Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza
13 luglio 2016
accurata identificazione e localizzazione delle cellule epiteliali lungo il rivestimento della mucosa intestinale sono essenziali per definire diverse linee cellulari. Corretta l'imaging dei tessuti intestinali è di fondamentale importanza per l'identificazione dei pattern di espressione della proteina con la massima risoluzione. Questo studio si propone di delineare i metodi e le condizioni ottimali per i tessuti intestinali lavorazione del mouse.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di elaborare in modo efficiente lunghe sezioni di tessuto intestinale di topo per una colorazione istologica uniforme lungo la sua lunghezza. Per ottenere le sezioni intestinali ci possono essere variazioni nella colorazione lungo l'intera lunghezza dell'intestino. Ho provato a utilizzare la tecnica standard di rotolamento svizzero, ma ho scoperto che produce tessuto intestinale molto rigido e non facile da aprire.
Con alcuni esperimenti, ho trovato un metodo di fissazione rapida che utilizza sostanze chimiche meno tossiche e che consente un rotolamento molto migliore del tessuto intestinale in Svizzera. Il fissativo modificato può essere utilizzato per fissare rapidamente altri tessuti spessi. In preparazione, sopprimere l'animale di prova secondo il protocollo di testo e preparare l'impostazione chirurgica.
Per iniziare, usa una pinza da dissezione e le forbici per praticare un'incisione laterale al centro dell'addome a circa uno o due centimetri sotto la gabbia toracica a seconda delle dimensioni del topo. Quindi separare delicatamente e tagliare via la pelle per esporre i muscoli addominali. Quindi, afferra e tira su i muscoli senza trattenere o tirare l'intestino.
Quindi, praticare con cura un'incisione iniziale nei muscoli addominali e tagliarli con cura per esporre l'intestino. Ora identifica il colon e traccialo fino alla sua estremità distale dove si unisce al retto. Quindi, usando le forbici, seziona il colon il più vicino possibile all'apertura anale.
Quindi trova dove lo stomaco si unisce all'intestino tenue e usando le forbici taglia l'intestino a circa un centimetro dallo stomaco. Ora trasferisci l'intera lunghezza dell'intestino tenue libero e del colon in una capsula di Petri pulita contenente PBS. Quindi, fissa l'estremità distale del colon e srotola delicatamente l'intera lunghezza del colon, rimuovendo tutti i tessuti mesenterici attaccati.
Quindi identifica il cieco e seziona l'intestino dove il cieco si unisce al colon, isolando così il colon. Allo stesso modo, districare il resto dell'intestino tenue dai tessuti connettivi e adiposi mesenterici collegati. Quindi sezionare l'intestino tenue dove si unisce al cieco.
Il cieco può quindi essere rimosso e scartato. Ora riempi una siringa da 10 millilitri con il fissativo di Bouin modificato e inserisci un ago per la sagoma. Inserire l'ago di circa mezzo centimetro nell'apertura anteriore di un segmento intestinale.
Fissando saldamente l'ago della sonda gastrica all'interno del segmento, sciacquare lentamente il contenuto del tessuto con il fissativo. Fai attenzione, poiché troppa pressione farà scoppiare il segmento. Se l'intestino tenue sembra troppo lungo da maneggiare, potresti volerlo tagliare prima in tre segmenti uguali e sciacquare ogni segmento separatamente.
La fissazione farà diventare opaco il colore del segmento intestinale. Successivamente, usando le forbici, tagliare il segmento longitudinalmente lungo la linea mesenterica e poi sciacquare brevemente il segmento in un piatto di PBS tenendolo aperto con una pinza. Ora tagliate l'intestino tenue in tre segmenti uguali, prossimale, medio e distale, che corrispondono all'incirca al duodeno, al digiuno e all'ileo.
Macroscopicamente, non ci sono caratteristiche distintive per ogni sezione. Assicurati di fare un segno per identificare l'estremità prossimale da quella distale su ciascun segmento. Quindi posizionare un segmento con il lato lumenale rivolto verso l'alto sul coperchio di una capsula di Petri.
Sul segmento del colon, identificare il lato lumenale dalle creste che corrono per tutta la sua larghezza all'estremità prossimale. Le regioni medie e distali presentano alcune variegature che corrono longitudinalmente. Sull'intestino tenue, identificare il lato lumenale dalla superficie più ruvida che segna i villi.
L'esame microscopico mostra che i villi sono più lunghi nelle regioni prossimali di ciascun segmento, mentre le cripte del colon sono più corte nelle regioni prossimali e sono più alte nella sezione centrale. Procedere con l'arrotolamento svizzero del colon. Con il colon piatto aperto e il lato luminale rivolto verso l'alto, tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo della capsula di Petri.
Mantenendo il lato del lume rivolto verso l'alto, tenere l'estremità prossimale con la pinza e avvolgere il bordo dell'estremità prossimale attorno a uno stuzzicadenti e pizzicare saldamente il bordo avvolto contro lo stuzzicadenti. Quindi arrotolare delicatamente e lentamente il colon attorno allo stuzzicadenti per formare un rotolo svizzero. Una volta che l'intera lunghezza del colon è stata arrotolata, utilizzare un altro paio di pinze per far scorrere con cautela il rotolo in una cassetta per la lavorazione dei tessuti.
Quindi trasferire la cassetta in formalina tamponata al 10% e lasciarla incubare per una notte a temperatura ambiente. Per arrotolare un segmento di intestino tenue, aprirlo con il lato del lume rivolto verso l'alto e tirarlo con una pinza dalla sua estremità prossimale verso il bordo di un piatto. Quindi utilizzare la stessa tecnica mostrata con i due punti per fare il rotolo svizzero e fissarlo in formalina.
