Name: Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Impara a visualizzare molecole di DNA di grandi dimensioni legate alla superficie utilizzando un peptide fluorescente che si lega al DNA. Questo metodo consente di osservare e analizzare il DNA in movimento con facilità.

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Questo lavoro è stato supportato dal Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA biotinilazione <ol><li> Biotinilazione di blunt DNA ended utilizzando Terminal transferasi (TdT) Nota: utilizzare T4 DNA (166 kbp), che è un DNA ended smussato. <ol><li> Aggiungere 5 ml di 2,5 mM CoCl 2, 5 ml di 10 × tampone di reazione, 0,5 ml di 10 mM biotina-11-dUTP, 0.5 ml di transferasi terminale (10 unità) e 0,5 ml di T4 DNA (0,5 mcg / ml) alla miscela di reazione. Rendere ad un volume finale di 50 ml aggiungendo 38,5 ml di acqua. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 1 ora. Nota: tempo di reazione totale può produrre DNA a doppia legato, cioè, è possibile che biotins vengono contrassegnati alle due estremità. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Tenere il tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Biotinilazione di DNA ended appiccicoso Utilizzando DNA Ligase Nota: utilizzare λ DNA (48,5 kbp), che è un DNA appiccicoso-end. &lt;ol&gt; <li> Aggiungere 1 ml di T4 DNA ligasi, 5 microlitri di 10 × tampone di legatura, 1 ml di 25 ng / ml DNA λ fago, e aggiungere 43 ml di acqua per fare un volume finale di 50 pl. </li><li> Tenere il tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. funzionalizzato Derivatizzazione Surface Nota:. Per legare una estremità di una molecola di DNA sulla superficie di vetro, un gruppo amminico primario è silanizzato su un vetrino seguita da rivestimento biotina-PEG come mostrato in Figura 1 Il processo PEGylation è importante per l&#39;imaging DNA a singola molecola perché può ridurre significativamente il rumore casuale creato da attaccamento di molecole indesiderate sulla superficie. <ol><li> Piranha Pulizia Nota: Le soluzioni Piranha reagire violentemente con materiali organici, pertanto, deve essere maneggiato con cura, seguendo le linee guida di sicurezza adeguate. <ol><li> Luogo coprioggetto su un politetrafluoroetilene (PTFE) cremagliera, e tenere premuto By PTFE nastro sigillante filo longitudinale, metà sul bordo delle superfici e per metà sul rack. Dopo il confezionamento, lascia un lungo pezzo (~ 5cm) di nastro per la movimentazione della rastrelliera durante la procedura di pulizia. </li><li> Riempire un bicchiere di vetro 1 L con 350 ml di H 2 SO 4 e 150 ml di H 2 O 2 per rendere soluzione piranha in una cappa aspirante. Inserire la griglia in soluzione piranha per 2 ore. </li><li> soluzione Piranha vuoto dal bicchiere, e coprioggetto risciacquo con acqua deionizzata fino a che il pH dell&#39;acqua nel bicchiere raggiunge neutra. Utilizzare strisce di carta pH. </li><li> Sonicare i rack di vetrini in acqua bicchiere contenente, per 30 min. acqua vuota dal bicchiere appena prima che amino silanizzazione. Utilizzare 75 W di potenza sonicazione per pulire e derivatize i substrati di vetro. </li></ol></li><li> Aminosilanization sulla superficie di vetro <ol><li> Aggiungere 2 ml di N - [3- (trimethoxysilyl) propil] etilendiammina e 10 ml di acido acetico glaciale a 200 mldi alcool metilico in un contenitore di polipropilene pulito per la preparazione della soluzione aminosilanization. </li><li> Mettere vetrini puliti nel contenitore in polipropilene. Agitare a 100 rpm e temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Sonicare il bicchiere con derivatizzati vetrini per 15 minuti a 75 W. scuoterli a 100 rpm e temperatura ambiente per almeno 30 minuti. </li><li> Svuotare la soluzione dal bicchiere, e risciacquare coprioggetto con attenzione, una volta con alcool metilico, e due volte con alcol etilico. coprioggetto Conservare in alcool etilico e utilizzarli entro due settimane. </li></ol></li><li> PEGylation del vetrino <ol><li> Rendere 10 ml di 0,1 M sodio bicarbonato (NaHCO 3). Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron. </li><li> Sciogliere 2 mg di carbonato di biotina-PEG-succinimidile (biotina-PEG-SC) e 80 mg di PEG-succinimidyl valerato (MPEG-SVG) in 350 ml di NaHCO 3. Utilizzare un tubo di protezione dalla luce. </li><li> Agitare la provetta con forza per 10 sec e centrifugare a 10.000 g per 1 min per rimuovere le bolle. </li><li> Risciacquare un vetrino con acetone, seguito da risciacquo con alcool etilico. Lasciare che il vetrino all&#39;aria asciugare completamente. </li><li> Mettere una goccia (50 ml) di soluzione di PEG sul vetrino pulito. Coprire la goccia delicatamente con un amino silanizzata copertura di slittamento, senza generare eventuali bolle. </li><li> Collocare i vetrini per 3 ore per una notte in un buio, ben livellato camera umida a temperatura ambiente. Utilizzare un titolare di punta della pipetta vuoto come la camera, con acqua sul fondo. Sigillare soluzione residua PEG nel tubo e la tiene a 4 ° C. </li><li> Sciacquare il vetrino PEGylated accuratamente con acqua deionizzata. Conservare in un luogo buio e asciutto fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 3. Assemblare una camera di flusso <ol><li> Realizzare un supporto acrilico perforato, come in Figura 2. Assicurarsi che il diametro dell&#39;inserto tubo è 0,762 millimetri e designare un foro è un ingresso e l&#39;altro èuna uscita (figura 2). </li><li> Posizionare nastri biadesivi Nastro adesivo (larghezza 5-6 mm) su un supporto acrilico (Figura 2), allineando perpendicolarmente ad un foro di ingresso e di uscita, senza perturbare fori canale. Utilizzare queste strisce di nastro come pareti multi-canale per rendere camere. Scrub il nastro utilizzando una punta di pipetta. </li><li> Posizionare un vetrino PEGylated sulla parte superiore per fare camere di flusso, con il lato rivolto verso il basso PEGylated. </li><li> Per evitare qualsiasi soluzione fuoriuscita, premere la parte superiore di un coprioggetto sopra la zona in cui vengono inseriti nastri biadesivi. Aggiungere colla quick-dry epossidica per chiudere i bordi della camera in alto e in basso (colore giallo nella figura 2). </li><li> Collegare un breve brano (2,5 cm) di tubo (diametro esterno, OD, 0,042 &quot;) per una siringa a tenuta di gas e sigillare il giunto con colla epossidica. </li><li> Collegare un lungo tubo flessibile (OD: 0.03 &quot;) per il tubo collegato alla siringa e sigillare il giunto con colla epossidica. </li><li> Riempire il tubing collegato alla siringa con acqua deionizzata. Assicurarsi che non vi è alcuna bolla d&#39;aria. </li><li> Inserire il tubo nel foro della camera di flusso sigillato con colla epossidica. </li><li> Mettere una punta gialla (200 microlitri punta), dall&#39;altro foro come un serbatoio. </li></ol> 4. Esempio Caricamento in camera di flusso Nota: neutravidina può essere sostituito con altre proteine ​​avidina come streptavidina. Tutte le reazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente, che sono menzionate. Prendere soluzione campione in una punta di colore giallo, e installare la punta con la soluzione sul foro del supporto acrilico (Figura 2b). <ol><li> Impostare la portata della pompa a siringa a 50 ml / min. Carico 20 ml di proteina avidina (25 ug / ml in soluzione T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e tenerlo per 10 min. </li><li> Carico 20 l di oligonucleotidi biotinilati (100 micron di 1 × TE), e tenerlo per 10 minuti. Se si utilizza transferasi terminale, saltare il caricodi oligonucleotidi. </li><li> Carico 20 ml di soluzione di DNA dal punto 1 nella camera di flusso ad una portata di 10 ml / min, e tenerlo per 30 min. </li><li> Lavare la camera di flusso con 1 × TE, e caricare 40 ml di FP-DBP 10 (~ 80 Nm). </li><li> Osservare DNA sotto un microscopio a fluorescenza con flusso continuo di molecole di colorazione in 1 × TE su una lente obiettivo 60X. Utilizzare 488 nm laser a stato solido per l&#39;eccitazione di FP (eGFP) -DBP. Per la piena tratto di molecole di DNA, si applicano diverse portate a seconda delle lunghezze di DNA utilizzati. Ad esempio, applicare 50 microlitri / min 48,5 kbp di DNA λ, e 100 microlitri / min per 166 kbp di T4 DNA. <ol><li> Per il riciclaggio del titolare acrilico, immergere camere a flusso assemblati in una soluzione detergente per la casa 12. Rimuovere nastri e resina epossidica con una lama di rasoio e strofinare con le mani per prendere completamente fuori. Sbloccare fori con aghi da siringa. Mantenere i titolari in acqua deionizzata fino a nuovo uso. