Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di modellare l'arteriopatia periferica umana mediante il posizionamento di suture o costrittori ameroidi sull'arteria femorale del topo per l'induzione di ischemia acuta o subacuta degli arti posteriori, rispettivamente. L'arteriopatia periferica è un problema clinico importante e queste tecniche che utilizzano modelli animali sono state sviluppate per rappresentare meglio la malattia umana. Il vantaggio principale di queste tecniche è che la gravità e la tempistica dell'insorgenza dell'ischemia degli arti possono essere controllate dallo sperimentatore.

A dimostrare la procedura sarà Mike Padgett, un tecnico del mio laboratorio. Uno o due giorni prima della procedura, confermare che il topo è completamente sedato per mancanza di risposta al pizzico delle dita dei piedi e applicare un unguento per gli occhi. Quindi, usa un piccolo rifinitore elettrico per radere i peli da entrambi gli arti posteriori.

Quando tutti i peli sono stati tagliati, applicare una crema depilatoria preriscaldata. Dopo un minuto, rimuovere delicatamente la crema con una garza inumidita. Quindi posizionare il topo in una gabbia di recupero vuota foderata di carta assorbente fino a quando non è in grado di mantenere la decubito sternale.

Il giorno dell'intervento, posizionare il topo completamente sedato sotto un microscopio da dissezione stereo tecnica in posizione supina e fissare entrambe le gambe con nastro chirurgico. Se si utilizza un termoforo a temperatura controllata, collegare la sonda di temperatura e fissare la sonda alla base della piattaforma chirurgica con del nastro chirurgico. Quindi, utilizzare tre salviette alternate di iodio povidone e alcol per pulire il sito chirurgico e coprire l'animale con un telo chirurgico sterile con un foro nel sito dell'incisione.

Usando un bisturi, praticare un'incisione iniziale lungo il centro della coscia mediale dal ginocchio verso l'addome. Quindi utilizzare le forbici sottili per allungare l'incisione a circa un centimetro. Usando una pinza, apri l'incisione per esporre la membrana che copre il tessuto adiposo inguinale.

Quindi usa una pinza chiusa per perforare la membrana, nello spazio tra il tessuto adiposo e l'addome. Rilasciare delicatamente la pressione sulla pinza per separare il tessuto adiposo dai muscoli addominali, esponendo il fascio neurovascolare. È fondamentale che i principali vasi sanguigni e i loro rami siano correttamente identificati prima della dissezione del fascio neurovascolare.

Variazioni nella posizione dei costrittori o nei siti di legatura possono alterare significativamente la gravità dell'ischemia e portare a una sostanziale variabilità negli esiti. Inserire un divaricatore nell'incisione e tirare il tessuto addominale verso la testa dell'animale per esporre il sito del costrittore ameroide prossimale, che è appena prossimale all'arteria femorale circonflessa laterale. Quindi inserire un divaricatore mediale e uno laterale nella parte distale dell'incisione per allargare il campo chirurgico, tirando il tessuto adiposo inguinale verso il piede e lontano dal sito chirurgico.

I rami caudali prossimali e superficiali dell'arteria femorale devono essere facilmente osservati. L'arteria femorale circonflessa laterale si trova a circa cinque millimetri prossimalmente ai rami caudali e può essere oscurata da una membrana. Ora fai scorrere delicatamente la punta di una pinza sotto la membrana che lega insieme i vasi per inserire 1/2 della punta tra la vena e l'arteria.

Poi si impossessa del forcipe e strappa via delicatamente la membrana. Quando tutta la membrana è stata rimossa, inserire la punta della pinza chiusa tra la vena e l'arteria e rilasciare la pressione sulla pinza per creare uno spazio tra i vasi. Per l'ischemia subacuta degli arti, far scorrere la punta della pinza sotto l'arteria femorale per isolare il vaso dal fascio neurovascolare.

Utilizzare una seconda serie di pinze angolate per afferrare il bordo del costrittore e guidare il costrittore sotto l'arteria femorale. Quindi adagiare l'arteria nella fessura del costrittore. Quindi, posizionare il costrittore distale sull'arteria femorale immediatamente prossimale al punto in cui l'arteria si biforca nelle arterie poplitea e safena e posizionare l'arteria femorale nella fessura del costrittore.

Per l'ischemia acuta degli arti, infilare una sutura 7-0 sotto l'arteria nella stessa posizione del costrittore prossimale e legare l'arteria. Quindi legare una seconda legatura a circa un millimetro distale alla prima e utilizzare le forbici a molla per sezionare l'arteria tra le due legature. Per la transezione arteriosa distale, posizionare le legature a circa un millimetro di distanza, appena prossimalmente al punto in cui l'arteria femorale si biforca nelle arterie poplitea e safena.

Quindi chiudere l'incisione con suture vicryl cinque-0 interrotte e spostare il mouse su un termoforo a 37 gradi Celsius sotto un imager di perfusione laser doppler. Ora accendi l'imager e avvia il software di acquisizione delle immagini. Fare clic sull'icona Nuova immagine singola per aprire la finestra di configurazione dello scanner e impostare la dimensione di scansione su grande e la velocità di scansione su quattro millisecondi per pixel.

Modificare i valori X e Y nel pannello Unità area di scansione con i valori appropriati, quindi fare clic sulla scheda Video e distanza e disporre entrambi gli arti posteriori all'interno dell'area di scansione. Fare clic su Distanza automatica, quindi fare clic su Avanti per aprire la finestra Dettagli soggetto e immettere le informazioni sull'oggetto. Fare clic su Avanti per passare alla finestra di scansione.

Quindi fare clic sul pulsante Avvia misurazione per aprire la finestra di dialogo Conferma o Ignora distanza di scansione e fare clic su OK per iniziare il processo di scansione. Al termine della scansione, spostare il mouse in una gabbia di recupero vuota con monitoraggio fino a quando non è completamente recuperato. Oltre alle variazioni inerenti agli studi sugli animali, altri fattori possono introdurre variabilità all'interno dell'imaging di perfusione laser doppler, tra cui la temperatura corporea e la posizione dell'animale.

Il modello di ischemia subacuta degli arti posteriori dipende dalla qualità dei costrittori ameroidi, che può variare notevolmente all'interno di un determinato lotto. L'imaging di perfusione laser doppler deve essere eseguito immediatamente dopo la procedura mentre l'animale è ancora anestetizzato per dimostrare gli effetti dell'intervento chirurgico e per stabilire un livello di perfusione post-operatorio di base. Una perdita completa della perfusione degli arti posteriori dovrebbe essere osservata dopo l'induzione dell'ischemia acuta degli arti, mentre solo una lieve diminuzione della perfusione si osserva tipicamente dopo il posizionamento del costrittore ameroide nel modello subacuto.

Queste procedure consentono di esplorare gli effetti di vari gradi di ischemia sul rimodellamento vascolare e sulla rigenerazione del muscolo scheletrico nel topo come modello di arteriopatia periferica umana. Una volta padroneggiate, queste procedure possono essere completate in circa 15 minuti se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questi interventi chirurgici, è importante ricordare di monitorare continuamente la temperatura corporea e l'adeguatezza dell'anestesia nell'animale.

Regolando il posizionamento delle legature o dei costrittori, è possibile modificare la gravità della lesione ischemica, che può essere una variabile importante a seconda del background genetico dell'animale o della presenza di fattori di rischio cardiovascolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'ischemia degli arti posteriori sia acuta che subacuta nel topo e di definire l'anatomia vascolare per garantire un risultato corretto e la riproducibilità della procedura.