Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare l'applicabilità generale dell'analizzatore FRET in condizioni ottimali, quantificando il contenuto di zucchero delle bevande disponibili in commercio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del rilevamento e del monitoraggio di piccole molecole, come lo zucchero. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può monitorare in modo efficiente un segnale fresco che risponde alle piccole molecole senza costosi fluorimetri di fascia alta.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Han del nostro laboratorio. Per prima cosa, preparare il plasmide biosensore fluorescente ciano e giallo specifico per il maltosio o il saccarosio. Quindi inoculare cinque millilitri di brodo Luria con una singola colonia di DE3 E.Coli e incubare la coltura a 37 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante per 16 ore.

Quindi, metti un milliletro di coltura in un pallone contenente 100 millilitri di LB. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius in un incubatore agitante fino a quando la densità ottica a 600 nanometri è di circa 0,5. Centrifugare la coltura per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere rapidamente il pellet in 50 millilitri di acqua distillata ghiacciata e centrifugare nuovamente per 20 minuti.

Risospendere il pellet in 50 microlitri di una soluzione al 10% in volume di glicerolo e acqua distillata ghiacciata. Agitare delicatamente la miscela fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge i 100. In una cuvetta per elettroporazione ghiacciata, combinare la miscela con 10 nanogrammi di plasmide CMY.

Elettroporare la miscela. Nella cuvetta, risospendere le cellule in un milliletro di terreno SOC, quindi trasferirle in una provetta a fondo tondo da 15 millilitri. Recuperare le cellule agitando delicatamente a 37 gradi per un'ora.

Distribuire le cellule su una piastra di agar LB con 100 microgrammi per un millilitro di ampicillina. Incubare le cellule a 37 gradi per 12 ore. Utilizzando un anello, trasferire una singola colonia a 10 millilitri di LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Incubare la miscela a 37 gradi agitando per 12 ore per creare la coltura del seme. Trasferire cinque millilitri di coltura di semi a 500 millilitri di LB con ampicillina e incubare le cellule a 37 gradi in un'incubatrice agitante. Una volta che la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,5, aggiungere IPTG per ottenere una concentrazione finale di 0,5 millimolari.

Dopo aver incubato la coltura per 24 ore, centrifugare le cellule per 20 minuti. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone legante. Sonicare le cellule sul ghiaccio per 10 secondi, quindi raffreddare le cellule per 10 secondi.

Ripetere la sonicazione e il raffreddamento altre cinque volte. Centrifugare il lisato per 30 minuti. Trasferire il surnatante in un'altra provetta di raccolta.

Purificare il surnatante su una colonna di affinità NTA al nichel. Riempire un concentratore da 10.000 milliwatt con 20 millilitri del campione purificato. Centrifugare il campione per 10 minuti, quindi riempire nuovamente il concentratore con soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,8%.

Ripetere questo processo con il resto del campione in questo modo, 20 millilitri alla volta, fino a quando tutte le proteine sono state concentrate e dissalate. Conservare il biosensore FRET purificato a 80 gradi Celsius. Preparare una soluzione 0,2 micromolare di proteina biosensore CMY e PBS 0,8% come soluzione di rilevamento.

Accendere un analizzatore FRET portatile. Impostare la temperatura di analisi a 53 gradi Celsius. Quindi impostare lo strumento in modalità di calibrazione.

Riempi una cuvetta con lo 0,8% di PBS come sfondo. Preriscaldare il campione a 53 gradi Celsius nell'analizzatore, quindi impostare lo sfondo. Quindi, riempire una cuvetta con la soluzione di rilevamento.

Posizionare la cuvetta nell'analizzatore e impostare la linea di base. Sostituire la cuvetta con una contenente una soluzione di rilevamento e uno zucchero millimolare. Impostare l'intensità alla saturazione per terminare la calibrazione.

Per iniziare a preparare un campione di bevanda per l'analisi del contenuto di zucchero, utilizzando una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, centrifugare un millilitro di bevanda. Rimuovere il surnatante con una siringa da un millilitro e filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,2 micrometri. Combina 0,1 millilitri di filtrato e 0,9 millilitri di PBS allo 0,8% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Agitare delicatamente la miscela per garantire una diluizione completa. Mettere cinque microlitri del campione di bevanda diluita e 495 microlitri di soluzione di rivelazione in una cuvetta. Posizionare la cuvetta nell'analizzatore e preriscaldare il campione a 53 gradi Celsius.

Premere il pulsante di impostazione per misurare il contenuto di zucchero del campione. In questo metodo, l'efficienza FRET è misurata dal rapporto tra l'intensità di emissione della proteina fluorescente gialla e la proteina fluorescente ciano nel biosensore. La temperatura di misurazione ottimale per questi biosensori CMY è compresa tra 50 e 55 gradi Celsius, poiché la differenza nel rapporto di intensità di emissione tra una soluzione di controllo e una soluzione satura di maltosio è maggiore.

Il biosensore CMY-BII è stato utilizzato per valutare il contenuto di maltosio di tre bevande a 53 gradi. Dall'ottenimento di questo rapporto si ottiene una curva dose-risposta a varie concentrazioni di maltosio a una data temperatura. Il rapporto di emissione è correlato alla concentrazione di maltosio utilizzando i valori ottenuti durante la taratura.

I contenuti di maltosio misurati sono indicati con il contenuto totale di zucchero riportato dai produttori di bevande. La bevanda A conteneva fonti di maltosio come riso e orzo. Di conseguenza, la quantità osservata di maltosio rappresenta circa la metà del contenuto totale di zucchero riportato.

La bevanda C, una bevanda sportiva, aveva un contenuto di maltosio molto basso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare il dispositivo e i sensori FRET tra i 50 e i 55 gradi Celsius. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare molecole così piccole con un analizzatore FRET portatile su misura.