Name: Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di Drosophila Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Scopri le tecniche elettrofisiologiche per registrare risposte intracellulari di fotorecettori e interneuroni di Drosophila a stimoli luminosi controllati in vivo. Questo metodo consente registrazioni di alta qualità con danni cellulari minimi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Mick Swann, Chris Askham e Martin Gautrey per i loro importanti contributi nella progettazione e costruzione di molti componenti elettrici e meccanici dei rig. L'attuale ricerca di MJ è supportata dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant: BB/M009564/1), dallo State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning open research fund (Cina), dall'High-End Foreign Expert Grant (Cina), dalla Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (Finlandia) e dal Leverhulme Trust grant (RPG-2012-567).

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Abbiamo presentato i passaggi chiave di base su come utilizzare i microelettrodi convenzionali affilati per registrare le risposte intracellulari dei fotorecettori R1-R6 e delle LMC negli occhi di mosca intatti. Questo metodo è stato ottimizzato, insieme a strumenti hardware e software su misura, negli ultimi 18 anni per fornire registrazioni di alta qualità e di lunga durata per rispondere a un'ampia gamma di domande sperimentali. Investendo tempo e risorse per costruire set-up sperimentali robusti e precisi e per produrre microelettrodi con proprietà elettriche favorevoli, registrazioni di alta qualità possono diventare la norma in qualsiasi laboratorio che lavora sulla neurofisiologia visiva della Drosophila . Sebbene i sistemi di registrazione e stimolazione luminosa ben progettati siano importanti per l'esecuzione rapida di diversi paradigmi sperimentali, ci sono tre passaggi procedurali che sono ancora più critici per ottenere registrazioni di successo: (i) preparare la mosca con il minimo danno agli occhi, (ii) estrarre microelettrodi con le giuste proprietà elettriche e (iii) guidare l'elettrodo di registrazione nell'occhio senza romperne la punta. In definitiva, per registrare dati significativi, il ricercatore deve comprendere le basi fisiche dell'elettrofisiologia e come fabbricare microelettrodi adatti per i tipi di cellule bersaglio.
Pertanto, i limiti di questa tecnica sono principalmente stabiliti dalla pazienza, dall'esperienza e dall'abilità tecnica dell'investigatore. Poiché questa tecnica può richiedere molto tempo per essere padroneggiata per le piccole cellule di Drosophila , è consigliabile che gli elettrofisiologi in formazione si esercitino prima con occhi di insetti più grandi, come il moscone36 o la locusta35, utilizzando lo stesso rig. Una volta che l'esecuzione di registrazioni intracellulari di alta qualità dai fotorecettori e dagli interneuroni più grandi diventa di routine, è il momento di passare all'occhio di Drosophila . Un altro limite della tecnica riguarda l'identificazione cellulare. Le cellule di Drosophila penetrate possono essere caricate elettroforeticamente con coloranti, tra cui il giallo di Lucifero o la neurobiotina. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni della punta dei microelettrodi, l'elettroforesi funziona in modo meno efficiente rispetto agli elettrodi a resistenza inferiore, come gli elettrodi patch. Inoltre, i microelettrodi riempiti di colorante hanno caratteristiche elettriche meno favorevoli, rendendo molto più difficile registrare risposte di alta qualità con essi dai fotorecettori di Drosophila e dalle LMC.
Un problema tecnico che si verifica a volte è un segnale di ingresso instabile o una sua completa mancanza. Questo è spesso associato al fatto che il segnale di tensione è costantemente alla deriva o superiore/inferiore all'intervallo di registrazione dell'amplificatore. Nella maggior parte dei casi, questo comportamento è causato dal blocco dell'elettrodo di registrazione (o dalla sua punta troppo fine - con una resistenza o una capacità intramurale troppo elevata - per condurre correttamente cambiamenti rapidi del segnale). Sebbene si possa provare a sbloccare la punta ronzando la capacità dell'elettrodo, che a volte funziona, spesso la situazione si risolve meglio semplicemente cambiando l'elettrodo di registrazione. Ciò potrebbe richiedere ulteriori regolazioni dei parametri nello strumento di estrazione dei microelettrodi per ridurre la resistenza della punta dei nuovi elettrodi. La punta dell'elettrodo può anche bloccarsi nelle preparazioni, per le quali è stato necessario troppo tempo per coprire il foro corneale con vaselina. Il contatto prolungato con l'aria può seccare il tessuto retinico appena esposto, trasformando il suo strato superficiale in una sostanza simile alla colla. Se questo è il caso, l'investigatore in genere vede una macchia rossa di tessuto bloccata sull'elettrodo di registrazione quando lo estrae dall'occhio. L'unica soluzione qui è fare una nuova preparazione. La vaselina può fornire molti benefici per le registrazioni elettrofisiologiche: (i) impedisce la coagulazione dell'emolinfa che potrebbe rompere la punta dell'elettrodo; (ii) riveste la punta dell'elettrodo riducendone la capacità intramurale, che abbassa la costante di tempo dell'elettrodo, e quindi ha il potenziale per migliorare la risoluzione temporale dei segnali neurali registrati40,41; (iii) mantiene pulita la punta dell'elettrodo, facilitando le penetrazioni; e dopo la penetrazione, (iv) può anche aiutare a sigillare la punta dell'elettrodo alla membrana cellulare42. 
