Name: Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Scopri come generare un fegato umanizzato nel topo mediante trapianto di cellule staminali epatiche umane immature. Questo metodo permette di studiare il metabolismo umano dei farmaci e le malattie epatiche.

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Desideriamo ringraziare il Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, per aver fornito i topi. Ringraziamo anche S. Aoyama e Y. Adachi dell'ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Institute, Sekisui Medical Company Ltd., Giappone, e K. Kozakai e Y. Yamada per l'assistenza con l'analisi LC-MS/MS. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT), dal Giappone a Y-W.Z. (18591421, 20591531 e 23591872); dal progetto innovativo e imprenditoriale Jiangsu per l'introduzione di talenti di alto livello e dal progetto di pianificazione scientifica e tecnologica Jiangsu (BE2015669); e da sovvenzioni a H.T. per la promozione strategica della ricerca e dello sviluppo innovativi (S-innovation, 62890004) dall'Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia.

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida protezione degli animali di Yokohama City University. 1. generazione del modello Acute Liver Injury mouse <ol><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di NaCl 0,85% fenicato (0,6 g di fenolo in 100 ml di soluzione 0,85% di NaCl) a 1 mg tossina difterica (DT) per fare un / ml di soluzione DT 1 mg. Nota: DT ad una concentrazione di 1 mg / ml può essere conservato per circa 2 anni 3 ° C e 8 ° C. </li><li> In serie diluire la soluzione 1 mg / ml DT stock da 0,3 mg / ml in DT 0,85% soluzione fenicato NaCl e preparare una aliquota della soluzione DT / ml 0,3 mg come soluzione di lavoro. Nota: Questa soluzione di lavoro deve essere preparata. </li><li> Per condurre esperimenti utilizzando una dose subletale (~ 50% di mortalità), amministrare 8 settimane di età topi una dose / kg 1,5 mg di DT. <ol><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale di DT Tenendo premuto il mouse in decubito dorsale e inserire il needle sotto la curva del ginocchio, a sinistra oa destra della linea mediana. Evitare la linea mediana per impedire la penetrazione della vescica. Angolo l&#39;ago di circa 45 ° rispetto al corpo. </li><li> Utilizzando una siringa da insulina, iniettare i topi con 100 ml di appena preparato 0,3 mcg / ml DT per 20 g di peso mouse. Ad esempio, un 18-g mouse dovrebbe ricevere 90 microlitri della soluzione DT / ml 0,3 mg. </li></ol></li><li> A iniezione alberino DT 48 hr, raccogliere il sangue dalla vena della coda posizionando il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e riscaldando la coda di topo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per circa 10 minuti per dilatare i vasi sanguigni. Poi, fare un 1 mm nick nella coda due centimetri dalla punta con una lama di bisturi tagliente e raccogliere il sangue con un microcapillare. <ol><li> Centrifugare la microcapillare contenente il sangue a 1500 xg per 5 minuti e raccogliere il siero separando il surnatante e cellule pellet. </li></ol></li><li> Pipettare 50 ml di siero di topo 1:20 diluito Onto GOT / AST-PIII scivola. Misurare l&#39;assorbanza del prodotto di reazione (colorante blu) a 650 nm utilizzando un multi-purpose analizzatore automatico di chimica a secco secondo il protocollo del produttore. NOTA: Il read-out di aspartato aminotransferasi (AST) / glutammico attività transaminasi ossalacetica (GOT) viene visualizzato automaticamente. 