sottotipizzazione di Jejuni Campylobacter Ssp. doylei Isolati Utilizzando PhyloProteomics Spettrometria di Massa-based (MSPP)

L'obiettivo generale di questa procedura di spettrometria di massa, chiamata MSPP o PhyloProteomics basata sulla spettrometria di massa, è quello di sotto-tipizzare i batteri a livello di ceppo. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nei campi della microbiologia, dell'epidemiologia e dell'igiene. Ad esempio, può essere utilizzato per analizzare situazioni di epidemia visualizzando la correlazione filoprotomica.

Rispetto ad altri metodi di tipizzazione, MSPP è economico per campione e molto veloce. Le infezioni nosocomiali sono un problema di crescente importanza e speriamo che il nostro schema MSPP possa essere esteso alla tipizzazione epidemiologica di altri batteri o persino funghi. Il nostro schema MSPP fornisce informazioni sulla parentela dei ceppi, quindi per la previsione di fenotipi rilevanti, come la resistenza ai farmaci o persino la virulenza, ha senso applicarlo laddove questi fenotipi sono correlati a genotipi specifici.

Per iniziare questa procedura, preparare due provette di soluzione matrice sciogliendo 2,5 milligrammi di HCCA in 250 microlitri di una miscela di solventi organici, un isonitrile al 50%. Aggiungere insulina umana ricombinante come calibrato interno a uno di essi, quindi il 47,5% di acqua distillata doppia e il 2,5% di acido trifluoroacetico. Successivamente, spargere una quantità di colonia delle dimensioni di una capocchia di spillo del ceppo di riferimento, direttamente su una piastra bersaglio maldi.

Per determinare la massa esatta del picco di calibrazione, posizionare su microlitro di standard di prova in un altro punto. Sovrapporre ogni punto di batteri e standard con 1 microlitro di soluzione di matrice addizionata di HCCA e lasciarli cristallizzare a temperatura ambiente. Per ogni ceppo da analizzare, ripetere la preparazione dello striscio.

Sovrapporre ogni punto con 1 microlitro di soluzione di matrice HCCA addizionata e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente. In alternativa, le proteine possono essere estratte da cellule difficili da mentire. Per questo, raccogli circa 5 colonie da una coltura di piastre di agar con un ciclo di inoculazione.

Sospenderli in 300 microlitri di acqua distillata doppia in una provetta di reazione da 1,5 millilitri e mescolarli accuratamente mediante pipettaggio ripetuto fino a quando le colonie batteriche non sono completamente sospese. Quindi aggiungere 900 microlitri di etanolo assoluto e mescolare. Centrifugare il campione a 13.000 g per 1 minuto.

Dopo aver essiccato il pellet, rimetterlo in sospensione pipettandolo su e giù in 50 microlitri di acido formico al 70%. Quindi, aggiungere 50 microlitri di acetonitrile e mescolare. Rimuovere i detriti mediante centrifugazione a 13.000 g per 2 minuti.

Al termine, trasferire 1 microlitro del soprannominato su una posizione campione su una piastra target maldi. Dopo aver lasciato asciugare il campione, sovrapporre ogni punto con un microlitro di soluzione di matrice HCCA e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente. A questo punto, eseguire l'analisi MALDI-TOF raccogliendo 600 spettri in 100 passi di scatto per ogni punto.

Innanzitutto, fai clic sulla scheda di esecuzione automatica nel software di configurazione dello spettrometro di massa. Apri il metodo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante del metodo e scegliendo il metodo dal menu a discesa. Quindi, fai clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante di modifica per aprire l'editor del metodo di esecuzione automatica.

Nella scheda Accumulo, imposta il valore di tiro soddisfacente su 100 e il valore di somma su 600. Per ogni spettro, scegli il picco del calibrante dall'elenco, fai clic su Assegna automaticamente'e premi OK'Dopo aver ottenuto gli spettri di massa da ciascun punto, determina sperimentalmente la massa esatta del picco di calibrazione, aprendo uno spettro con il browser dello spettro e trovando il picco alla massa prevista rispetto a uno spettro senza calibratore. Verificare che il picco calibrante non sia oscurato da nessun altro biomarcatore dell'organismo di interesse.

Dai dati di sequenziamento del genoma del ceppo di riferimento, calcolare il peso molecolare teorico monoisotopico di ciascuna delle proteine codificate traducendo la sequenza di DNA nella corrispondente sequenza di amminoacidi. Carica il file o copia incolla questa sequenza proteica nella casella di input del pannello di risorse bioinformatiche appropriato e calcola il punto isoelettrico teorico e il peso molecolare. Copia i risultati in un foglio di calcolo con una colonna contenente l'identificatore del gene e un'altra colonna il peso molecolare.

Ordina le file in base al peso molecolare calcolato, per facilitare la ricerca delle masse. Inserisci una colonna aggiuntiva nel foglio di calcolo per il peso molecolare della forma dematinata, sottraendo 135 dautoni dal peso molecolare monoisotopico. Assegna ogni massa del biomarcatore principale misurata alle masse calcolate dal ceppo di riferimento, cercando la massa misurata dalla tabella del genoma.

In un altro foglio di calcolo, registrare la massa e l'identificatore per ogni ione biomarcatore. Ora calibrare gli spettri di massa ottenuti dagli isolati di raccolta come fatto per il ceppo di riferimento. Per un isolato per riga, identificare i biomarcatori varianti negli spettri di massa, registrare la massa misurata per ciascun biomarcatore e l'isoforma prevista nelle rispettive colonne.

Lo spettro di massa MALDI-TOF della sottospecie C-Jejuni doylei ATCC 49349 contiene 14 ioni biomarcatori caricati singolarmente che potrebbero essere identificati confrontando le masse molecolari calcolate con lo spettro di riferimento. All'interno della raccolta, sono state rilevate diverse forme iso per L32 senza metionina, L33 e l'ipotetica proteina codificata da gil152939117, S20 M e S15 M. Le masse rimanenti assegnate agli ioni biomarcatori erano invariabili negli isolati testati. La sostituzione aminoacidica corrispondente allo spostamento di massa è stata identificata mediante amplificazione PCR e sequenziamento sanger del particolare gene utilizzando i primer qui elencati.

Qui sono indicate le sequenze amminoacidiche di tutti gli ioni biomarcatori inclusi nello schema MSPP, nonché le isoforme aleliche rilevate. Il dendrogramma UPGMA basato su MLST costruito con la sottospecie di doylei esaminata da C. jejuni, mostra che ogni isolato appartiene a un diverso tipo di sequenza MLST. E il ceppo LMG7790 ha la distanza filogenetica più lunga.

Come si è visto con l'MLST alaysis, l'isolato LMG7790 ha la distanza filoprodeomica più lunga nell'analisi MSPP della sottospecie esaminata C jejuni doylei isolati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno se viene eseguita correttamente. Mentre si segue questa procedura, è importante ricordare la tossicità di alcune sostanze utilizzate durante l'esperimento.

Ad esempio, l'acetonitrile può causare irritazioni cutanee. Inoltre, per l'MSPP possono essere eseguiti altri metodi, come il sequenziamento del DNA, per analizzare ulteriori parametri, come la presenza di geni di resistenza. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la fotogenesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come funziona MSPP e di come può essere applicato a domande specifiche. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni violenti può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come l'attrezzatura di laboratorio S2.