Il segnale può essere ulteriormente instabile o perso quando il filo di cloruro d'argento del portaelettrodo viene rotto o declorurizzato; in tal caso basta sostituire o ricloridare il vecchio filo. Il segnale mancante può anche derivare dal fatto che uno (o entrambi) i portaelettrodi non sono collegati saldamente alle loro prese. Tuttavia, è estremamente raro che un'apparecchiatura non funzioni correttamente. Se il segnale non è rilevabile e tutte le altre possibilità sono state esaurite, verificare che ogni parte dell'apparecchio di registrazione, compresi l'headstage, l'amplificatore, i filtri passa-basso e i convertitori AD/DA, siano collegati correttamente e funzionino normalmente. Un modo per raggiungere questo obiettivo è sostituire ogni strumento con un altro di un impianto noto per funzionare normalmente. In alternativa, utilizzare un generatore di segnali per verificare le prestazioni dei componenti elettronici uno per uno.
Ma forse il problema tecnico più comune che l'elettrofisiologo deve affrontare è quello della registrazione del rumore. In generale, la registrazione del rumore è l'attività elettrica osservata diversa dalla risposta neuronale diretta a un dato stimolo. Poiché la preparazione della mosca, se eseguita correttamente, è molto stabile, il rumore osservato (al di là della naturale variabilità delle risposte) il più delle volte deriva da loop di massa nell'apparecchiatura di registrazione, o viene captato da dispositivi elettrici vicini. Tale rumore è tipicamente il ronzio di rete a 50/60 Hz e le sue armoniche; ma a volte composto da forme d'onda più complesse. Per capire l'origine del rumore, rimuovere il supporto per la preparazione delle mosche dalla configurazione, collegare gli elettrodi di registrazione e di riferimento attraverso una goccia di Ring per mosche (o metterli in un piccolo bagno di soluzione per Ringer; vedere il passaggio 1.2.6) e registrare il segnale in modalità CC o a ponte. Se il rumore è osservabile sul segnale registrato, è probabile che il rumore sia esterno alla preparazione della mosca.
Un altro buon test per identificare l'origine del rumore è quello di sostituire i portaelettrodi con un modello di cella elettrica collegato all'amplificatore. In una configurazione idealmente configurata e messa a terra, il segnale registrato dovrebbe ora essere praticamente privo di rumore, mostrando solo il rumore di bit stocastico dal convertitore AD (nel migliore dei casi nemmeno quello!). Se il rumore è ancora presente, ricontrollare che tutte le apparecchiature del rig siano correttamente messe a terra. Un approccio conveniente per rilevare i loop di massa è: (i) scollegare tutti i cavi di messa a terra da tutte le parti all'interno dell'impianto; (ii) assicurarsi che, dopo aver fatto ciò, ogni singola parte sia effettivamente isolata da terra, per mezzo di un ohmmetro; iii) collegare le parti, una per una, direttamente alla terra centrale, non attraverso nessun'altra parte dell'impianto. Prova anche a modificare le configurazioni dell'apparecchiatura. Ad esempio, a volte spostare il computer e il monitor più lontano dal rig può ridurre il rumore; In altri momenti, tuttavia, lo spostamento del computer all'interno del rack dell'apparecchiatura riduce il rumore. Vale anche la pena scollegare le apparecchiature vicine per vedere se il rumore è ridotto o schermare componenti aggiuntivi. Inoltre, prova a scollegare o sostituire diversi componenti dell'apparecchiatura di registrazione, in particolare i cavi BNC (che possono avere collegamenti a terra difettosi). Se si osserva solo il rumore di bit quando si utilizza il modello di cella, la fonte di rumore iniziale sono gli elettrodi o la preparazione della mosca stessa. Ad esempio, potrebbe essere che l'elettrodo di riferimento tocchi inavvertitamente un nervo motore o fibre muscolari attive all'interno della capsula della testa (o disturbi i muscoli di volo nel torace, se posizionato lì). Di solito è più semplice preparare una nuova mosca per la registrazione, facendo attenzione a ridurre al minimo i danni alla mosca. Ma se il rumore persiste ed è a banda larga, è probabile che gli elettrodi non siano ottimali per gli esperimenti; troppo tagliente/fine (quindi troppo rumoroso) o semplicemente sbagliato per lo scopo; Abbiamo persino visto elettrodi di quarzo fungere da antenne, raccogliendo deboli segnali di trasmissione! Sebbene l'iterazione delle impostazioni dei parametri dell'estrattore-strumento per generare i microelettrodi giusti per registrazioni coerenti di alta qualità da specifici tipi di cellule possa richiedere molto sforzo, ne vale la pena. Una volta che gli elettrodi di registrazione sono ben adattati per gli esperimenti, possono fornire registrazioni di lunga durata di qualità eccezionale.
Le tecniche di registrazione dei microelettrodi affilati possono essere applicate in modo simile per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali in una moltitudine di preparazioni, inclusi diversi strati di elaborazione negli occhi e nel cervello degli insetti43,44. Poiché le punte dei microelettrodi possono essere molto sottili, queste in genere danneggiano le celle studiate meno rispetto alla maggior parte delle applicazioni di patch-clamp. È importante sottolineare che i moderni amplificatori a microelettrodi sample-and-hold consentono un buon controllo delle proprietà elettriche delle punte40,45-47. Pertanto, se applicata correttamente, questa tecnica può fornire dati affidabili sia da preparazioni in vivo3,5,7-10,44 che in vitro48 con un elevato rapporto segnale/rumore con una risoluzione inferiore al millisecondo. Una tale precisione sarebbe impossibile con le odierne tecniche di imaging ottico, che sono più rumorose e lente. Inoltre, il metodo può essere utilizzato per caratterizzare le proprietà elettriche della membrana delle piccole celle sia in configurazioni di corrente che di voltage-clamp5,29,33,36,40-42,49, fornendo dati preziosi per gli approcci di modellazione biofisica ed empirica7,8,11,33,49-54 che collegano gli esperimenti alla teoria.