2 giorni dopo l&#39;iniezione DT, circa il 60% dei topi esposti valori AST tra 12.000 - 16.000 IU / L e sono stati considerati di essere affetti da danni al fegato acuto. Questi topi sono stati trasferiti ad una nuova gabbia e utilizzati come trapianto di cellule. </li></ol> 2. Preparazione di epatici umani cellule staminali <ol><li> Isolare le cellule staminali epatiche umane da cellule di fegato umano primario fetale con un cell sorter utilizzando gli antigeni cellulari CDCP1, CD90, CD66 e di ottenere una sottopopolazione CDCP1 + CD90 + CD66-, poi seminare la popolazione di cellule isolato su piatti della cultura collagene IV-rivestiti, come riportato in precedenza 15. Uso primario cellule epatiche fetali umane di un embrioneetà tra le settimane 14 e 18. </li><li> Raccogliere le cellule staminali epatiche umane in coltura al 80% - 90% di confluenza su piastre di coltura da 100 mm, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 10 ml di PBS, e quindi rimuovere il PBS. Trypsinize le cellule con soluzione di tripsina / EDTA 2 ml 0,05% per 5 min a 37 ° C. Nota: Le celle a maggiore del 90% di confluenza non sono adatti per il trapianto di cellule dal differenziamento cellulare può influenzare la loro capacità proliferativa nei topi. </li><li> Monitorare lo stato di dispersione di cellule al microscopio. Quando le cellule sembrano essere flottante o scorre liberamente, fermare la digestione enzimatica aggiungendo 8 ml di DMEM / F12 contenente 10% FBS. </li><li> Sospendere le cellule lentamente utilizzando una pipetta sierologica 10 ml e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le cellule per 5 min a 100 xg e 4 ° C. </li><li> risospendere delicatamente il pellet cellulare in 10 ml DMEM / F12 contenente il 10% FBS e determinare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio microscopio. </li><li>Dividere le cellule in 1,0 x 10 6 cellule per 50 ml di PBS aliquote per ogni singolo mouse e memorizzare in ghiaccio fino trapianto. </li></ol> 3. intrasplenico Il trapianto di cellule staminali epatiche umane <ol><li> Posizionare una gabbia pulita su una C rilievo di riscaldamento elettrico 37 °. </li><li> Anestetizzare il mouse con isoflurano inalazione (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 L di ossigeno per min) ponendolo sotto l&#39;ugello. In alternativa, utilizzare provette contenenti garza imbevuta con isoflurano. <ol><li> Assicurarsi che il mouse è anestetizzato con una leggera pizzicando la zampa posteriore. Se un coglione ginocchio è suscitato, posizionare il mouse di nuovo nella camera. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li></ol></li><li> Shave il sito chirurgico utilizzando cesoie elettriche e applicare il 70% (/ vol vol) di etanolo e iodopovidone per sterilizzare. Poi fare un 1-cm incisione cutanea nel fianco sinistro appena sotto il bordo costiera delle nervature, seguita da un&#39;incisionela parete addominale, così come il peritoneo. </li><li> esporre con cura la milza. Utilizzare una siringa microiniezione da 100 ml con una 32-ago G 1/2-inch per iniettare direttamente 1,0 x 10 6 cellule staminali epatiche umane in 50 microlitri di PBS nella milza di ogni mouse. Inclinare l&#39;ago con un angolo di 5 ° per l&#39;iniezione. <ol><li> Assicurarsi che la profondità di iniezione è inferiore alla metà dello spessore della milza. L&#39;ago deve entrare milza ad una estremità (testa) e depositare le cellule all&#39;altra estremità (coda). </li></ol></li><li> Per evitare perdite delle cellule dopo l&#39;iniezione, applicare delicatamente pressione con un dito per 2 minuti e poi rimuovere l&#39;ago. </li><li> Posizionare la milza nuovamente dentro il corpo del