Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di Drosophila Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare le risposte elettriche intracellulari dei fotorecettori di Drosophila e degli interneuroni visivi a stimoli luminosi controllati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurocodifica, come ad esempio come uno stimolo luminoso lo codificherà in una delle sue risposte, o come le sue informazioni visive e i fotorecettori e gli interneuroni estraggono dagli stimoli luminosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce registrazioni durature e di alta qualità dallo studio con pochi danni all'ambiente intracellulare e al campionamento delle informazioni.

La caratteristica della dimostrazione che ciò può influire è fondamentale in quanto i suoi vari passaggi sono difficili da imparare a eseguire correttamente senza vederli. Estrarre un microelettrodo di riferimento dal borosilicato filamentato o dal tubo di vetro di quarzo utilizzando un estrattore per pipette standard. Cerca di ottenere una riduzione breve e graduale.

Le impostazioni esatte variano da uno strumento all'altro. La dimensione dei pori sulla punta non è cruciale perché sarà rotta per gli esperimenti. Quindi estrarre un elettrodo di registrazione dallo stesso tubo di vetro e cercare di ottenere una conicità fine e graduale lunga da 10 a 15 millimetri.

Al microscopio ottico, montare l'elettrodo su un lato di vetro con più adesivi e utilizzare un obiettivo ad aria 40x per ispezionarne la punta. Un buon elettrodo si assottiglia dolcemente fino a una punta invisibilmente piccola, attorno alla quale si possono vedere modelli di interferenza paralleli continui più scuri e più chiari. Poco prima dell'esperimento, riempire l'elettrodo di riferimento con i suoneria volanti, utilizzando una siringa da cinque millilitri collegata a un filtro antiparticolato, con una punta di plastica fine.

Per gli esperimenti sui fotorecettori, caricare l'elettrodo di registrazione con 3 molari di cloruro di potassio fino a formare una gocciolina alla sua estremità grande. Ciò ridurrà al minimo il rumore proveniente dal giunto del liquido durante la registrazione. Per lavorare con LMC istaminergici, riempire gli elettrodi di registrazione con 3 molari di acetato di potassio e 0,5 millimolari di cloruro di potassio per ridurre al minimo l'effetto sulla batteria di cloruro della cella.

Inizia caricando una fiala di mosca fresca con mosche di età compresa tra cinque e 10 giorni. Le mosche più giovani sono più fragili, ma possono essere registrate. Seleziona la prima mosca per l'elettrofisiologia.

Le femmine grandi sono più facili da lavorare. Quando si trovano nel tubo di raccolta, sfruttare la loro tendenza intrinseca a salire verso l'alto nel puntale della pipetta e tappare il puntale più piccolo. Quindi, collegare una siringa da 100 millilitri con un tubo flessibile di plastica al puntale della pipetta, che viene allargato solo per far passare una Drosophila e collegare l'altra estremità a un grande puntale della pipetta attaccato al portamosche.

Quindi spremere un piccolo volume d'aria dalla siringa per espellere la mosca nel portamosche. Guarda attraverso lo stereomicroscopio e somministra delicatamente più aria fino a quando la testa della mosca non sporge dall'estremità conica del portamosche. Assicurati che la mosca sia saldamente intrappolata dal torace.

Quindi fissa la mosca con cera d'api. Utilizzare la temperatura più bassa dello scaldacera per sciogliere in modo pulito la cera, che apparirà trasparente. Se fa troppo caldo, la cera brucerà.

Immobilizza la testa della mosca applicando un po' di cera d'api sulla proboscide e sull'angolo dell'occhio destro, evitando la cornea. Fissa questi due punti al portamosche. Completa rapidamente questo passaggio per evitare di bruciare la mosca.

Quindi, indossa gli occhiali e fabbrica un microcoltello. Clamp una lama di rasoio non in acciaio inossidabile con due portalama a presa piatta e rompere una piccola striscia del suo bordo affilato. Idealmente, produci un bordo affilato come un rasoio che assomigli a una guglia.

Ora, con attenzione e grande attenzione ai dettagli, usa il microcoltello per aprire alcuni ommatidi dell'occhio sinistro della mosca, ad esempio a quattro o cinque ommatidi dalla cuticola dorsale appena sopra l'equatore dell'occhio. Questo fornirà il passaggio per il microelettrodo di registrazione. Questo è piuttosto impegnativo, richiede un coltello ben fatto e deve essere appreso con la pratica.

Quindi rimuovere delicatamente il piccolo pezzo di cornea dall'apertura, esponendo la retina sottostante. Ora usando i peli fini dell'applicatore di vaselina, copri rapidamente il foro con una minuscola goccia di vaselina. La gelatina ha l'ulteriore vantaggio di ridurre la capacità intramurale della pipetta.