La mosca della frutta occhio (Drosophila melanogaster) composto è un sistema di grande modello per studiare l&#39;organizzazione funzionale degli array fotorecettori e interneuroni per il campionamento e l&#39;elaborazione di immagini neurali, e per la visione degli animali. Il sistema ha lo schema elettrico più completa 1,2 ed è amabile a manipolazioni genetiche e accurato monitoraggio dell&#39;attività neuronale (di alto rapporto segnale-rumore e risoluzione temporale) 3-10. L&#39;occhio Drosophila è modulare, contenente ~ 750 strutture di lenti-capped apparentemente regolari chiamati ommatidi, che insieme forniscono il campo visivo panoramico che copre quasi tutte le direzioni intorno alla sua testa volare. Informazioni primario della occhio di campionatura unità sono i suoi fotorecettori rabdomerici 7,8,11. Ogni ommatidium contiene otto fotorecettori (R1-R8), che condividono lo stesso obiettivo sfaccettatura, ma sono allineati a sette diverse direzioni. Mentre i fotorecettori esterni R1-R6 are più sensibile alla luce blu-verde, sensibilità spettrale delle celle interne R7 e R8, che si trovano l&#39;uno sopra l&#39;altro e puntare nella stessa direzione, presentano tre sottotipi distintive: pallido, giallo e dorsale zona cerchio (DRA) 12- 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Figura 1. Organizzazione funzionale della Drosophila Eye. (A) I primi due gangli ottico, retina e la lamina, sono evidenziati in grigio all&#39;interno dell&#39;occhio mosca. Fotorecettori Retina R1-R6 e lamina grandi cellule monopolare (MLC: L1-L3) sono facilmente accessibili in vivo alle registrazioni di microelettrodi taglienti convenzionali. L&#39;elettrodo schema evidenzia il percorso normale di registrare da R1-R6 nella retina. Un percorso di registrare da LMCs nella lamina è di spostare parallelamente l&#39;elettrodo a sinistra. (B) Lamina è una matrice di organo retinotopicallycartucce ized, ognuno dei quali è ricco di neuroni che elabora le informazioni da una specifica piccola area nello spazio visivo. A causa della sovrapposizione neurale, sei fotorecettori provenienti da diversi ommatidi vicini inviano i loro assoni (R1-R6) per la stessa cartuccia lamina, formando sinapsi uscita istaminergici a L1-L3 e una cella amacrine (Am). (C) La diffusione delle informazioni neurali tra i terminali degli assoni R1-R6 e le interneuroni visivi (compresi L4, L5, Lawf, C2, C3 e T1), all&#39;interno di una cartuccia lamina è complessa. (D) R1-R6 assoni fotorecettori ricevono una valutazione sinaptiche da cellule monopolare L2 e L4. (B) e (C) modificato da Rivera-alba et al 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;occhio Drosophila è del tipo neurale sovrapposizione 16. Questo significa tcappello i segnali neurali di otto fotorecettori appartenenti a sette ommatidi vicina, che guardano allo stesso punto dello spazio, vengono riunite insieme in una cartuccia neurale nei prossimi due neuropils: la lamina e midollo. Mentre i sei fotorecettori esterni progetto R1-R6 loro terminali assoni alle colonne neurali nel lamina (figura 1), cellule R7 e R8 bypassare questo strato e rendere contatti sinaptici con la loro corrispondente colonna medulla 17-19. Questi cablaggi esatte producono il substrato neurale per la mappatura retinotopica di volare visione iniziale, dopo di che ogni lamina (Figure 1A-C) e la colonna midollare (cartuccia) rappresenta un singolo punto nello spazio. Ingressi diretti da fotorecettori R1-R6 sono ricevuti dai grandi cellule monopolare (MLC: L1, L2 e L3) e la cella amacrine (AM) nella lamina 1,2,20. Di questi, L1 e L2 sono i più grandi cellule, che mediano le principali vie di informazione (Figura 1D), WHIch rispondono alla On-Off e bordi off-movimento, e quindi costituiscono la base di calcolo del rilevatore di movimento 21,22. Esperimenti comportamentali suggerisce che in contrasto intermedia, i due percorsi facilitano il movimento percezione di direzioni opposte: back-to-front in L1 e frontale-to-back in cellule L2 23,24. Connettività implica inoltre che i neuroni L4 possono svolgere ruolo fondamentale nella comunicazione laterale tra cartucce vicini 25,26. sinapsi reciproci sono stati trovati tra le cellule L2 e L4 situati nello stesso e due cartucce adiacenti. A valle, ogni cella L2 e le sue tre celle L4 associati proiettano i loro assoni ad un obiettivo comune, il neurone Tm2 nel midollo, dove si ritiene ingressi da cartucce vicini per essere integrato per l&#39;elaborazione di front-to-back motion 27. Anche se i neuroni L1 ricevono input da persone dello stesso cartuccia L2S via sia giunzioni e sinapsi, che non sono direttamente collegati alla cartucce lamina l4s e quindi adiacenti. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; una valutazione Synaptic per R1-R6 assoni fotorecettori sono forniti solo dai neuroni appartenenti ai circuiti / L4 L2, ma non il percorso di 1,2 L1 (Figura 1D). Mentre i collegamenti dello stesso cartuccia sono selettivamente da L2 a R1 e R2 e da L4 a R5, tutti i fotorecettori R1-R6 ricevono un feedback sinaptica da L4 di una o entrambe le cartucce confinanti. Inoltre, ci sono forti connessioni sinaptiche da Am a R1, R2, R4 e R5, e cellule gliali sono anche sinapticamente collegati alla rete e possono quindi partecipare neurale elaborazione delle immagini 6. Infine, assonale gap giunzioni, che collega la vicina R1-R6 e tra R6 e R7 / R8 fotorecettori nella lamina, contribuiscono alla rappresentazione informazione asimmetrica e la lavorazione in ogni cartuccia 14,20,28. Registrazioni di tensione intracellulari di singoli fotorecettori e interneuroni visivi in quasi intatto Drosophila fornire alta R segnale-rumoredati azio con risoluzione sub-millisecondo 3,5,7-10,29, che è necessaria per dare un senso dei calcoli neurali veloci tra i neuroni connessi. Questo livello di precisione è impossibile dalle attuali tecniche di imaging ottico, che sono significativamente più rumoroso e tipicamente operano a 10-100 risoluzione msec. Inoltre, poiché gli elettrodi sono molto piccoli e taglienti punte, il metodo non è limitato a corpi cellulari, ma può fornire registrazioni diretti da piccole strutture neurali attive; come alberi dendritiche i LMCS &#39;o assoni dei fotorecettori, che non possono essere accessibili da molto più grandi punte di elettrodi di patch-clamp. È importante sottolineare che il metodo è anche strutturalmente meno invasiva e dannosa quanto la maggior parte delle applicazioni di patch-clamp, e quindi incide meno campionamento ambiente e le informazioni intracellulare delle cellule studiate. Così, convenzionali tecniche di microelettrodi taglienti hanno contribuito, e continuare a contribuire, scoperte fondamentali e visione originale in infor neuraleelaborazione mazioni alla scala momento opportuno; migliorare la nostra comprensione meccanicistica della visione 3-10. Questo articolo spiega come nelle registrazioni intracellulari vivo da Drosophila fotorecettori R1-R6 e MLC vengono eseguite in laboratorio Juusola. Questo protocollo descrive come costruire un adeguato impianto di elettrofisiologia, la preparazione al volo, ed eseguire le registrazioni. Alcuni dati rappresentativi è presentato, e alcuni problemi comuni e le possibili soluzioni sono discusse che possono verificarsi quando si utilizza questo metodo.