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui vi presentiamo una piattaforma per la visualizzazione di molecole di DNA lunghe biotinilati per l&#39;ancoraggio sulle superfici. Abbiamo riportato un approccio per molecole di DNA impastoiati su una superficie rivestita proteina avidina con biotinilato albumina sierica bovina. 6 Nell&#39;approccio in precedenza, abbiamo trovato una questione cruciale del DNA foto-scissione causata da coloranti bis-intercalazione che macchiano molecole di DNA legato alla superficie. Poiché questi fluorofori continuamente ...

La visualizzazione di grandi molecole di DNA impastoiati sulle superfici di vetro o perline è stato utilizzato per lo studio delle interazioni DNA-proteina, la dinamica delle proteine ​​su substrato di DNA, 1,2 e fisica dei polimeri. 3,4 Una piattaforma per le grandi molecole di DNA a singolo tethered ha pochi distinta vantaggi rispetto ad altri metodi di immobilizzazione DNA. 5 primo, una grande molecola di DNA legato sulla superficie ha una naturale conformazione random coil senza un flusso di taglio, che è criticamente importante per una proteina di legame al DNA di riconoscere suo sito di legame. In secondo luogo, è molto facile cambiare l&#39;ambiente chimico intorno molecole di DNA per una serie di reazioni enzimatiche in una camera di flusso. In terzo luogo, un flusso di taglio microfluidico induce DNA molecolare estende fino al 100% della lunghezza del profilo completo, che è molto difficile da ottenere con allungamento DNA approcci alternativi come superficie di immobilizzazione 6 e nanochannel confinamento. 7 Un completamente stretched molecola di DNA fornisce anche informazioni di posizione che può essere utile per il controllo dei movimenti enzimatici sulla mappa genomica. Tuttavia, l&#39;approccio tethering DNA ha una lacuna critica che tintura del intercalante come YOYO-1 provoca generalmente molecole di DNA legato ad essere facilmente rotto dalla luce di fluorescenza di eccitazione. Generalmente, grandi molecole di DNA devono essere colorato con un colorante fluorescente per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. A questo scopo, YOYO-1 o altri coloranti della serie TOTO sono utilizzati principalmente perché questi coloranti fluorescenti solo quando intercalare DNA a doppia elica. 8 Tuttavia, è ben noto che bis intercalanti colorante provoca DNA indotta dalla luce foto-scissione, perché della intercalazione di fluorofori. 9 Inoltre, molecole di DNA fluorescente macchiate impastoiati in superficie sono più fragili in quanto i flussi di taglio possono esercitare rottura forze sul liberi di muoversi molecole di DNA. Pertanto, abbiamo sviluppato FP-DBP come un romanzo Ddye proteina NA-colorazione per l&#39;imaging di grandi molecole di DNA impastoiati in superficie. Il vantaggio di utilizzare FP-DBP è che non provoca foto-scissione delle molecole di DNA a cui si lega. 10 Inoltre, FP-DBP non aumenta la lunghezza del profilo del DNA, mentre bis-intercalanti coloranti aumentano la lunghezza del profilo di circa il 33%. Questo metodo di video introduce l&#39;approccio sperimentale per legare grandi molecole di DNA ad una superficie PEG-biotina. La Figura 1 illustra i diversi approcci di legare il DNA con estremità smussata ed estremità appiccicose. Così, questo metodo di colorazione può essere applicato a qualsiasi tipo di molecola di DNA. La Figura 2 illustra una rappresentazione schematica del gruppo camera di flusso che può essere controllata da una pompa a siringa per generare flussi di taglio per allungare molecole di DNA e per caricare chimica ed enzimatica soluzioni. la figura 3 mostra micrografie di molecole di DNA completamente allungato impastoiati sul PEGylatdi superficie ed 11 e colorati con FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Biotinilazione del DNA</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Biotinilazione