzione di CFH ma se l&#39;SNP svolge un ruolo causale è chiaro. Un&#39;ipotesi è che l&#39;istidina carica positiva è pensato per negare la capacità di CFH di legarsi a proteine ​​interagenti proteina C-reattiva ed eparina solfato 1,7. Gli studi in vitro di CFH Y402H di risultati contrastanti sulle differenze funzionali tra le varianti, e in vIVO lavoro in &lt;em&gt; CFH - / - topi che esprimono umanizzato CFH è in corso 8. ARMS2 si trova a monte del HtrA1 nel genoma primate, anche se il gene è assente nei topi. HtrA1 è una serina proteasi, ma ARMS2 è scarsamente caratterizzato. Il linkage disequilibrium fra SNPs nel locus AMD-associato ha reso difficile determinare i contributi al rischio delle singole mutazioni dei geni in questa regione, ma studi recenti hanno suggerito che è sovraespressione di HtrA1 piuttosto che ARMS2 che porta alla neovascolarizzazione e depositi di proteine ​​sottoretiniche 9-11. Tuttavia, la vicinanza dei geni in questo locus può consentire interazioni che non può essere studiata utilizzando transgeni inseriti in modo casuale. Oltre a AMD, la famiglia HtrA di serina proteasi è stata associata a molte malattie umane. Tutte le proteine ​​HtrA contengono un dominio serina proteasi seguito da almeno un dominio PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 e HtrA4 condividono la grmangerai omologia, costituito da un dominio peptide segnale, legame del fattore di crescita insulino-simile, un dominio inibitore della proteasi Kazal, il dominio serina proteasi e un dominio PDZ. HtrA2 ha un diverso N-terminale, costituito da una sequenza di localizzazione mitocondriale, dominio transmembrana e inibitore dell&#39;apoptosi dominio di legame seguita dalle proteasi e PDZ domini 12-16. HtrA1 mammiferi è regolata da rimodellamento substrato indotta nel sito attivo della proteasi suo dominio 17-20, e HtrA2 può anche essere modulata dall&#39;interazione tra la proteasi serina e domini PDZ che sopprime l&#39;attività della proteasi 21. È interessante notare che il dominio PDZ non sembra conferire regolamento simile a HtrA3 16. Le proteasi HtrA possono anche essere regolati da fattori estrinseci: è stato recentemente dimostrato che esiste un&#39;interazione regolamentare tra HtrA1 e protoporfirine 22 e HtrA2 possono essere regolati da fosforilazione dopo l&#39;attivazione del p38 MAP chinasipercorso in maniera PINK1-dipendente 23. La cancellazione di singoli membri della famiglia HtrA nei topi è stato documentato, tuttavia gli effetti meccanicistici per lo più non sono chiare in parte a causa della mancanza di fenotipi visibili. HtrA1 svolge una funzione importante nel controllo di qualità delle proteine ​​e la sua misregulation o mutazione è stata associata a molte malattie umane differenti tra cui l&#39;artrite, cancro e un aumento del rischio di AMD 3,4,24-32. Perdita di funzione HtrA2 nei tessuti neurali è stata associata a fenotipi PD negli esseri umani e topi, mentre la perdita di tessuti risultati non-neuronali in invecchiamento accelerato 33-37. HtrA3 disregolazione è stata associata a malattie, tra cui la preeclampsia e alcuni tipi di cancro 38,39. Up-regolazione di HtrA4 è stato osservato nelle placente dei pazienti preeclampsia, ma topi knockout non visualizzare un fenotipo evidente 40,41. La mancanza di fenotipi osservato in alcuni topi knockout è statopostulato ad essere il risultato di una compensazione tra il membro della famiglia HtrA: si pensa che sia HtrA4 e HtrA1 interagiscono con la famiglia TGF-B di proteine, consentendo la compensazione da HtrA1 sulla cancellazione dei HtrA4 41. Analogamente, si pensa che poiché HtrA1 e HtrA3 hanno un alto grado di omologia dominio potrebbero avere funzioni complementari 42. Tuttavia, è stato suggerito che le proteine ​​HtrA possono avere ruoli parzialmente antagoniste, in competizione per regolare obiettivi comuni 43. Per approfondire questi fattori di rischio tre linee di topi knock-in umanizzati sono stati generati. In CFH TM1 (CFH * 9) jhoh e CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, esone 9 del gene CFH viene sostituito con esone 9 della omologo umano. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codifica per la non-malattia associata tirosina residuo alla posizione 402, mentre CFH TM2 (CFH * 9) jhoh porta il Y402H, SNP rischio associato. InARMS2 tm1jhoh la sequenza ARMS2 umana è stata mirata a una regione a monte del HtrA1. Una sequenza di STOP loxP-fiancheggiato posto a monte della sequenza genica ma valle del promotore UbiC inclusa stato asportato attraversando a topi OzCre, che esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Rosa26, come descritto in precedenza 34. Oltre a questi knock-in linee, alleli knockout condizionali per CFH e HtrA1 (CFH tm1jhoh e HtrA1 tm1jhoh), così come gli altri membri della nota famiglia HtrA sono stati generati: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) e HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). I fori linea germinale sono state create da incrociando topi OzCre agli animali ingegnerizzati per affiancare esoni specifici con siti loxP, in modo tale che l&#39;eliminazione provoca uno spostamento telaio e / o la cancellazione del dominio attiva (CFH; esone 3, HtrA1; esoni 2-3, HTRA2: esoni 2-4, HtrA3; esone 3, HtrA4; esoni 4-6) 34,41. Una delezione neurale della HtrA2, cancellato usando Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Nestin (HtrA2 FLOX; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), è stato anche descritto 34. Solo topi privi HtrA2, sia sistemico o nei tessuti neurali, visualizzati fenotipi chiari, presentando con fenotipi parkinsoniani. Poiché alcuni di questi geni di interesse sono poste ad essere localizzata ai mitocondri 11,44-47, e la cancellazione di HtrA2 generato fenotipi parkinsoniani, un regime di fenotipizzazione con un focus mitocondriale e neurologico è descritto qui e risultati rappresentativi dei test di interesse sono forniti . Per esaminare topi geneticamente ingegnerizzati prodotti per indagare umana, malattie correlate all&#39;età accuratamente e sistematicamente una pianificazione fenotipizzazione iniziale è avvenuta, consistente in una serie di test relativi alle due principalipatologie di interesse: AMD e il Parkinson.