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio zoom per la preparazione della mosca</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1,6x PF oculari: WHN30x-H/22</td><td>Capace di ingrandimento ~150X con lunga distanza di lavoro; supporto da tavolo in acciaio pesante su misura</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio in configurazione intracellulare</td><td>&middot; &nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; oculari: WHN30x-H/22</td><td>Gli oculari 30X sono necessari per vedere bene i riflessi della punta dell'elettrodo quando lo si infila nell'occhio attraverso il piccolo foro corneale</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Nikon SMZ645; oculari: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrante</td><td>Melles Griot</td><td>Con fori metrici M6 sulla breadboard</td><td>I nostri impianti su misura hanno un grande foro praticato attraverso la spessa breadboard che consente l'ingresso del palo della piattaforma di preparazione delle mosche (ospita un dissipatore di calore in rame con elettronica) dal basso</td></tr><tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatori</td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>Nelle nostre configurazioni intracellulari, vengono utilizzati diversi sistemi di micromanipolatori per guidare gli elettrodi di registrazione shap nell'occhio della mosca. Tutti i manipolatori elencati stanno fornendo con successo registrazioni stabili di lunga durata dai fotorecettori di Drosophila e dalle LMC.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley xyz-asse con controllo</td><td></td><td></td>manuale di precisione</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex triplo asse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml; rzh&auml; utente</td><td>M&auml; rzh&auml; utente DC-3K con stepper piezoelettrico aggiuntivo sull'asse x e controller</td><td></td><td></td>MS 314</tr><tr><td>Supporti magnetici</td><td>Qualsiasi base magnetica con interruttore on/off andrà bene</td><td></td><td>Ad esempio, per gestire i cavi all'interno della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Portaelettrodi</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0,3 - 0,5 mm di diametro; deve essere clorurato per i portaelettrodi</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa in fibra ottica</td><td>Molti diversi, tra cui i</td> fasci di fibre ottiche Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnologia</td><td></td> ultrafine <td>Per fornire lo stimolo luminoso a LED al sistema a braccio cardanico. Utilizziamo guide luminose sia liquide che al quarzo (gamma da UV a IR)</td></tr><tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Confezione da 100 pezzi Taglia</td><td>il fondo conico da una provetta da centrifuga in plastica da 50 ml e incolla su di essa un puntale per pipetta da 1 ml.</td></tr><tr><td>National</td><td>Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore per microelettrodi a elettrodo singolo con morsetto di corrente/tensione</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Prestazioni eccezionali!</td></tr><tr><td>Head-stage</td><td>Standard (+/- 150 nA)</td>Per sorgenti luminose <td>e driver LED npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OptoLED a 2 canali (Cairn Research Ltd., UK)</td><td></td><td>Molti dei nostri sistemi di stimolo sono costruiti internamente&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molte</td><td>aziende possono scegliere tra</td><td></td><td>Biosyst; sistema basato su Matlab scritto su misura per il lavoro sperimentale e teorico nel laboratorio Juusola</td></tr><tr><td>Personal Computer o Mac</td><td></td><td></td><td>Assicurarsi che il PC o il Mac siano compatibili con il sistema di acquisizione dati e il software</td></tr><tr><td>Sistema a braccio cardanico.</td><td>Auto-progettato e costruito</td><td></td><td>Fornendo un accurato posizionamento x, y, z degli stimoli luminosi Sistema di</td></tr><tr><td>controllo della temperatura di Peltier&nbsp;</td>Gabbia di Faraday <td>auto-progettata e costruita</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Autocostruita</td><td></td><td>Schermatura dal rumore elettromagnetico</td></tr><tr>Capillari <td></td> in<td>vetro borosilicato filamentato</td><td>Diametro esterno: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Diametro interno: 0,5 - 0,7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Capillari <td></td> in<td>vetro quarzo filamentato</td><td>Diametro esterno: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Diametro interno: 0,5 - </td> Estrattore per pipette da 0,7 mm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strumento Sutter Azienda</td><td>Modello P-2000 laser Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Per gli elettrodi di riferimento in borosilicato, utilizzare il programma preimpostato #11 (elettrodi patch): Calore = 350; Filamento = 4; Velocità 36; Ritardo = 200).1.2.1). Per gli elettrodi di registrazione in borosilicato, utilizzare il programma preimpostato #12 (che in genere estrae buoni diesis convenzionali per le registrazioni con fotorecettori): Calore = 355; Filamento = 4; Velocità 50; Ritardo = 225; Tiro = 150. Per le registrazioni LMC, che richiedono elettrodi con punte più fini, questi valori devono essere regolati. Per l'estrazione di capillari di quarzo, il manuale P-2000 suggerisce programmi per microelettrodi a punta fine. Questi programmi I parametri preimpostati fungono da utili punti di partenza per modifiche sistematiche per generare elettrodi con un buon successo di penetrazione e un basso rumore di registrazione.</td></tr><tr><td>Soluzione Ringer extracellulare per l'elettrodo di riferimento</td><td>Sostanze chimiche di Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, saccarosio</td><td>Vedere la ricetta nella sezione</td></tr><tr><td>del protocollo 3 M Soluzione KCl per il riempimento del microelettrodo di registrazione filamentato</td><td>Sali di Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamette da</td><td></td><td></td><td></td>barba non in acciaio inox</tr><tr><td>Portalama/rompilama</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>In alternativa, utilizzare l'argilla da modellare</td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (punte super-fine)</td></tr></tbody></table>

metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione risposte di<em&gt; drosophila</em&gt; fotorecettori e interneuroni a luce stimoli<em&gt; in vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Le risposte di tensione dei fotorecettori degli insetti e degli interneuroni visivi possono essere registrate con precisione con microelettrodi affilati convenzionali. Il metodo qui descritto consente allo sperimentatore di misurare risposte intracellulari di alta qualità di lunga durata (da minuti a ore) dai singoli fotorecettori R1-R6 di Drosophila e dalle grandi cellule monopolari (LMC) agli stimoli luminosi. Poiché il sistema di registrazione ha un basso rumore, può essere utilizzato per studiare la variabilità tra le singole cellule nell'occhio del moscerino e come i loro risultati riflettono le proprietà fisiche dell'ambiente visivo. Descriviamo tutti i passaggi chiave nell'esecuzione di questa tecnica. Vengono descritti i passaggi fondamentali nella costruzione di un appropriato set-up elettrofisiologico per la registrazione, come la progettazione e la selezione dell'apparecchiatura sperimentale. Spieghiamo anche come prepararsi per la registrazione realizzando elettrodi di riferimento appropriati (nitidi) e (smussati). Vengono forniti dettagli su come fissare una mosca intatta in un portamosche su misura, preparare una piccola finestra nel suo occhio e inserire un elettrodo di registrazione attraverso questo foro con danni minimi. Spieghiamo come localizzare il centro del campo recettivo di una cellula, adattare il buio o la luce alla cellula studiata e registrare le sue risposte di tensione agli stimoli dinamici della luce. Infine, descriviamo i criteri per registrazioni normali stabili, mostriamo le risposte di tensione caratteristiche di alta qualità delle singole cellule a diversi stimoli luminosi e definiamo brevemente come quantificare le loro prestazioni di segnalazione. Molti aspetti del metodo sono tecnicamente impegnativi e richiedono pratica e pazienza per essere padroneggiati. Ma una volta appreso e ottimizzato per gli obiettivi sperimentali dello sperimentatore, garantisce eccezionali dati neurofisiologici in vivo.