del DNA con estremità smussata utilizzando la transferasi terminale (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Fornito con 10x tampone di reazione, 2,5 mM di cloruro di cobalto</td></tr><tr><td>Biotina-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotina-ddNTP È disponibile anche</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) Biotinilazione del DNA appiccicoso utilizzando DNA ligasi</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Fornito con 10x tampone di reazione</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Disponibile anche presso New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>2. Derivatizzazione della superficie funzionalizzata</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Pulizia Piranha</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, n. 1 Spessore</td></tr><tr><td>Rack</td><td></td><td></td> in teflon <td>Fabbricazione personalizzata</td></tr><tr><td>Nastro sigillante per filettatura in PTFE</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon & trade; nastro</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4, purezza 95%</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35% in acqua</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Pulitore</td></tr><tr> ad ultrasuoni da tavolo<td colspan="4">2.2) Aminosilantizzazione sulla superficie del vetro</td></tr><tr><td>N-[3-(Trimetossisilil)propil] etilendiammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purezza</td></tr><tr><td>Alcool metilico</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99,9% Purezza</td></tr><tr><td>Polipropilene Contenitore</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300202</td><td>99,9% Purezza</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) PEGilazione del vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300129</td> Vetrini per microscopio <td>con purezza del 99%</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&nbsp; mm</td></tr><tr><td colspan="4">3. Assemblaggio di una camera di flusso</forte></td></tr><tr><td>Supporto acrilico</td><td></td><td></td><td>Fabbricazione personalizzata</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>3M</td><td></td><td>Tipo trasparente</td></tr> Resina <tr><td>epossidica ad asciugatura rapida</td><td>Tubi</td> in polietilene 3M <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>A tenuta di gas 250 &; l Siringa</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Caricamento del campione nella camera di flusso</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td> Microscopio <td>con base Trizma</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Laser a stato solido (488&nbsp; nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione del surface-legato grande dna molecole con un dna proteina fluorescente binding peptide

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Grandi molecole di DNA legate sulla superficie di vetro funzionalizzata sono state utilizzate nella fisica dei polimeri e nella biochimica, in particolare per studiare le interazioni tra il DNA e le sue proteine leganti. Qui, riportiamo un metodo che utilizza la microscopia fluorescente per visualizzare grandi molecole di DNA legate sulla superficie. In primo luogo, i vetrini coprioggetti sono biotinilati e passivati mediante rivestimento con glicole polietilenico biotinilato, che lega specificamente il DNA biotinilato tramite i linker proteici avidina e riduce significativamente il legame indesiderato dovuto a interazioni non specifiche di proteine o molecole di DNA sulla superficie. In secondo luogo, le molecole di DNA vengono biotinilate con due metodi diversi a seconda dei loro terminali. Il DNA con estremità smussata è marcato con dUTP biotinilato al suo terminale idrossilico 3', mediante transferasi terminale, mentre il DNA con estremità appiccicosa è ibridato con oligonucleotidi complementari biotinilati mediante DNA ligasi. Infine, un flusso di taglio microfluidico fa sì che le singole molecole di DNA si allunghino per tutta la loro lunghezza di contorno dopo essere state colorate con peptide legante la proteina fluorescente (FP-DBP).

