Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di realizzare un comodo sistema di analisi del DNA per un microscopio a epifluorescenza, per manipolare il DNA di una singola molecola su superfici di vetro modificate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della visualizzazione del DNA. Quando si esamina il DNA stesso, così come le proteine leganti il DNA e altre piccole molecole.

Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di osservare e analizzare il DNA in movimento con facilità. Per iniziare, posiziona i vetrini coprioggetti su una griglia in PTFE e fissali in posizione, utilizzando un pezzo di nastro sigillante per filettature in PTFE. Dopo aver avvolto i vetrini, lasciare un pezzo di nastro lungo cinque centimetri da utilizzare per maneggiare il rack durante la procedura di pulizia.

In una cappa aspirante, unire 350 millilitri di acido solforico e 150 millilitri di perossido di idrogeno in un becher di vetro da un litro per ottenere una soluzione di incisione dei piranha. Quindi, posizionare la rastrelliera di vetrini coprioggetti nella soluzione. Dopo due ore, svuotare il becher e sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti con acqua deionizzata.

Continuare a sciacquare i vetrini coprioggetti fino a quando il PH dell'acqua nel becher raggiunge un PH neutro. Quindi, sonicare le rastrelliere di vetrini coprioggetti in un becher contenente acqua per 30 minuti, per pulire e derivare i substrati di vetro. Svuotare l'acqua dal becher, poco prima dell'aminosilana. Per iniziare, prepara la soluzione di aminosilanizzazione, aggiungendo due millilitri di alcossisilano e 10 millilitri di acido acetico glaciale a 200 millilitri di alcol metilico in un contenitore pulito di polipropilene.

Successivamente inserendo i vetrini coprioggetti puliti nella soluzione. Quindi, posizionare i vetrini coprioggetti puliti nella soluzione preparata e agitarli a temperatura ambiente e 100 giri/min per 30 minuti. Quindi, sonicare il contenitore con i vetrini coprioggetti derivatizzati per 15 minuti a 75 watt.

Quindi, agitateli di nuovo a temperatura ambiente e 100 giri/min per almeno 30 minuti. Una volta terminato, svuotare la soluzione dal becher e sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte, con cura. Una volta con alcol metilico e due volte con alcol etilico.

Dopo l'ultimo risciacquo, conservare i vetrini coprioggetti in alcool etilico e utilizzarli entro due settimane. Per prima cosa, preparare 10 millilitri di una soluzione di bicarbonato di sodio da 0,1 molari e filtrarla attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron. Quindi, sciogliere due milligrammi di biotina PEG succinimidil carbonato e 80 milligrammi di PEG succinimidil valerato in 350 microlitri della soluzione filtrata di bicarbonato di sodio.

Proteggere la soluzione dalla luce utilizzando un tubo di protezione dalla luce. Agitare energicamente la provetta per 10 secondi e poi centrifugarla a 10.000 x g per un minuto per eliminare eventuali bolle. Quindi, sciacquare un vetrino con acetone seguito da alcol etilico.

Una volta risciacquato, lasciare asciugare completamente lo scivolo all'aria. Versare una goccia da 50 microlitri di soluzione PEG sul vetrino pulito. Abbassare lentamente un vetrino coprioggetti amminico silanizzato sulla gocciolina con una leggera angolazione, in modo da non generare bolle d'aria sotto il vetrino.

Quindi, posizionare i vetrini in una camera piana, buia e umidificata per almeno tre ore o tutta la notte, a temperatura ambiente. Al termine, sigillare la soluzione PEG residua nel tubo di protezione dalla luce e mantenerla a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti PEGilati con acqua deionizzata e poi conservarli in un luogo buio e asciutto fino al momento dell'uso.

Per creare la camera di flusso, posizionare delle strisce di nastro adesivo biadesivo su un supporto in acrilico, in modo che sia allineato perpendicolarmente ai fori di ingresso e uscita e non perturbi nessuno dei fori del canale. Quindi, strofinare il nastro, utilizzando una punta per pipetta, per sigillare i canali. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetti PEGilato, con il lato PEGilato rivolto verso il basso, sulla parte superiore del nastro per creare camere di flusso.

Per evitare perdite di soluzione, premere la parte superiore di un vetrino coprioggetti sull'area in cui è posizionato il nastro biadesivo. Quindi, aggiungi una colla epossidica ad asciugatura rapida sui bordi delle camere, per fissarla in posizione. Quindi, collegare un pezzo di tubo lungo 2,5 centimetri a una siringa a tenuta di gas e sigillare il giunto con colla epossidica.

Quindi, collegare un tubo lungo e flessibile al tubo proveniente dalla siringa. E ancora, sigillare il giunto con colla epossidica. Riempire il tubo collegato alla siringa con acqua deionizzata, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.

Quindi, inserire il tubo nel foro della camera di flusso che è sigillato con colla epossidica. E posizionare un puntale per pipetta da 200 microlitri sull'altro foro, da utilizzare come serbatoio. Impostare la portata di una pompa a siringa a 50 microlitri al minuto.

Quindi, far scorrere 20 microlitri di una soluzione proteica avidina nella camera e tenerla lì per 10 minuti. Successivamente, caricare 20 microlitri di oligo deossinucleotidi biotinilati in una siringa. Versalo nella camera e tienilo lì per 10 minuti.

Se si utilizza una transferasi terminale, saltare il carico di oligo deossinucleotidi. Quindi, caricare 20 microlitri di una soluzione di DNA in una siringa, farla scorrere nella camera a una velocità di 10 microlitri al minuto e tenerla lì per 30 minuti. Dopo l'incubazione di 30 minuti, lavare la camera di flusso con 40 microlitri di tampone 1X TE a 50 microlitri al minuto.

Una volta lavata, caricare la camera con 40 microlitri dello stesso FP-DBP ad una concentrazione di 80 nano-molari, nel 1X TE.To vedere l'intera gamma di allungamento delle molecole di DNA, applicare velocità di flusso diverse a seconda delle lunghezze del DNA utilizzate. Osservare il DNA sotto una lente obiettivo 60X, utilizzando un microscopio a fluorescenza. Ecco un video al microscopio fluorescente che mostra le molecole di DNA lambda del batteriofago, legate alla superficie, allungate dal flusso dopo la legatura con oligonucleotidi complementari biotinilati.

Sotto flusso, le molecole di DNA completamente allungate, misurano 16,5 micron di lunghezza. Al contrario, il batteriofago T4 DNA momlecules, allungato fino a una lunghezza di 56,4 micron, è sotto flusso. Questo allungamento è reversibile e il DNA può essere esteso e rilassato più volte.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare FP-DBP in analisi del DNA più ampie e dimostrare l'allungamento e il rilassamento del polimero di DNA.