Il metodo di registrazione microelettrodo tagliente, adattata qui per l&#39;occhio Drosophila, può essere utilizzato per quantificare attendibilmente neurale campionamento ed elaborazione nelle cellule della retina e lamina, e la comunicazione tra loro 4,5,7,8,10,33. Utilizzando per studiare la codifica in diversi titoli wild-type, mutanti o ceppi mosca geneticamente modificati, il metodo ha dimostrato il suo valore; non solo nel quantificare gli effetti di una mutazione, temperatura, dieta o espressione selezionata 3,4,6,9,10,14,30,34, ma anche nel rivelare motivi meccanicistici per comportamenti visivi alterati 14,34. Il metodo è anche facilmente applicabile ad altri preparati insetti 35,36, che abilita gli studi visione neuroethological. Poi abbiamo vetrina alcuni esempi delle sue applicazioni di successo. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Figura 7. TensioneRisposte di frutta mosca R1-R6 fotorecettore ad un impulso di luce a 20 e 25 ° C. Poiché le penetrazioni di microelettrodi taglienti sono spesso molto stabile, è possibile registrare le risposte di tensione della stessa fotorecettore R1-R6 ad un dato stimolo luce diverse temperature ambiente tramite riscaldamento o raffreddamento al volo. Nei nostri assetti, fly-custodia viene posta su un sistema di regolazione della temperatura close-loop-based Peltier-elemento. Questo ci permette di cambiare la temperatura testa della mosca in pochi secondi. Temperatura più elevata accelera le risposte di tensione e tipicamente riduce il potenziale di riposo dei fotorecettori R1-R6 (come indicato dalle frecce rosse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Studiando l&#39;effetto della temperatura sulla fotorecettori uscita <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Con un ben progettato e sistema di registrazione vibrazioni isolato, il metodo può essere utilizzato per misurare l&#39;effetto della temperatura sulla produzione neurali di una singola cella tramite riscaldamento o raffreddamento al volo. La proposta esempio mostra le risposte di tensione ad un luminoso lungo 10 msec impulso, registrata nello stesso fotorecettore R1-R6 a 20 e 25 ° C (Figura 7). Come quantificati prima di 4,9, il riscaldamento riduce il potenziale di riposo di un fotorecettore nel buio, e accelera le sue risposte di tensione. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Figura 8. segnalazione delle prestazioni di un Fruit Fly R1-R6 fotorecettore migliora con intensità della luce (A) Uscita fotorecettore a dim (sotto) e luminosi. (Di cui sopra; 10.000 volte più luminosa luce) ripetuti naturalistico serie tempo l&#39;intensità della luce registrata dalla stessa microelettrodonella stessa cella a 20 ° C. Le risposte allo stimolo luminoso sono più grandi, perché integrano più campioni, risposte elementari (dossi) a singoli fotoni 4,5,7,8. (B) 20 risposte tensione consecutivi di un secondo-lunghe sono sovrapposti. Risposte individuali (grigio chiaro) sono state prese dopo che le tendenze adattivi (freccia in A) si era ritirato (scatola tratteggiata in A). I mezzi di risposta corrispondente (segnali) sono le tracce più scure. La differenza tra il segnale e le risposte individuali è il rumore. (C) Le cellule &#39;prestazioni di segnalazione è stato quantificato dalle registrazioni&#39; Signal-to-Noise Ratio (SNR) utilizzando i metodi standard di 4,5,7,8. Uscita fotorecettore ha circa 64 Hz più ampia gamma di segnalazione affidabile alla stimolazione luminosa ( &#39;≥1 brillante, fino a 84 Hz rispetto alla dim (SNR SNR)&#39; Dim ≥1, fino a 20 Hz), con signal-to-Noise Ratio migliorando notevolmente; da SNR Dim MAX = 87 a SNR luminoso MAX = 1.868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Studiare Adattamento e Neural codifica per Repetitive stimolazione La non invasività del metodo, causando relativamente pochi danni alle strutture retina e lamina, lo rende ideale per studiare le prestazioni segnalazione di singole celle a differenti stimoli luminosi in loro prossimità stato fisiologico in vivo. La figura 8 mostra le risposte di tensione di un R1- R6 fotorecettore a una ripetuta serie naturalistica stimolo tempo l&#39;intensità della luce fioca e luminoso a 20 ° C, mentre la figura 9 </strong&gt; mostra le risposte di un&#39;altra fotorecettori R1-R6 e LMC a un diverso stimolo naturalistico a 25 ° C. Le registrazioni pre-e post-sinaptici sono state eseguite separatamente da due mosche diverse perché simultanee registrazioni intracellulari di due taglienti microelettrodi nella stessa mosca, uno nella retina e l&#39;altro nella lamina, sono troppo difficili da essere vitali 30. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> Figura 9. Le risposte di tensione di un frutto Fly R1-R6 fotorecettori e LMC a ripetuta stimolazione naturalistico a 25 ° C (A) R1-R6 (grigio) e LMC (nero) uscite registrate da diverse microelettrodi provenienti da diverse mosche. (B) 20 pre completamente luce-adattato consecutivi (sopra) e post-sinaptici (sotto) risposte al stesso modello di stimolo naturalistico con risposte individuali, mostrata in grigio chiaro und i corrispondenti mezzi di risposta (segnali) come le tracce più scure. La differenza tra il segnale e le risposte individuali è il rumore. (C) Le cellule &#39;prestazioni di segnalazione è stato quantificato dalle registrazioni&#39; Signal-to-Noise Ratio (SNR). Uscita LMC ha circa 10 Hz più ampia gamma di segnalazione affidabile (SNR &#39;LMC ≥1, fino a 104 Hz) di uscita R1-R6 (SNR&#39; R ≥1, fino a 94 Hz). Entrambi i rapporti segnale-rumore sono elevati (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), e come il rumore di registrazione era basso, le loro differenze riflettono le differenze di codifica reali tra le cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.</a> Dopo l&#39;esordio di stimolo, le registrazioni tipichely vedi veloce adattando le tendenze che in gran parte regrediscono entro 5-6 secondi. Da allora in poi, le cellule producono risposte altamente coerenti per ogni presentazione stimolo lungo 1 sec (ogni casella tratteggiata racchiude 20 di questi). La ripetibilità delle risposte diventa evidente quando questi sono sovrapposti (Figura 8B e Figura 9B). le risposte individuali sono le sottili tracce di grigio, e la loro media la traccia scura spessa. La risposta media è preso come segnale neurale, mentre il rumore neurale è la differenza tra la media e ogni 4,5,9,37,38 risposta individuale. I rispettivi rapporti segnale-rumore nel dominio della frequenza (Figura 8C e Figura 9C) sono stati ottenuti Fourier-trasformando il segnale e rumore blocchi di dati in spettri di potenza, e dividendo lo spettro di potenza del segnale medio con il corrispondente spettro di potenza del rumore medio 4, 5,9,37,38. Tipicamente, i rapporti massimi segnale-rumore of uscite neurali registrati alla stimolazione naturalistico sono elevate (100 - 1000), e nelle preparazioni più stabili con il rumore di registrazione molto bassa può raggiungere valori &gt;&gt; 1,000 (ad esempio, figura 8C.). Si noti inoltre che il riscaldamento espande le cellule &#39;larghezza di banda affidabile segnalazione 4 (SNR&#39; luminoso ≥ 1); per esempio, la differenza relativa tra i due R1-R6S nelle figure 8 e 9, rispettivamente è 10 Hz (84 a 20 ° C e 94 Hz a 25 ° C). Si può stimare ulteriormente tasso di ogni cellula del trasferimento di informazioni dal rapporto segnale-rumore utilizzando l&#39;equazione Shannon 32, o calcolando la differenza tra entropia e rumorosità tassi entropia le risposte &#39;attraverso il metodo di estrapolazione tripla 39. Maggiori dettagli sulle informazioni analisi teoriche, e il loro uso e limitazionis specificamente con questo metodo sono riportati nelle pubblicazioni precedenti 7,8,39. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> Figura 10. Le risposte di tensione di un Killer Fly R1-R6 fotorecettori e LMC a ripetuta stimolazione naturalistico a 19 o C. (A) R1-R6 (grigio) e LMC (nero) uscite registrate dalla stessa microelettrodo dallo stesso volo; prima postsinaptica e poi presinapticamente, come l&#39;elettrodo è stato avanzato in un occhio. (B) 20 pre consecutive (sopra) e post-sinaptici (sotto) le risposte (tracce grigio chiaro) per lo stesso modello di stimolo naturalistico sono stati catturati dopo l&#39;adattamento iniziale (scatola tratteggiata in A). I loro mezzi sono i segnali (le tracce più scure in alto), mentre le loro rispettive differenze nelle singole risposte danno il rumore. (C) La corrispondente Signal-to-Noise Ratio (SNR) sono stati calcolati come nelle figure 8C e 9C. Uscita LMC ha circa una gamma più ampia di 100 Hz segnalazione affidabile (SNR &#39;LMC MAX ≥1, fino a 234 Hz) di uscita R1-R6 (SNR&#39; R MAX ≥1, fino a 134 Hz). Entrambi i rapporti segnale-rumore sono elevati (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), e come lo stesso microelettrodo è stato utilizzato nelle registrazioni, le loro differenze riflettono reali differenze nelle uscite neurali pre e post-sinaptici. Questi risultati implicano che il sistema di registrazione ha avuto a basso rumore, e la sua influenza sulle analisi è stato marginale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Neuroethological Studi Vision </p&gt; Il metodo può anche essere usato per registrare le risposte pre e post-sinaptici tensione dagli occhi composti di diverse specie di insetti 7,8,35,36 (Figura 10), permettendo comparativi studi neuroethological di elaborazione delle informazioni visive. Per il sistema di registrazione presentata, l&#39;unico adattamento richiesto è nuovo preparato detentori, ognuna con un&#39;apertura opportunamente dimensionati per le specie studiate. Queste registrazioni sono esemplari da un killer di sesso femminile mosca (Coenosia attenuata). Essi mostrano risposte tensione intracellulari di un fotorecettore R1-R6 e LMC di identica stimolazione luminosa ripetitiva, usati per le controparti Drosophila in figura 9, ma a 19 o C. In questo caso, sia il pre e post-sinaptici dati sono stati registrati dal medesimo fly; uno dopo l&#39;altro, con lo stesso elettrodo di registrazione (riempito con KCl 3 M) prima avanzando attraverso la lamina laterale prima di entrareing retina frontale. Rispetto ai dati Drosophila a 25 ° C, i dati Coenosia - anche alla temperatura cooler - mostra risposte con dinamiche più veloci; ampliando la gamma di segnalazione affidabile (segnale-rumore &gt;&gt; 1) su una gamma di frequenza più ampia. Tali adattamenti funzionali in codifica neurale di stimoli naturalistici sono in linea con lo stile di vita predatori Coenosia &#39;s 36, che richiedono alta precisione le informazioni spazio-temporale per raggiungere i comportamenti di caccia aerei veloci.