mouse e chiudere la cavità con un normale sutura continua per la muscolatura e la pelle. </li><li> Trasferire i topi in una gabbia di 37 ° C pre-riscaldato subito dopo il trapianto. Per assicurare il mouse è in grado di respirare comodamente, posizionare il mouse sul lato nella gabbia, uninvalidare contatto tra la biancheria gabbia e il sito chirurgico. </li><li> Monitorare i topi fino a quando l&#39;anestesia svanisce per garantire le suture rimangono chiusi e topi tornare al pre-chirurgia condizioni. </li><li> Assicurarsi che i topi sono dotati di normale acqua potabile e cibo. Dopo 1 ora, tornare la gabbia alla stanza del mouse del centro animale e monitorare i topi al giorno. </li></ol> 4. Individuazione di trapiantati epatici umani staminali epatociti derivati ​​dalle cellule del fegato di topo Nota: Per le seguenti procedure, eutanasia tutti gli animali che utilizzano una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale. <ol><li> A 4 - 6 settimane dopo il trapianto, i topi eutanasia e aprire la cavità addominale, tagliando contemporaneamente la cute e la fascia con le forbici chirurgiche. </li><li> Sezionare il tessuto connettivo sopra il peritoneo, usando le forbici come un diffusore, e tagliare il peritoneo lungo la linea alba per aprire la peritonealecavità. </li><li> Sollevare lo sterno con una pinza, forare la membrana, e tagliare ogni lato dello sterno attraverso la cintura cervicale. </li><li> Sever vena cava sul lato toracica del fegato e tirare l&#39;esofago attraverso il fegato in direzione anteriore. Rimuovere il diaframma per rimuovere il fegato. Nota: Fare attenzione a tenere le punte delle forbici puntate verso l&#39;alto al fine di prevenire eventuali danni agli organi toracici sotto. Il timo ha la tendenza ad aggrapparsi occasionalmente lato dorsale dello sterno e questo deve essere evitato con attenzione. </li><li> Usando il diaframma come maniglia, inizia a tirare il fegato fuori della cavità addominale. La vena cava interno terrà il fegato a posto. Tagliare la vena cava interno; fare attenzione a non liberare prematuramente il surrene destro. Nota: I topi hanno un fegato quadrilobata costituito da un lobo mediano, lobo sinistro, lobo destro, e il lobo caudato. La cistifellea è sospeso nella piccola biforcazione dilobo mediano. </li><li> Separare i lobi gli uni dagli altri alle giunzioni e incorporarli in mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) secondo il protocollo del produttore. Congelare personalizzazione di Office che contiene il tessuto epatico nelle griglie metalliche sulla criostato. </li><li> Tagliare le sezioni di esempio 5-micron di spessore con un criostato a -18 ° C e montarli su vetrini da microscopio RT. Conservare lo stock a -80 ° C. Preparare i vetrini per ematossilina e eosina (H &amp; E) e immunofluorescenza secondo le procedure precedentemente riportati 16. </li></ol> 5. Individuazione di Human Albumina secrezione e il calcolo del tasso chimerico <ol><li> Per misurare la ricostituzione fegato umano, eseguire albumina umana ELISA utilizzando siero e albumina umana kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Calcolare il fegato tasso chimerico umanizzato da analisi in tempo reale PCR dei livelli di espressione di tutta-umanizzato fegato. Determinare il relativo exrapporto del livello di pressione di actina specifico umano a umano-topo croce actina (rapporto 1) e il rapporto di actina specifiche mouse umano-topo croce actina (rapporto 2). Il tasso chimerico viene calcolato come rapporto 1 / (rapporto 1 + rapporto 2). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

