Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide
June 23rd, 2016
Presentiamo un approccio per la visualizzazione di grandi molecole di DNA colorate con peptidi leganti il DNA (FP-DBP) di proteine fluorescenti legate sulla superficie di polietilenglicole (PEG) e vetro rivestito di avidina e allungate con flussi di taglio microfluidici.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di realizzare un comodo sistema di analisi del DNA per un microscopio a epifluorescenza, per manipolare il DNA di una singola molecola su superfici di vetro modificate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della visualizzazione del DNA. Quando si esamina il DNA stesso, così come le proteine leganti il DNA e altre piccole molecole.
Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di osservare e analizzare il DNA in movimento con facilità. Per iniziare, posiziona i vetrini coprioggetti su una griglia in PTFE e fissali in posizione, utilizzando un pezzo di nastro sigillante per filettature in PTFE. Dopo aver avvolto i vetrini, lasciare un pezzo di nastro lungo cinque centimetri da utilizzare per maneggiare il rack durante la procedura di pulizia.
In una cappa aspirante, unire 350 millilitri di acido solforico e 150 millilitri di perossido di idrogeno in un becher di vetro da un litro per ottenere una soluzione di incisione dei piranha. Quindi, posizionare la rastrelliera di vetrini coprioggetti nella soluzione. Dopo due ore, svuotare il becher e sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti con acqua deionizzata.
Continuare a sciacquare i vetrini coprioggetti fino a quando il PH dell'acqua nel becher raggiunge un PH neutro. Quindi, sonicare le rastrelliere di vetrini coprioggetti in un becher contenente acqua per 30 minuti, per pulire e derivare i substrati di vetro. Svuotare l'acqua dal becher, poco prima dell'aminosilana. Per iniziare, prepara la soluzione di aminosilanizzazione, aggiungendo due millilitri di alcossisilano e 10 millilitri di acido acetico glaciale a 200 millilitri di alcol metilico in un contenitore pulito di polipropilene.
Successivamente inserendo i vetrini coprioggetti puliti nella soluzione. Quindi, posizionare i vetrini coprioggetti puliti nella soluzione preparata e agitarli a temperatura ambiente e 100 giri/min per 30 minuti. Quindi, sonicare il contenitore con i vetrini coprioggetti derivatizzati per 15 minuti a 75 watt.
Quindi, agitateli di nuovo a temperatura ambiente e 100 giri/min per almeno 30 minuti. Una volta terminato, svuotare la soluzione dal becher e sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte, con cura. Una volta con alcol metilico e due volte con alcol etilico.
Dopo l'ultimo risciacquo, conservare i vetrini coprioggetti in alcool etilico e utilizzarli entro due settimane. Per prima cosa, preparare 10 millilitri di una soluzione di bicarbonato di sodio da 0,1 molari e filtrarla attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron. Quindi, sciogliere due milligrammi di biotina PEG succinimidil carbonato e 80 milligrammi di PEG succinimidil valerato in 350 microlitri della soluzione filtrata di bicarbonato di sodio.
Proteggere la soluzione dalla luce utilizzando un tubo di protezione dalla luce. Agitare energicamente la provetta per 10 secondi e poi centrifugarla a 10.000 x g per un minuto per eliminare eventuali bolle. Quindi, sciacquare un vetrino con acetone seguito da alcol etilico.
Una volta risciacquato, lasciare asciugare completamente lo scivolo all'aria. Versare una goccia da 50 microlitri di soluzione PEG sul vetrino pulito. Abbassare lentamente un vetrino coprioggetti amminico silanizzato sulla gocciolina con una leggera angolazione, in modo da non generare bolle d'aria sotto il vetrino.
Quindi, posizionare i vetrini in una camera piana, buia e umidificata per almeno tre ore o tutta la notte, a temperatura ambiente. Al termine, sigillare la soluzione PEG residua nel tubo di protezione dalla luce e mantenerla a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti PEGilati con acqua deionizzata e poi conservarli in un luogo buio e asciutto fino al momento dell'uso.
Per creare la camera di flusso, posizionare delle strisce di nastro adesivo biadesivo su un supporto in acrilico, in modo che sia allineato perpendicolarmente ai fori di ingresso e uscita e non perturbi nessuno dei fori del canale. Quindi, strofinare il nastro, utilizzando una punta per pipetta, per sigillare i canali. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetti PEGilato, con il lato PEGilato rivolto verso il basso, sulla parte superiore del nastro per creare camere di flusso.
Per evitare perdite di soluzione, premere la parte superiore di un vetrino coprioggetti sull'area in cui è posizionato il nastro biadesivo. Quindi, aggiungi una colla epossidica ad asciugatura rapida sui bordi delle camere, per fissarla in posizione. Quindi, collegare un pezzo di tubo lungo 2,5 centimetri a una siringa a tenuta di gas e sigillare il giunto con colla epossidica.