I microelettrodi affilati consentono un'accurata caratterizzazione elettrofisiologica dell'output dei fotorecettori e degli interneuroni visivi in Drosophila vivente. Qui mostriamo come utilizzare questo metodo per registrare risposte di tensione di alta qualità delle singole cellule alla stimolazione luminosa controllata. Questo metodo è ideale per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali negli occhi composti da insetti.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare le risposte elettriche intracellulari dei fotorecettori di Drosophila e degli interneuroni visivi a stimoli luminosi controllati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurocodifica, come ad esempio come uno stimolo luminoso lo codificherà in una delle sue risposte, o come le sue informazioni visive e i fotorecettori e gli interneuroni estraggono dagli stimoli luminosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce registrazioni durature e di alta qualità dallo studio con pochi danni all'ambiente intracellulare e al campionamento delle informazioni.La caratteristica della dimostrazione che ciò può influire è fondamentale in quanto i suoi vari passaggi sono difficili da imparare a eseguire correttamente senza vederli. Estrarre un microelettrodo di riferimento dal borosilicato filamentato o dal tubo di vetro di quarzo utilizzando un estrattore per pipette standard. Cerca di ottenere una riduzione breve e graduale.Le impostazioni esatte variano da uno strumento all'altro. La dimensione dei pori sulla punta non è cruciale perché sarà rotta per gli esperimenti. Quindi estrarre un elettrodo di registrazione dallo stesso tubo di vetro e cercare di ottenere una conicità fine e graduale lunga da 10 a 15 millimetri.Al microscopio ottico, montare l'elettrodo su un lato di vetro con più adesivi e utilizzare un obiettivo ad aria 40x per ispezionarne la punta. Un buon elettrodo si assottiglia dolcemente fino a una punta invisibilmente piccola, attorno alla quale si possono vedere modelli di interferenza paralleli continui più scuri e più chiari. Poco prima dell'esperimento, riempire l'elettrodo di riferimento con i suoneria volanti, utilizzando una siringa da cinque millilitri collegata a un filtro antiparticolato, con una punta di plastica fine.Per gli esperimenti sui fotorecettori, caricare l'elettrodo di registrazione con 3 molari di cloruro di potassio fino a formare una gocciolina alla sua estremità grande. Ciò ridurrà al minimo il rumore proveniente dal giunto del liquido durante la registrazione. Per lavorare con LMC istaminergici, riempire gli elettrodi di registrazione con 3 molari di acetato di potassio e 0,5 millimolari di cloruro di potassio per ridurre al minimo l'effetto sulla batteria di cloruro della cella.Inizia caricando una fiala di mosca fresca con mosche di età compresa tra cinque e 10 giorni. Le mosche più giovani sono più fragili, ma possono essere registrate. Seleziona la prima mosca per l'elettrofisiologia.Le femmine grandi sono più facili da lavorare. Quando si trovano nel tubo di raccolta, sfruttare la loro tendenza intrinseca a salire verso l'alto nel puntale della pipetta e tappare il puntale più piccolo. Quindi, collegare una siringa da 100 millilitri con un tubo flessibile di plastica al puntale della pipetta, che viene allargato solo per far passare una Drosophila e collegare l'altra estremità a un grande puntale della pipetta attaccato al portamosche.Quindi spremere un piccolo volume d'aria dalla siringa per espellere la mosca nel portamosche. Guarda attraverso lo stereomicroscopio e somministra delicatamente più aria fino a quando la testa della mosca non sporge dall'estremità conica del portamosche. Assicurati che la mosca sia saldamente intrappolata dal torace.Quindi fissa la mosca con cera d'api. Utilizzare la temperatura più bassa dello scaldacera per sciogliere in modo pulito la cera, che apparirà trasparente. Se fa troppo caldo, la cera brucerà.Immobilizza la testa della mosca applicando un po' di cera d'api sulla proboscide e sull'angolo dell'occhio destro, evitando la cornea. Fissa questi due punti al portamosche. Completa rapidamente questo passaggio per evitare di bruciare la mosca.Quindi, indossa gli occhiali e fabbrica un microcoltello. Clamp una lama di rasoio non in acciaio inossidabile con due portalama a presa piatta e rompere una piccola striscia del suo bordo affilato. Idealmente, produci un bordo affilato come un rasoio che assomigli a una guglia.Ora, con attenzione e grande attenzione ai dettagli, usa il microcoltello per aprire alcuni ommatidi dell'occhio sinistro della mosca, ad esempio a quattro o cinque ommatidi dalla cuticola dorsale appena sopra l'equatore dell'occhio. Questo fornirà il passaggio per il microelettrodo di registrazione. Questo è piuttosto impegnativo, richiede un coltello ben fatto e deve essere appreso con la pratica.Quindi rimuovere delicatamente il piccolo pezzo di cornea dall'apertura, esponendo la retina sottostante. Ora usando i peli fini dell'applicatore di vaselina, copri rapidamente il foro con una minuscola goccia di vaselina. La gelatina ha l'ulteriore vantaggio di ridurre la capacità intramurale della pipetta.Evita di imbrattare l'occhio in quanto ciò offusca l'ottica. Quando si utilizza l'amplificatore per microelettrodi, essere sempre collegato a terra toccando la superficie metallica della gabbia di Faraday o del tavolo antivibrante per evitare cariche elettrostatiche. Fissare la mosca montata al palo della piattaforma di preparazione delle mosche.Ruotare il portamosche in modo che l'occhio sinistro della mosca sia direttamente rivolto verso l'investigatore. Quindi utilizzare un micro manipolatore a piccolo corso per inserire delicatamente l'elettrodo di riferimento smussato attraverso gli ocelli della mosca nella capsula della testa. Assicurati che la mosca appaia ancora sana e muova le antenne.La preparazione deve essere superba per meritare la registrazione da. Ora inserire il microelettrodo di registrazione affilato nell'occhio sinistro attraverso l'apertura rivestita di gelatina. Quando entra nel tessuto, la posizione della punta dell'elettrodo dovrebbe essere evidente dal suo modello di riflettanza.La fragile punta dell'elettrodo deve essere guidata perfettamente, altrimenti si romperà, il che è molto impegnativo. A seconda del tipo di cellula da cui viene registrata, la testa della mosca dovrebbe essere orientata in modo leggermente diverso. Con gli elettrodi in posizione, accendere l'amplificatore per microelettrodi.Quindi spegnere la fonte di luce fredda, scollegarla dalla rete e collegarla alla messa a terra centrale per ridurre al minimo il rumore elettrico indotto dal loop di terra. Quindi, regolare le guide luminose a collo d'oca in modo che il sistema di bracci Carden possa essere spostato liberamente intorno alla mosca. Quindi spegni le luci della stanza per mettere la preparazione della mosca in relativa oscurità.Ora misura la resistenza dell'elettrodo di registrazione nell'occhio. Deve essere compreso tra 100 e 260 megaohm. A volte la punta è bloccata e può essere cancellata utilizzando le funzioni di ronzio capacitivo e impulso di corrente dell'amplificatore.Se ciò non aiuta, usa un nuovo elettrodo. Quindi, impostare l'amplificatore su una pinza amperometrica o un ponte e azzerare la tensione tra gli elettrodi. Dopo che la mosca è stata adattata al buio per alcuni minuti, inserire la punta dell'elettrodo di registrazione nell'occhio in incrementi da 0,1 a un micron utilizzando un passo-passo piezoelettrico o ruotando delicatamente la manopola di risoluzione fine.Ad ogni passo, stimola l'occhio con un lampo di luce da uno a 10 millisecondi. Ogni lampeggio di luce causerà un breve calo della tensione o dell'ERG. Quando la punta dell'elettrodo entra nella lamina, chiudendosi sulle LMC, l'ERG si inverte.Quindi procedere con l'esecuzione delle misurazioni. Grazie alla non invasività, le prestazioni del segnale delle singole cellule possono essere studiate nel loro stato quasi naturale. La risposta in tensione di un fotorecettore R1-R6 alla luce fioca e brillante è stata misurata a 20 gradi Celsius.Successivamente, un fotorecettore R1-R6 è stato confrontato con un LMC a 25 gradi Celsius. Ciascuno è stato misurato su un moscerino diverso poiché le registrazioni intracellulari da parte di due microelettrodi affilati nello stesso moscerino sono troppo difficili per essere vitali. La ripetibilità delle risposte diventa evidente quando i dati vengono sovrapposti.I rapporti segnale/rumore nel dominio della frequenza sono stati ottenuti in quattro anni trasformando i blocchi di dati di segnale e rumore in spettro di potenza, e quindi dividendo lo spettro di potenza media del segnale per il corrispondente spettro di potenza media del rumore. Il risultato può essere estremamente sensibile ai segnali nelle migliori preparazioni. La tecnica può essere utilizzata per registrare per molte specie.Ai moscerini Coenocia è stata somministrata la stessa stimolazione luminosa naturalistica e ripetitiva a 19 gradi Celsius. I dati sono stati presi pre e post-sinapticamente dallo stesso moscerino facendo avanzare l'elettrodo di registrazione. La dinamica più veloce della registrazione è coerente con la natura predatoria di questa specie.Una volta masterizzata, questa tecnica consente registrazioni sempre lunghe e di alta qualità, se eseguita correttamente. Mentre si tenta questa procedura è importante rendersi conto, intendo dire che è come imparare a suonare il pianoforte. Più ti eserciti, migliori saranno i risultati che otterrai.Seguendo questa procedura, altri metodi, come gli interventi farmacologici, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il ruolo dei neuromodulatori nel modellare le risposte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiofisica per esplorare come ottimizzare le informazioni, la cattura e il trasferimento della luce, oltre alle reazioni biochimiche caustiche nel macchinario di fototrasduzione e nelle successive scienze biologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare la Drosophila per gli esperimenti intracellulari e come risvegliare le risposte neuronali dai suoi fotorecettori e interneuroni.