Utilizzando i metodi descritti, la colorazione HND per l'intestino crasso di un topo nero 6 C57 ha rivelato tutte le porzioni del colon per una valutazione istologica completa. Successivamente, il preparato è stato utilizzato per topi che esprimono EGFP guidati dal promotore LGR5 che è attivo solo nelle cripte intestinali periferiche. Questo transgene EGFP ha solo una penetranza compresa tra il 5 e il 10% circa, ma le regioni di interesse potrebbero essere facilmente trovate.
Utilizzando gli stessi topi con espressione di EGFP LGR5, KLF5 e KI67 sono stati colorati. Sono stati studiati i primi topi di controllo con espressione normale di LGR5. Le cellule EGFP positive sono contrassegnate da frecce blu e le celle EGFP negative sono contrassegnate da frecce bianche.
Quindi gli stessi transgeni sono stati espressi in un topo knockout per KLF5. La co-colorazione di KLF5 e KI67 è assente nelle cellule staminali EGFP positive, ma rimane presente nelle cripte EGFP negative. Chiaramente la qualità del preparato per la colorazione multi fluoro force è molto buona.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 15 minuti per topo se si raccolgono sia l'intestino tenue che il colon. Non dimenticare che lavorare con il fissativo di Bouin può essere estremamente pericoloso per gli occhi. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come un'adeguata protezione degli occhi.
Grazie per aver guardato e per aver dato un'occhiata ai tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'elaborazione efficiente del tessuto intestinale di topo per ottenere una colorazione istologica uniforme. Evidenzia l'importanza di metodi di fissazione adeguati per migliorare la qualità dei campioni di tessuto per l'analisi e l'acquisizione di immagini.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Istologia
- Elaborazione dei tessuti
Sfondo
- L'identificazione accurata delle cellule epiteliali è fondamentale per definire le linee cellulari.
- L'analisi mediante imaging dei tessuti intestinali richiede metodi di lavorazione ottimali.
- Possono verificarsi variazioni nella colorazione lungo l'intera lunghezza dell'intestino.
- Le tecniche standard possono produrre tessuti rigidi che complicano l'analisi.
Scopo dello studio
- Definire metodi ottimali per la lavorazione dei tessuti intestinali di topo.
- Migliorare l'uniformità della colorazione istologica.
- Sviluppare un metodo di fissazione che utilizzi sostanze chimiche meno tossiche.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di una tecnica svizzera arrotolata modificata.
- Sperimentazione di un metodo di fissazione rapida.
- Preparazione delle condizioni chirurgiche per il prelievo di tessuti.
- Applicazione del fissativo modificato su tessuti spessi.
Risultati principali
- Il metodo di fissazione modificato consente un migliore arrotolamento alla svizzera del tessuto intestinale.
- Prodotti chimici meno tossici migliorano la sicurezza del processo di fissazione.
- Una colorazione istologica uniforme può essere ottenuta con il nuovo metodo.
- La tecnica può essere adattata per altri tessuti spessi.
Conclusioni
- Tecniche di fissazione migliorate potenziano l'elaborazione dei tessuti per l'istologia.
- Metodi efficienti sono essenziali per un'analisi e un'imaging accurati.
- Ulteriori ricerche possono ampliare l'applicazione di queste tecniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una lavorazione efficiente del tessuto intestinale consente una valutazione istologica costante lungo tutta la lunghezza dell'organo, supportando l'analisi quantitativa dell'infiammazione e della tumorigenesi. La tecnica migliorata del rotolo svizzero potenzia la conservazione della morfologia tissutale, facilitando una rilevazione immunohistochimica e immunofluorescente affidabile. Questo approccio migliora l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici riducendo la variabilità nella preparazione dei campioni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'omeostasi dell'epitelio intestinale e della risposta a lesioni e rigenerazione.
- Valore operativo: Favorisce la validazione funzionale degli obiettivi attraverso una valutazione istologica migliorata di sezioni intestinali complete.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, garantendo la presenza di caratteristiche strutturali intestinali integre dopo il sezionamento.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mediante una colorazione istologica uniforme lungo tutta la lunghezza del tessuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta sistemi rilevanti per le malattie consentendo la differenziazione di caratteristiche strutturali intestinali fondamentali per misurazioni quantitative.
- Valore operativo: Migliora l'allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso un processamento robusto che utilizza metodi di rilevamento immunohistochimici e immunofluorescenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta migliorando la lavorazione dei tessuti per l'analisi istologica e supportando l'identificazione dei composti promettenti attraverso la valutazione affidabile di composti in modelli preclinici.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici consentendo la valutazione della morfologia dell'epitelio intestinale.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso output quantitativi derivanti da analisi immunohistochimiche e immunofluorescenti.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni dell'infiammazione intestinale e della tumorigenesi lungo l'intera lunghezza del tessuto.
- Ricerca Translazionale: Stabilisce un collegamento con la continuità preclinica mediante sistemi pertinenti alla malattia e allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per l'elaborazione di tessuti spessi al di là dei campioni intestinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'analisi dei tessuti intestinali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro di elaborazione dei tessuti.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui grazie a una migliore validazione degli obiettivi e alla riduzione del rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio mediante un'affidabilità migliorata dei modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in istologia e tecniche di elaborazione dei tessuti.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche per fissazione, inclusione e sezionamento.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi per un'esecuzione uniforme delle Swiss-rolling.
- Considerazioni sull'adattamento in diversi sistemi modello mediante l'uso del fissativo di Bouin modificato.
- I limiti pratici includono la manipolazione di sostanze chimiche pericolose, per le quali è necessaria un'adeguata protezione oculare.