Recenti studi hanno dimostrato che il fegato del mouse può essere ripopolata con epatociti umani, tra cui epatociti adulte e cellule staminali epatiche proliferative 17. Questi fegati ripopolati sono stati utilizzati come modelli sperimentali preclinici per i test metabolismo dei farmaci e scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo 18; Inoltre, essi hanno fornito un ambiente in vivo per la maturazione delle cellule e differenziazione 19. Il principale obiettivo di questo studio è s...

I topi sono comunemente usati per i test farmaceutici poiché la ricerca biomedica nell'uomo è limitata1; tuttavia, questi modelli non sono sempre utili poiché possono simulare in modo impreciso gli effetti osservati negli esseri umani. La maggior parte dei farmaci attualmente in uso medico viene metabolizzata principalmente nel fegato. Tuttavia, lo stesso farmaco può essere metabolizzato in diversi metaboliti nel fegato di topo e umano a causa delle differenze tra le specie. Pertanto, è spesso difficile determinare durante lo sviluppo se un potenziale farmaco presenta rischi per le applicazioni cliniche2,3. 
Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati fegati di topo "umanizzati" coltivando cellule epatiche umane all'interno di topi4-6; questi modelli mostrano risposte ai farmaci simili a quelle osservate nel fegato umano. I principali modelli murini attualmente utilizzati per la generazione di fegato umanizzato includono topi attivatori di uroplasminogeno (uPA+/+)4,7, topi fumarilacetoacetato idrolasi (Fah−/-)6 e i topi timidina chinasi (TK-NOG) recentemente riportati. 
Tuttavia, rapporti precedenti hanno dimostrato che le cellule immature umane trapiantate o le cellule staminali sono meno competitive degli epatociti umani adulti nei fegati di topo Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/-)8-10. Inoltre, i topi Fah-/- forniscono un vantaggio di crescita solo per gli epatociti differenziati e non per le cellule progenitrici epatiche immature11. Il trapianto di cellule staminali epatiche umane (HpSC) in topi TK-NOG in laboratorio non ha avuto successo. Pertanto, attualmente non esiste alcun modello murino utile per l'attecchimento efficiente di cellule epatiche umane immature. 
Così, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino Alb-TRECK/SCID che potrebbe essere ripopolato in modo efficiente con epatociti umani immaturi. Questo modello murino transgenico esprime i recettori del fattore di crescita EGF-like (HB-EGF) leganti l'eparina umana sotto il controllo di un promotore dell'albumina specifico delle cellule epatiche. Dopo la somministrazione della tossina difterica (DT), questi topi sviluppano un'epatite fulminante dovuta all'ablazione condizionale degli epatociti, consentendo la residenza e la proliferazione delle cellule del donatore12. Sebbene gli epatociti di topo siano stati trapiantati con successo in topi Alb-TRECK/SCID in studi precedenti13,14, la generazione di un fegato umanizzato utilizzando topi Alb-TRECK/SCID deve ancora essere riportata. 
In questo studio, sono stati generati fegati umanizzati in topi Alb-TRECK/SCID tramite trapianto di HpSC. Questo fegato umanizzato fornisce un ambiente in vivo per la differenziazione universale delle cellule staminali e la capacità di prevedere i modelli di metabolismo dei farmaci umani e le interazioni farmacologiche.

<table><tbody><tr><td>Albumina umana</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Topo</td></tr><tr><td>Umano CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Topo</td></tr><tr><td>Nuclei umani</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Topo</td></tr><tr><td>Umano CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Cavia</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Topo</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>559869</td><td>Topo</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>551479</td><td>Mouse</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tossina difterica</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA di albumina umana</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G 1/2" ago</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound (118 ml)</td><td>Sakura Finetek Giappone</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatrice di celle ad alta velocità MoFlo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di un umanizzato mouse fegato utilizzando epatici umani cellule staminali

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

È stato sviluppato un nuovo modello animale che coinvolge topi chimerici con fegati umanizzati stabiliti tramite trapianto di epatociti umani. Questi topi, in cui il fegato è stato ripopolato con epatociti umani funzionali, potrebbero servire come strumento utile per studiare la biologia delle cellule epatiche umane, il metabolismo dei farmaci e altre applicazioni precliniche. Uno dei fattori chiave necessari per il successo del trapianto di epatociti umani nei topi è l'eliminazione degli epatociti endogeni per prevenire la competizione con le cellule umane e fornire uno spazio e un microambiente adeguati per promuovere l'espansione e la differenziazione delle cellule del donatore umano. Ad oggi, sono stati stabiliti due modelli murini con grave danno epatico che utilizzano topi fumarilacetoacetato idrolasi (Fah) e attivatore dell'uroplasminogeno (uPA). Tuttavia, i topi Fah sono utilizzati principalmente con epatociti maturi e l'applicazione del modello uPA è limitata dalla diminuzione della riproduzione. Per superare queste limitazioni, sono stati utilizzati topi knockout cellulare mediato dal recettore dell'Alb-tossina (TRECK)/SCID per la differenziazione in vivo di epatociti umani immaturi e la generazione di fegato umanizzato. Le cellule staminali epatiche umane (HpSC) hanno ripopolato con successo il fegato di topi Alb-TRECK/SCID che avevano sviluppato un'insufficienza epatica fulminante letale dopo il trattamento con tossina difterica (DT). Questo modello di fegato umanizzato in topi Alb-TRECK/SCID avrà applicazioni funzionali in studi che coinvolgono il metabolismo dei farmaci e le interazioni farmacologiche e promuoverà altri studi in vivo e in vitro.