Evita di imbrattare l'occhio in quanto ciò offusca l'ottica. Quando si utilizza l'amplificatore per microelettrodi, essere sempre collegato a terra toccando la superficie metallica della gabbia di Faraday o del tavolo antivibrante per evitare cariche elettrostatiche. Fissare la mosca montata al palo della piattaforma di preparazione delle mosche.

Ruotare il portamosche in modo che l'occhio sinistro della mosca sia direttamente rivolto verso l'investigatore. Quindi utilizzare un micro manipolatore a piccolo corso per inserire delicatamente l'elettrodo di riferimento smussato attraverso gli ocelli della mosca nella capsula della testa. Assicurati che la mosca appaia ancora sana e muova le antenne.

La preparazione deve essere superba per meritare la registrazione da. Ora inserire il microelettrodo di registrazione affilato nell'occhio sinistro attraverso l'apertura rivestita di gelatina. Quando entra nel tessuto, la posizione della punta dell'elettrodo dovrebbe essere evidente dal suo modello di riflettanza.

La fragile punta dell'elettrodo deve essere guidata perfettamente, altrimenti si romperà, il che è molto impegnativo. A seconda del tipo di cellula da cui viene registrata, la testa della mosca dovrebbe essere orientata in modo leggermente diverso. Con gli elettrodi in posizione, accendere l'amplificatore per microelettrodi.

Quindi spegnere la fonte di luce fredda, scollegarla dalla rete e collegarla alla messa a terra centrale per ridurre al minimo il rumore elettrico indotto dal loop di terra. Quindi, regolare le guide luminose a collo d'oca in modo che il sistema di bracci Carden possa essere spostato liberamente intorno alla mosca. Quindi spegni le luci della stanza per mettere la preparazione della mosca in relativa oscurità.

Ora misura la resistenza dell'elettrodo di registrazione nell'occhio. Deve essere compreso tra 100 e 260 megaohm. A volte la punta è bloccata e può essere cancellata utilizzando le funzioni di ronzio capacitivo e impulso di corrente dell'amplificatore.

Se ciò non aiuta, usa un nuovo elettrodo. Quindi, impostare l'amplificatore su una pinza amperometrica o un ponte e azzerare la tensione tra gli elettrodi. Dopo che la mosca è stata adattata al buio per alcuni minuti, inserire la punta dell'elettrodo di registrazione nell'occhio in incrementi da 0,1 a un micron utilizzando un passo-passo piezoelettrico o ruotando delicatamente la manopola di risoluzione fine.

Ad ogni passo, stimola l'occhio con un lampo di luce da uno a 10 millisecondi. Ogni lampeggio di luce causerà un breve calo della tensione o dell'ERG. Quando la punta dell'elettrodo entra nella lamina, chiudendosi sulle LMC, l'ERG si inverte.

Quindi procedere con l'esecuzione delle misurazioni. Grazie alla non invasività, le prestazioni del segnale delle singole cellule possono essere studiate nel loro stato quasi naturale. La risposta in tensione di un fotorecettore R1-R6 alla luce fioca e brillante è stata misurata a 20 gradi Celsius.

Successivamente, un fotorecettore R1-R6 è stato confrontato con un LMC a 25 gradi Celsius. Ciascuno è stato misurato su un moscerino diverso poiché le registrazioni intracellulari da parte di due microelettrodi affilati nello stesso moscerino sono troppo difficili per essere vitali. La ripetibilità delle risposte diventa evidente quando i dati vengono sovrapposti.

I rapporti segnale/rumore nel dominio della frequenza sono stati ottenuti in quattro anni trasformando i blocchi di dati di segnale e rumore in spettro di potenza, e quindi dividendo lo spettro di potenza media del segnale per il corrispondente spettro di potenza media del rumore. Il risultato può essere estremamente sensibile ai segnali nelle migliori preparazioni. La tecnica può essere utilizzata per registrare per molte specie.

Ai moscerini Coenocia è stata somministrata la stessa stimolazione luminosa naturalistica e ripetitiva a 19 gradi Celsius. I dati sono stati presi pre e post-sinapticamente dallo stesso moscerino facendo avanzare l'elettrodo di registrazione. La dinamica più veloce della registrazione è coerente con la natura predatoria di questa specie.

Una volta masterizzata, questa tecnica consente registrazioni sempre lunghe e di alta qualità, se eseguita correttamente. Mentre si tenta questa procedura è importante rendersi conto, intendo dire che è come imparare a suonare il pianoforte. Più ti eserciti, migliori saranno i risultati che otterrai.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come gli interventi farmacologici, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il ruolo dei neuromodulatori nel modellare le risposte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiofisica per esplorare come ottimizzare le informazioni, la cattura e il trasferimento della luce, oltre alle reazioni biochimiche caustiche nel macchinario di fototrasduzione e nelle successive scienze biologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare la Drosophila per gli esperimenti intracellulari e come risvegliare le risposte neuronali dai suoi fotorecettori e interneuroni.