Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

L'obiettivo generale di questo protocollo è modellare la malattia arteriosa periferica umana mediante il posizionamento di punti di sutura o constrictori ameroidi sull'arteria femorale del topo per indurre rispettivamente un'ischemia acuta o subacuta dell'arto posteriore. La malattia arteriosa periferica rappresenta un importante problema clinico, e queste tecniche che utilizzano modelli animali sono state sviluppate per rappresentare in modo più accurato la patologia umana. Il vantaggio principale di queste tecniche è che la gravità e il momento d'insorgenza dell'ischemia dell'arto possono essere controllati dal ricercatore.

La procedura sarà dimostrata da Mike Padgett, un tecnico del mio laboratorio. Uno o due giorni prima della procedura, verificare che il topo sia completamente sedato mediante l'assenza di risposta alla pinzatura delle dita dei piedi ed applicare un unguento oftalmico. Successivamente, utilizzare un piccolo rasoio elettrico per rasare il pelo da entrambi gli arti posteriori.

Dopo aver tagliato tutti i peli, applicare una crema depilatoria preriscaldata. Dopo un minuto, rimuovere delicatamente la crema con un pad di garza inumidita. Quindi posizionare il topo in una gabbia di recupero vuota, foderata con carta assorbente, fino a quando non sarà in grado di mantenere una decubito sternale.

Nel giorno dell'intervento chirurgico, posizionare il topo completamente sedato sotto un microscopio stereoscopico per dissezione tecnica in posizione supina e fissare entrambe le zampe con nastro chirurgico. Se si utilizza un tappetino riscaldante con controllo della temperatura, collegare la sonda termica e fissarla alla base della piattaforma chirurgica con nastro chirurgico. Successivamente, utilizzare tre passate alternate di soluzione di iodopovidone e alcol per pulire il sito chirurgico e coprire l'animale con un campo sterile chirurgico dotato di un foro nel punto di incisione.

Utilizzando un bisturi, effettuare un'incisione iniziale lungo il centro della coscia mediale, partendo dal ginocchio in direzione dell'addome. Successivamente, utilizzare forbici fini per allungare l'incisione fino a circa un centimetro. Con l'aiuto di una pinza, aprire l'incisione per esporre la membrana che ricopre il tessuto adiposo inguinale.

Quindi utilizzare pinze chiuse per forare la membrana, penetrando nello spazio tra il tessuto adiposo e l'addome. Rilasciare delicatamente la pressione sulle pinze per separare il tessuto adiposo dai muscoli addominali, esponendo il fascio neurovascolare. È fondamentale che i vasi sanguigni principali e le loro diramazioni vengano correttamente identificati prima della dissezione del fascio neurovascolare.

Le variazioni nella posizione dei costrittori o nei siti di legatura possono alterare significativamente la gravità dell'ischemia e portare a una notevole variabilità nei risultati. Inserire un retrattore nell'incisione e tirare il tessuto addominale verso la testa dell'animale per esporre il sito prossimale del costrittore ameroidio, che si trova appena prossimale all'arteria femorale circonflessa laterale. Successivamente, inserire un retrattore mediale e uno laterale nella parte distale dell'incisione per ampliare il campo operatorio, tirando il tessuto adiposo inguinale verso il piede e lontano dal sito chirurgico.

I rami prossimali e superficiali caudali dell'arteria femorale dovrebbero essere facilmente osservabili. L'arteria circonflessa laterale femorale si trova circa cinque millimetri prossimalmente ai rami caudali e potrebbe essere oscurata da membrana. Ora far scivolare delicatamente la punta di una pinzetta sotto la membrana che unisce i vasi per inserire metà della punta tra la vena e l'arteria.

Quindi chiudere la pinza ed estrarre delicatamente la membrana. Quando tutta la membrana è stata rimossa, inserire la punta della pinza chiusa tra la vena e l'arteria, quindi rilasciare la pressione sulla pinza per creare un'apertura tra i vasi. Per l'ischemia acuta degli arti, far scivolare la punta della pinza sotto l'arteria femorale per isolare il vaso dal fascio neurovascolare.