La Figura 1 mostra due diversi metodi tethering DNA seconda strutture terminali della molecola di DNA. Figura 1a illustra come i appiccicose molecole di DNA ended sono ibridate con oligonucleotidi biotinilati complementari, che sono immobilizzati sulla superficie PEG avidina-rivestita. Figura 1b mostra l&#39;aggiunta di biotinilato ddNTP o dNTP al gruppo idrossilico 3 &#39;di un DNA ended smussato da transferasi terminale. Abbiamo aggiun...

Presentiamo un approccio per la visualizzazione di grandi molecole di DNA colorate con peptidi leganti il DNA (FP-DBP) di proteine fluorescenti legate sulla superficie di polietilenglicole (PEG) e vetro rivestito di avidina e allungate con flussi di taglio microfluidici.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un sistema pratico per l'analisi del DNA mediante microscopio epifluorescente, per manipolare molecole singole di DNA su superfici di vetro modificate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della visualizzazione del DNA, durante l'esame del DNA stesso, nonché delle proteine leganti il DNA e di altre piccole molecole.Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di osservare e analizzare facilmente il DNA in movimento. Per iniziare, posizionare coprioggetti di vetro su un supporto in PTFE e fissarli al loro posto utilizzando un pezzo di nastro sigillante in PTFE. Dopo aver avvolto i coprioggetti, lasciare un pezzo di nastro lungo cinque centimetri da utilizzare per maneggiare il supporto durante la procedura di pulizia.In una cappa chimica, mescolare 350 millilitri di acido solforico e 150 millilitri di perossido di idrogeno in un becher di vetro da un litro per preparare una soluzione incisiva piranha. Successivamente, immergere il portacoprioggetti nella soluzione. Dopo due ore, svuotare il becher e risciacquare accuratamente i coprioggetti con acqua deionizzata.Continuare a sciacquare le lamelle fino a quando il pH dell'acqua nel becher raggiunge un valore neutro. Successivamente, sottoporre a sonicazione i supporti con le lamelle in un becher contenente acqua per 30 minuti, al fine di pulire e funzionalizzare i substrati di vetro. Svuotare l'acqua dal becher subito prima dell'aminosilanizzazione. Per iniziare, preparare la soluzione per l'aminosilanizzazione aggiungendo due millilitri di alchossisilano e 10 millilitri di acido acetico glaciale a 200 millilitri di alcol metilico in un contenitore pulito in polipropilene.Successivamente, posizionare i coprioggetti puliti nella soluzione. Quindi, mettere i coprioggetti puliti nella soluzione preparata e agitare a temperatura ambiente e 100 giri al minuto per 30 minuti. Successivamente, sottoporre il contenitore con i coprioggetti derivatizzati a sonificazione per 15 minuti a 75 watt.Quindi, agitarli nuovamente a temperatura ambiente e 100 giri/min per almeno 30 minuti. Al termine, svuotare la soluzione dal becher e risciacquare i coverslip tre volte, con attenzione: una volta con alcol metilico e due volte con alcol etilico.Dopo l'ultimo risciacquo, conservare le coprioggetti in alcol etilico e utilizzarle entro due settimane. Preparare innanzitutto 10 millilitri di una soluzione di bicarbonato di sodio 0,1 molare e filtrarla attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron. Successivamente, sciogliere 2 milligrammi di carbonato di succinimidile di biotina PEG e 80 milligrammi di valerato di succinimidile di PEG in 350 microlitri della soluzione filtrata di bicarbonato di sodio.Proteggere la soluzione dalla luce utilizzando un tubo protettivo contro la luce. Vortexare il tubo vigorosamente per 10 secondi, quindi centrifugarlo a 10.000 x g per un minuto per rimuovere eventuali bolle. Successivamente, sciacquare un vetrino con acetone seguito da alcol etilico.Dopo aver risciacquato, lasciare asciugare completamente la lamella all'aria. Applicare una goccia