electrophysiological-method-for-recording-intracellular-voltage

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Il video dimostra la registrazione dell'attività elettrica nei neuroni fotorecettori dell'ommatidio di Drosophila stabilendo una configurazione dell'intera cellula. Evidenzia l'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio da parte di impulsi luminosi, con conseguenti urti quantici misurabili.

Registrazioni con morsetto di tensione a cellula intera dai fotorecettori di Drosophila

La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell'occhio composto di una farfalla.

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti<em&gt; In Vivo</em&gt; registrazioni intracellulari

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Abbiamo sviluppato due metodi per lo studio degli effetti dei riferimenti visivi sul comportamento in assenza di segnali tattili e chimici. Un metodo comporta risposte videoregistrando di gamberi alle pareti riflettenti in un acquario, l'altro prende in esame gli effetti di input visivi forniti da un gambero vivo dietro un divisorio trasparente.

Registrazione di risposte comportamentali alla riflessione in gamberi di fiume

La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Diversi rivestimenti degli elettrodi influiscono sulle prestazioni di registrazione neurale attraverso modifiche alle proprietà elettrochimiche, chimiche e meccaniche. Confronto di elettrodi in vitro è relativamente semplice, tuttavia confronto della risposta in vivo è tipicamente complicata da variazioni di distanza elettrodo / neurone e tra animali. Questo articolo fornisce un metodo robusto per confrontare elettrodi di registrazione neurali.

Un metodo per la sistematica elettrochimici ed elettrofisiologiche di valutazione dei neurali registrazione elettrodi

Scopri le tecniche elettrofisiologiche per registrare risposte intracellulari di fotorecettori e interneuroni di Drosophila a stimoli luminosi controllati in vivo. Questo metodo consente registrazioni di alta qualità con danni cellulari minimi.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di Drosophila Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli In Vivo (Video) | JoVE Journal

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di

Esplora altri video