sottotipizzazione di

L'obiettivo generale di questa procedura spettrometrica di massa, chiamata MSPP o PhyloProteomica basata sulla Spettrometria di Massa, è sottotipizzare i batteri a livello di ceppo. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nei campi della Microbiologia, dell'Epidemiologia e dell'Igiene. Ad esempio, può essere impiegato per analizzare situazioni di focolaio, visualizzando la relazione filoproteomica.

Rispetto ad altri metodi di tipizzazione, la MSPP è economica per campione ed estremamente rapida. Le infezioni nosocomiali rappresentano un problema di crescente importanza, e speriamo che il nostro schema MSPP possa essere esteso alla tipizzazione epidemiologica di altri batteri, o addirittura di funghi. Il nostro schema MSPP fornisce informazioni sul grado di parentela tra ceppi; pertanto, per la previsione di fenotipi rilevanti, come la resistenza ai farmaci o addirittura la virulenza, ha senso applicarlo nei casi in cui tali fenotipi si correlano con specifici genotipi.

Per iniziare questa procedura, preparare due provette di soluzione matrice sciogliendo 2,5 milligrammi di HCCA in 250 microlitri di una miscela di solvente organico, al 50% di isonitrile. Aggiungere l'insulina umana ricombinante come calibrante interno a una di esse, quindi il 47,5% di acqua doppio-distillata e il 2,5% di acido trifluoroacetico. Successivamente, spargere una quantità delle dimensioni di una capocchia di spillo di una colonia dal ceppo di riferimento direttamente su una piastra target MALDI.

Per la determinazione della massa esatta del picco di calibrazione, applicare un microlitro di standard di prova su un'altra posizione. Sovrapporre a ciascun punto di batteri e standard 1 microlitro di soluzione di matrice HCCA arricchita e lasciar cristallizzare a temperatura ambiente. Per ogni ceppo da analizzare, ripetere la preparazione dello striscio.

Coprare ogni spot con 1 microlitro di soluzione di matrice HCCA arricchita e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente. In alternativa, le proteine possono essere estratte da cellule difficili da lisare. A tale scopo, raccogliere circa 5 colonie da una coltura su piastra di Agar con un’ansa di inoculo.

Sospendere i campioni in 300 microlitri di acqua bidistillata in un tubo da reazione da 1,5 millilitri e mescolare accuratamente mediante pipettaggio ripetuto finché le colonie batteriche non sono completamente sospese. Aggiungere quindi 900 microlitri di etanolo assoluto e mescolare. Centrifugare il campione a 13.000 g per 1 minuto.

Dopo aver essiccato il pellet, ri-sospendilo aspirando e dispensando su e giù in 50 microlitri di acido formico al 70%. Quindi, aggiungi 50 microlitri di acetonitrile e mescola. Rimuovi i detriti mediante centrifugazione a 13.000 ×g per 2 minuti.

Una volta terminato, trasferire 1 microlitro del soprannominato su una posizione del campione su una piastra target per MALDI. Dopo aver lasciato asciugare il campione, ricoprire ogni spot con un microlitro di soluzione della matrice HCCA e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente. A questo punto, eseguire l'analisi MALDI-TOF raccogliendo 600 spettri in passi di 100 colpi per ogni spot.

Prima di tutto, fare clic sulla scheda di esecuzione automatica nel software di configurazione dello spettrometro di massa. Aprire il metodo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante del metodo e scegliendo il metodo dal menu a discesa. Successivamente, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul pulsante di modifica per aprire l'editor del metodo di esecuzione automatica.

Nella scheda Accumulo, impostare il valore di scatto soddisfacente a 100 e il valore di somma a 600. Per ogni spettro, scegliere il picco del calibrante dall'elenco, fare clic su "Assegna automaticamente" e premere OK. Dopo aver ottenuto gli spettri di massa da ogni punto, determinare sperimentalmente la massa esatta del picco di calibrazione, aprendo uno spettro con il visualizzatore di spettri e individuando il picco alla massa prevista, confrontandolo con uno spettro privo di calibrante. Verificare che il picco del calibrante non sia oscurato da alcun altro biomarcatore dell'organismo di interesse.

Dati ottenuti dal sequenziamento del genoma del ceppo di riferimento, calcolare il peso molecolare monoisotopico teorico di ciascuna delle proteine codificate traducendo la sequenza di DNA nella corrispondente sequenza di amminoacidi. Caricare il file o copiare e incollare questa sequenza proteica nella casella di input del pannello della risorsa bioinformatica appropriata, quindi calcolare il punto isoelettrico teorico e il peso molecolare. Copiare i risultati in un foglio di calcolo con una colonna contenente l'identificatore del gene e un'altra colonna contenente il peso molecolare.

Ordinare le righe in base al peso molecolare calcolato, per facilitare la ricerca delle masse. Inserire una colonna aggiuntiva nel foglio di calcolo per il peso molecolare della forma dematinata, sottraendo 135 dalton dal peso molecolare monoisotopico. Assegnare ogni massa del biomarcatore misurata a quelle calcolate del ceppo di riferimento, ricercando la massa misurata nella tabella del genoma.

In un altro foglio di calcolo, registrare la massa e l'identificatore per ciascun ione biomarcatore. Calibrare ora gli spettri di massa ottenuti dagli isolati raccolti come fatto per il ceppo di riferimento. Per ogni isolato riportato in una riga, identificare i biomarcatori varianti negli spettri di massa, registrare la massa misurata per ciascun biomarcatore e l'isoforma prevista nelle rispettive colonne.

Lo spettro di massa MALDI-TOF di C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 contiene 14 ioni biomarcatori singolarmente carichi che sono stati identificati confrontando le masse molecolari calcolate con lo spettro di riferimento. All'interno della collezione, sono state rilevate forme iso diverse per L32 senza metionina, L33 e la proteina ipotetica codificata da gil152939117, S20 M e S15 M. Le masse rimanenti assegnate agli ioni biomarcatori sono risultate invariabili negli isolati testati. La sostituzione dell'amminoacido corrispondente allo spostamento di massa è stata identificata mediante amplificazione PCR e sequenziamento Sanger del gene specifico, utilizzando i primer elencati qui.

Le sequenze aminoacidiche di tutti gli ioni biomarcatori inclusi nel protocollo MSPP, così come le isoforme alleliche rilevate, sono indicate qui. Il dendrogramma UPGMA basato sull'MLST, costruito a partire dagli isolati esaminati di C jejuni subspecies doylei, mostra che ciascun isolato appartiene a un diverso tipo di sequenza MLST. E il ceppo LMG7790 presenta la maggiore distanza filogenetica.

Come osservato con l'analisi MLST, il ceppo isolato LMG7790 presenta la maggiore distanza filoproteomica nell'analisi MSPP dei ceppi isolati di C jejuni subspecies doylei esaminati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro un giorno se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare la tossicità di alcune sostanze utilizzate nell'esperimento.

Ad esempio, l'acetonitrile può causare irritazione cutanea. Inoltre, oltre alla MSPP, possono essere eseguiti altri metodi come il sequenziamento del DNA per analizzare ulteriori parametri, come la presenza di geni di resistenza. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la fotogenesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del funzionamento della MSPP e di come possa essere applicata a domande specifiche. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni pericolosi può essere estremamente rischioso e che è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di attrezzature da laboratorio di livello S2.