<table><tbody><tr><td>Decon all'etanolo</td><td>(Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>tubo conico da 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>batuffoli di cotone</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tappetino termico</td><td>Sunbeam</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di contenimento (vaschetta per cubetti di ghiaccio)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cronometro elettronico</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Scatola in plexiglass</td><td>costruita in officina</td><td></td><td>12" per 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Videocamera</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Tazze trasparenti</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 di pollice rete metallica</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (online) / 554219 (in negozio)</td> <td>12" per 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Pluriball</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per campioni dritti</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Pinza da dissezione a punta fine</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 16%</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>vetrini superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione ematossilina</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione Eosina Y</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Tris cloridrato</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto idrato</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolio Cloruro blu</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sodio succinato bibasico esaidrato</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount terreno di montaggio acquoso</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Treppiede per videocamera</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura di taglio ottimale (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Sezionamento del criostato&nbsp; Macchina</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Fuori produzione ma da allora sostituito da CM1950</td></tr></tbody></table>

un regime fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati per studiare geni implicati in malattie umane di invecchiamento

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Le malattie legate all'età stanno diventando sempre più diffuse e il peso continua a crescere con l'invecchiamento della popolazione. Sono necessari trattamenti efficaci per ridurre l'impatto delle condizioni debilitanti, ma in molti casi rimangono sfuggenti. Solo comprendendo le cause e la patologia delle malattie associate all'invecchiamento, gli scienziati possono iniziare a identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento. Le condizioni più comuni legate all'età sono i disturbi neurodegenerativi come il morbo di Parkinson e la cecità. La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è la principale causa di cecità negli anziani. Studi di associazione a livello di genoma hanno precedentemente identificato loci associati a una maggiore suscettibilità a questa malattia e identificato due regioni di interesse: il fattore H del complemento (CFH) e il locus 10q26, dove si trovano i geni della suscettibilità alla maculopatia legata all'età 2 (ARMS2) e del fattore di fabbisogno ad alta temperatura A1 (HtrA1). Il CFH agisce come regolatore negativo della via alternativa (AP) del sistema del complemento mentre l'HtrA1 è una serina proteasi extracellulare. ARMS2 si trova a monte di HtrA1 nel genoma dei primati, sebbene il gene sia assente nei topi. Per studiare gli effetti di questi geni, sono state generate linee murine knock-in umanizzate di Cfh e ARMS2, knockout di Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 e HtrA4 e una delezione neurale condizionale di HtrA2. Di tutti i topi geneticamente modificati prodotti, solo i topi privi di HtrA2, sia per via sistemica che nei tessuti neurali, hanno mostrato fenotipi chiari. Al fine di esaminare questi topi in modo approfondito e sistematico, è stato stabilito un programma di fenotipizzazione iniziale, costituito da una serie di test relativi a due principali malattie di interesse: AMD e Parkinson. I topi geneticamente modificati possono essere sottoposti a esperimenti appropriati per identificare fenotipi che possono essere correlati alle malattie associate nell'uomo. Un regime di fenotipizzazione con un focus mitocondriale è presentato qui insieme ai risultati rappresentativi dei test di interesse.