Quindi, collegare un tubo lungo e flessibile al tubo proveniente dalla siringa. E ancora, sigillare il giunto con colla epossidica. Riempire il tubo collegato alla siringa con acqua deionizzata, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
Quindi, inserire il tubo nel foro della camera di flusso che è sigillato con colla epossidica. E posizionare un puntale per pipetta da 200 microlitri sull'altro foro, da utilizzare come serbatoio. Impostare la portata di una pompa a siringa a 50 microlitri al minuto.
Quindi, far scorrere 20 microlitri di una soluzione proteica avidina nella camera e tenerla lì per 10 minuti. Successivamente, caricare 20 microlitri di oligo deossinucleotidi biotinilati in una siringa. Versalo nella camera e tienilo lì per 10 minuti.
Se si utilizza una transferasi terminale, saltare il carico di oligo deossinucleotidi. Quindi, caricare 20 microlitri di una soluzione di DNA in una siringa, farla scorrere nella camera a una velocità di 10 microlitri al minuto e tenerla lì per 30 minuti. Dopo l'incubazione di 30 minuti, lavare la camera di flusso con 40 microlitri di tampone 1X TE a 50 microlitri al minuto.
Una volta lavata, caricare la camera con 40 microlitri dello stesso FP-DBP ad una concentrazione di 80 nano-molari, nel 1X TE.To vedere l'intera gamma di allungamento delle molecole di DNA, applicare velocità di flusso diverse a seconda delle lunghezze del DNA utilizzate. Osservare il DNA sotto una lente obiettivo 60X, utilizzando un microscopio a fluorescenza. Ecco un video al microscopio fluorescente che mostra le molecole di DNA lambda del batteriofago, legate alla superficie, allungate dal flusso dopo la legatura con oligonucleotidi complementari biotinilati.
Sotto flusso, le molecole di DNA completamente allungate, misurano 16,5 micron di lunghezza. Al contrario, il batteriofago T4 DNA momlecules, allungato fino a una lunghezza di 56,4 micron, è sotto flusso. Questo allungamento è reversibile e il DNA può essere esteso e rilassato più volte.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare FP-DBP in analisi del DNA più ampie e dimostrare l'allungamento e il rilassamento del polimero di DNA.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per visualizzare grandi molecole di DNA colorate con peptidi leganti il DNA proteico fluorescente (FP-DBP). La tecnica prevede l'ancoraggio di queste molecole su una superficie di vetro rivestita di polietilenglicole (PEG) e avidina e il loro stiramento mediante flussi di taglio microfluidici.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Visualizzazione del DNA
- Microscopia fluorescente
- Manipolazione di molecole singole
Sfondo
- Lo studio si concentra sull'analisi del DNA e delle proteine leganti il DNA.
- Mira a migliorare la comodità dei sistemi di analisi del DNA.
- Questo metodo permette l'osservazione del DNA in movimento.
- È progettato per l'uso con microscopi epifluorescenti.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un sistema per manipolare il DNA a molecola singola.
- Migliorare la visualizzazione del DNA e delle proteine associate.
- Facilitare l'analisi della dinamica del DNA.
Metodi utilizzati
- Preparazione di vetrini di copertura in vetro su un supporto PTFE.
- Fissaggio dei vetrini con nastro sigillante a filo PTFE.
- Procedura di pulizia per le superfici di vetro modificate.
- Utilizzo di flussi di taglio microfluidici per stirare il DNA.
Risultati principali
- Ancoraggio di successo di grandi molecole di DNA su superfici modificate.
- Visualizzazione efficace della dinamica del DNA mediante colorazione FP-DBP.
- Migliorata capacità di analizzare il DNA in movimento in tempo reale.
- Dimostrazione del potenziale del metodo nella ricerca sul DNA.
Conclusioni
- La tecnica offre un approccio innovativo alla visualizzazione del DNA.
- Fornisce informazioni sulle interazioni del DNA con le proteine leganti.
- Questo metodo può far progredire la ricerca nel campo della biologia molecolare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA-protein binding events for mechanistic clarification.
- Supports functional validation of DNA-binding targets in a controlled environment.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular interactions relevant to disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for preparing validated DNA substrates for high-content assays.
- Enables quantitative measurement of DNA stretching and relaxation under defined conditions.
- Supports standardization and scalability for compound screening targeting DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling DNA-protein dynamics at the single-molecule level.
- Offers continuity from discovery through preclinical validation for DNA-targeting modalities.
- Reduces biological ambiguity in early-stage risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing DNA-protein interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, surface-tethered DNA substrates with quantitative readouts.
- Analytics: Provides real-time measurement of DNA elongation and relaxation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when DNA-protein interactions are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse DNA-binding protein studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by clarifying early-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DNA-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, microfluidics, and fluorescence microscopy.
- Demands access to epifluorescent microscopes and microfluidic flow control systems.
- Necessitates cross-team standardization of surface preparation and DNA labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different DNA lengths or binding protein classes.
- Surface passivation and non-specific binding reduction are critical for reliable outputs.