di 50 microlitri di soluzione di PEG sulla lamella pulita in vetro. Abbassare lentamente un'immersione silanizzata amminica sulla goccia con un leggero angolo, in modo da non generare bolle d'aria sotto l'immersione.Quindi, posizionare i vetrini in una camera orizzontale, al buio e umidificata, per almeno tre ore fino a tutta la notte, a temperatura ambiente. Al termine, sigillare la soluzione di PEG residua nel tubo protetto dalla luce e conservarla a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, risciacquare accuratamente i coprioggetti PEGilati con acqua deionizzata e quindi conservarli in un luogo al buio e asciutto fino al momento dell'utilizzo.Per creare la camera di flusso, posizionare strisce di nastro adesivo doppio su un supporto in acrilico, in modo che siano allineate perpendicolarmente ai fori di ingresso e di uscita e non disturbino nessuno dei fori del canale. Successivamente, premere sul nastro con la punta di una pipetta per sigillare i canali. Poi, posizionare un coverslip PEGilato, con il lato PEGilato rivolto verso il basso, sulla parte superiore del nastro per formare le camere di flusso.Per evitare che la soluzione fuoriesca, premere la parte superiore di un coprivetrino sulla zona in cui è posizionato il nastro biadesivo. Successivamente, aggiungere un adesivo rapido in resina epossidica ai bordi delle camere per fissarle saldamente. Poi, collegare un pezzo di tubo lungo 2,5 centimetri a una siringa ermetica e sigillare il giunto con colla epossidica.Quindi, collegare un tubo lungo e flessibile al tubicino proveniente dalla siringa. Nuovamente, sigillare il giunto con colla epossidica. Riempire il tubicino collegato alla siringa con acqua deionizzata, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.Successivamente, inserire il tubo nel foro della camera di flusso sigillato con colla epossidica. Posizionare una punta da pipetta da 200 microlitri sull'altro foro, da utilizzare come serbatoio. Impostare la portata della pompa a siringa a 50 microlitri al minuto.Quindi, far affluire 20 microlitri di una soluzione proteica di avidina nella camera e lasciarla in posa per 10 minuti. Successivamente, caricare 20 microlitri di oligo desossinucleotidi biotinilati in una siringa. Farli affluire nella camera e lasciarli in posa per 10 minuti.Se viene utilizzata una transferasi terminale, saltare il caricamento degli oligo desossinucleotidi. Caricare quindi 20 microlitri di una soluzione di DNA in una siringa, farla fluire nella camera a una velocità di 10 microlitri al minuto e mantenerla per 30 minuti. Al termine dell'incubazione di 30 minuti, lavare la camera di flusso con 40 microlitri di tampone TE 1X a una velocità di 50 microlitri al minuto.Dopo il lavaggio, caricare la camera con 40 microlitri dello stesso FP-DBP a una concentrazione di 80 nano-molar, in 1X TE. Per osservare l'intero intervallo di allungamento delle molecole di DNA, applicare diverse velocità di flusso in base alle lunghezze del DNA utilizzate. Osservare il DNA mediante un obiettivo da 60X, utilizzando un microscopio a fluorescenza. Di seguito è riportato un video al microscopio a fluorescenza che mostra molecole di DNA del batteriofago lambda, ancorate alla superficie, che vengono allungate dal flusso dopo la ligazione con oligonucleotidi complementari biotinilati.Sotto flusso, le molecole di DNA completamente allungate misurano 16,5 micron di lunghezza. In contrasto, le molecole di DNA del batteriofago T4 si allungano fino a una lunghezza di 56,4 micron sotto flusso. Questo allungamento è reversibile e il DNA può essere esteso e rilassato più volte.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il FP-DBP in analisi del DNA su larga scala, nonché essere in grado di dimostrare l'allungamento e il rilassamento del polimero del DNA.

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