Utilizzare un secondo paio di pinze angolate per afferrare il bordo del costrittore e guidare il costrittore sotto l'arteria femorale. Successivamente, posizionare l'arteria nella fessura del costrittore. Quindi, posizionare il costrittore distale sull'arteria femorale immediatamente a monte del punto in cui l'arteria si biforca nelle arterie poplitea e safena, e inserire l'arteria femorale nella fessura del costrittore.

Per l'ischemia acuta degli arti, passare un filo di sutura 7-0 sotto l'arteria nella stessa posizione del costrittore prossimale e legare l'arteria. Quindi effettuare un secondo legatura circa un millimetro in posizione distale rispetto alla prima e sezionare l'arteria tra le due legature utilizzando forbici a molla. Per la sezione arteriosa distale, posizionare le legature a circa un millimetro di distanza l'una dall'altra, appena in posizione prossimale rispetto al punto in cui l'arteria femorale si biforca nelle arterie poplitea e safena.

Quindi chiudere l'incisione con punti di sutura in vicryl interrotti da cinque-zero e spostare il topo su un tappetino riscaldante a 37 gradi Celsius posizionato sotto un immaginatore di perfusione laser doppler. Accendere ora l'immaginatore ed avviare il software di acquisizione delle immagini. Fare clic sull'icona Nuova Immagine Singola per aprire la finestra di configurazione dello scanner e impostare la dimensione della scansione su grande e la velocità di scansione a quattro millisecondi per pixel.

Modificare i valori di X e Y nel pannello delle unità Area di scansione con i valori appropriati, quindi fare clic sulla scheda Video e Distanza e posizionare entrambi gli arti posteriori all'interno dell'area di scansione. Fare clic su Distanza automatica, quindi su Avanti per aprire la finestra Dettagli soggetto ed inserire le informazioni relative al soggetto. Fare clic su Avanti per passare alla finestra di scansione.

Quindi fare clic sul pulsante Avvia misurazione per aprire la finestra di dialogo Conferma o sovrascrivi distanza di scansione e fare clic su OK per iniziare il processo di scansione. Al termine della scansione, spostare il mouse in una gabbia di recupero vuota con monitoraggio fino al completo recupero. Oltre alle variazioni intrinseche negli studi sugli animali, altri fattori possono introdurre variabilità nell'imaging della perfusione mediante laser doppler, inclusa la temperatura corporea e la posizione dell'animale.

Il modello di ischemia degli arti posteriori subacuta dipende dalla qualità dei costrittori a meroidi, che può variare notevolmente all'interno di un singolo lotto. L'imaging della perfusione mediante laser doppler deve essere eseguito immediatamente dopo l'intervento, mentre l'animale è ancora sotto anestesia, per dimostrare gli effetti dell'intervento chirurgico e stabilire un livello di base della perfusione nel periodo postoperatorio. Una perdita completa della perfusione dell'arto posteriore deve essere osservata dopo l'induzione di ischemia acuta, mentre una diminuzione lieve della perfusione è tipicamente osservata dopo il posizionamento del costrittore a meroidi nel modello subacuto.

Queste procedure permettono di esplorare gli effetti di diversi gradi di ischemia sul rimodellamento vascolare e sulla rigenerazione del muscolo scheletrico nel topo, come modello della malattia arteriosa periferica umana. Una volta acquisite, queste procedure possono essere completate in circa 15 minuti se eseguite correttamente. Durante l'esecuzione di questi interventi chirurgici, è importante ricordare di monitorare continuamente la temperatura corporea e l'adeguatezza dell'anestesia nell'animale.

Modificando la posizione dei legami o dei costrittori, è possibile regolare la gravità della lesione ischemica, un parametro importante che può variare in base al background genetico dell'animale o alla presenza di fattori di rischio cardiovascolari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come indurre sia l'ischemia acuta che subacuta dell'arto posteriore nel topo, nonché di come definire l'anatomia vascolare per garantire un esito corretto e la riproducibilità della procedura.