Questa sezione descrive esempi dei risultati ottenibili utilizzando questi metodi. Nel test arto posteriore, il numero di tentativi di tiro fatto e la latenza di caduta sono cumulativamente su due test consecutivi per ogni giorno. Questo test può essere utilizzato per confrontare geneticamente diversi gruppi di distinguere topi con ridotta resistenza neuromuscolare tm1jhoh HtrA2 (HTRA2 KO) topi in Figura 1A -. B dimostrare alcun cambi...

Viene presentato un approccio di genetica inversa per comprendere le famiglie di geni associate alle malattie umane, utilizzando il topo come sistema modello, e viene descritto il successivo programma di fenotipizzazione del topo. Poiché i topi difettosi in un gene di interesse, HtrA2, manifestavano sintomi parkinsoniani , il regime di fenotipizzazione si concentra sull'identificazione dei difetti neurologici.

Un regime Fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati per studiare geni implicati in malattie umane di invecchiamento

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di prova è stabilire una serie di test semplici che possono essere utilizzati come una prima procedura di fenotipizzazione per indirizzare successive analisi dettagliate dei fenotipi comportamentali e della struttura e funzione dei tessuti. Se i fenotipi comportamentali e cellulari delle malattie umane vengono riprodotti nel modello murino. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i test possono essere eseguiti in laboratori senza esperienza pregressa in tali esperimenti, senza richiedere investimenti significativi, pur fornendo informazioni utili per studi successivi più approfonditi.Eseguire il test degli arti posteriori quotidianamente dal quarto al decimo giorno post-natale per valutare la forza, la debolezza e l'affaticamento dei muscoli prossimali degli arti posteriori. Per iniziare, lasciare che i topi si abituino all'area del test per 30 minuti. Nel frattempo, preparare un nuovo tubo conico da 500 millilitri lavandolo con etanolo al 70% e quindi inserendo uno o due batuffoli di cotone sul fondo del tubo.Fissare questa provetta in posizione verticale per il test. Quando non vengono sottoposti al test, mantenere i cuccioli con la madre per conservarne la temperatura. Dopo il periodo di acclimatazione di mezz'ora, rimuovere un cucciolo dalla gabbia e registrarne il peso.Quindi sospesi delicatamente il neonato per gli arti posteriori sopra il bordo del tubo, in modo che il cucciolo sia rivolto verso il cotone. Conta quindi il numero di tentativi di trazione effettuati dal cucciolo e misura la latenza prima della caduta. Dopo aver atteso 30 secondi, ripeti il test.Dopo il secondo test, etichettare il cucciolo con un pennarello. Quindi strofinare delicatamente il cucciolo con la lettiera della gabbia di provenienza e restituirlo alla madre. Poiché i cuccioli più grandi di P8 non possono essere marcati, identificarli mediante escissione di una parte dell'alluce.Prima di passare al topo successivo, pulire il tubo da saggio con etanolo al 70%. Somministrare il Test di Osservazione dello Svezzamento quotidianamente da P19 a P21 per valutare il movimento e i livelli generali di attività. Iniziare lasciando i topi ambientarsi nell'area del test per 30 minuti.Mentre i cuccioli si ambientano, preparare l'arena. Contrassegnare una scatola di prova in plexiglas con una griglia di sei per sei quadrati di due pollici ciascuno. Prima di utilizzare la scatola, pulirla con etanolo al 70%.Quindi posizionare una videocamera in modo che una vista laterale dell'intera scatola riempia il campo visivo. Standardizzare l'aspetto dell'ambiente circostante per evitare di introdurre elementi di novità. Prima del test, trasferire il soggetto断latto in un contenitore pulito e registrare il suo peso.Quindi iniziare la registrazione video. Per prima cosa, riprendere una scheda di identificazione di prova con il numero di identificazione del topo, la sua età e la data corrente. Poi trasferire il topo dal bicchiere di contenimento al quadrato centrale.Per tre minuti, contare il numero di linee attraversate da entrambe le zampe anteriori. Dopo tre minuti, riportare il topo in una gabbia pulita e terminare la registrazione video. Tra ogni test, pulire la scatola con etanolo al 70%.Dai video, contare gli episodi di alzata in piedi, che si verificano quando un topo si erge in piedi con entrambe le zampe anteriori sollevate dal supporto. Contare anche gli episodi di pulizia, che avvengono quando entrambe le zampe anteriori sono impegnate nell'atto di pulizia. Eseguire il test della forza di presa nei giorni alterni tra P22 e P26 per valutare la forza neuromuscolare.Come di consueto, lasciare che i topi impieghino 30 minuti per adattarsi all'area di prova. L'apparato di prova è una scatola in plexiglass con una griglia a maglie. Pulire entrambi con etanolo al 70%.Quindi rivestire il fondo della scatola con uno strato di pluriball come imbottitura e coprire il pluriball con carta per assorbire le escrezioni. Procedere separando i topi da test e posizionarli in tazze individuali. Ora, posizionare il primo topo al centro della griglia metallica e capovolgere lentamente la griglia a 10-20 centimetri sopra la superficie morbida della scatola.Misurare la latenza prima della caduta o terminare il test dopo 60 secondi, se il topo non cade. Quindi riportare il primo topo nel contenitore di attesa. Tra un test e l'altro, pulire la griglia con etanolo al 70% e sostituire il foglio di carta sopra l'imballaggio in bolle.Quindi eseguire il test sugli altri due topi del gruppo. Dopo che ogni topo &egrave; stato testato una volta, ripetere il processo altre due volte, per un totale di tre prove per ogni topo. Se ci sono meno di tre topi in un gruppo, assicurarsi che vi sia un tempo di recupero tra le prove di almeno cinque minuti.Per una colorazione con NADH diaphorasi, mescolare volumi uguali di soluzione di NADH appena preparata e soluzione di NBT appena preparata. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di colorazione a ogni vetrino e incubare i vetrini in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per una colorazione con succinato deidrogenasi, preparare una soluzione contenente succinato di sodio 0,1 molare, NBT 1,25 molare e tampone fosfato 0,2 molare.Quindi aggiungere un millilitro su ogni vetrino. Disporre i vetrini in una camera umidificata e incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione con uno dei coloranti, aspirare la soluzione di colorazione e lavare i vetrini tre volte con acqua distillata.Quindi lavare i vetrini attraverso una serie di bagni di acetone con concentrazioni crescenti e decrescenti. Per ciascuna concentrazione di acetone, eseguire tre lavaggi di due minuti ciascuno. Infine, risciacquare i vetrini tre volte con acqua distillata.Quindi montare i vetrini con un mezzo acquoso. I topi privi di espressione di HTRA2 sono stati esaminati mediante la serie descritta di test e confrontati con controlli provenienti dalla stessa nidiata. Non è stata osservata alcuna variazione nel numero di trazioni o nella latenza alla caduta tra P4 e P6. Tra P7 e P10 è stata notata una riduzione della forza neuromuscolare.Nel test di attività, si è osservata una ridotta attività nei topi knockout per HTRA2. I topi knockout per HTRA2 hanno inoltre mostrato una riduzione della forza nel test di presa sulla griglia metallica. Le colorazioni ematossilina ed eosina mostrano che i topi knockout per HTRA2 non presentavano alterazioni apparenti nella struttura retinica rispetto ai controlli a P35.Infine, la colorazione istochimica per l'attività del complesso della catena di trasporto degli elettroni è stata utilizzata per identificare modifiche nelle funzioni degli enzimi respiratori. È stata osservata una riduzione della colorazione nei topi knockout per HTRA2 rispetto ai controlli. Tale riduzione è stata evidente nel cervelletto e nello striato, ma non nella corteccia.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'attività e la forza neuromuscolare di topi geneticamente modificati, nonché di come combinare questi studi con assi cellulari. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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