Alb-treck / epatociti topi SCID esprimono il recettore DT HB-EGF gene umano sotto il controllo di un promotore di albumina e mostrano effetti citotossici in seguito alla somministrazione DT 12. Per valutare gli effetti del trattamento DT sul danno epatico, DT dosi di 1,5 mcg / kg sono state iniettate in 8 settimane di età Alb-Treck / topi SCID e le alterazioni patologiche nel hr postale amministrazione DT fegato 48 sono stati valutati istologicamente. Rispetto ai topi di contr...

Qui, presentiamo un nuovo modello di fegato di topo umanizzato generato in topi knockout cellulare mediato dal recettore della tossina Alb (TRECK)/SCID a seguito del trapianto di cellule staminali epatiche umane immature ed espandibili.

Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica di trapianto di cellule staminali è generare un nuovo modello murino chimico con funzionalità epatica umana, utilizzando cellule progenitrici staminali epatiche umane immature che consentono la proliferazione, la maturazione e la differenziazione cellulare per l'acquisizione del metabolismo dei farmaci. Questo metodo fornisce uno strumento potente per creare un microambiente in grado di sostenere la progeneisi delle cellule staminali epatiche del donatore umano, permettendone l'espansione, la differenziazione e la ricostruzione del fegato del ricevente murino danneggiato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule proliferate possono maturare e che il fegato viene quasi completamente ripopolato.Per iniziare, preparare una soluzione madre di tossina difterica o DT a un milligrammo per millilitro aggiungendo un millilitro di soluzione fenolata di cloruro di sodio 0,85% a un milligrammo di DT. Eseguire un'iniezione intraperitoneale di DT tenendo un mouse scid albtrek in posizione supina e al di sotto della piega delle ginocchia a sinistra o a destra della linea mediana, inserendo l'ago a un angolo di 45 gradi rispetto al corpo. Utilizzando una siringa per insulina, iniettare 100 microlitri di una soluzione appena preparata di 0,3 microgrammi per millilitro di DT per ogni mouse da 20 grammi. A 48 ore dall'iniezione di DT, posizionare il mouse in un contenitore restrittivo e riscaldare la coda in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per circa 10 minuti per dilatare i vasi sanguigni.Quindi, a due centimetri dalla punta della coda, utilizzare una lama affilata di bisturi per praticare un piccolo taglio di un millimetro nella coda ed usare un capillare per raccogliere il sangue. Centrifugare il capillare contenente il sangue a 1500 ×g per cinque minuti e raccogliere il siero separando il soprannatante dal pellet cellulare. Pipettare 50 microlitri di un'opportuna diluizione 1:20 del siero su vetrini GOT ASTP3.Quindi, utilizzando un analizzatore automatico multifunzione a chimica secca secondo il protocollo del produttore, misurare l'assorbanza del prodotto di reazione a 650 nanometri. Utilizzando un citofluorimetro, isolare le cellule staminali epatiche umane da cellule epatiche fetali primarie umane mediante gli antigeni cellulari CDCP1, CD90 e CD66, al fine di ottenere una sottopopolazione positiva per CDCP1, positiva per CD90 e negativa per CD66. Seminare le cellule in piatti di coltura codificati con collagene IV e incubare a 37 gradi Celsius.Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, lavarle una volta con PBS. Quindi aggiungere tripsina EDTA allo 0,05% e incubare a temperatura ambiente. Quando al microscopio le cellule appaiono galleggiare o muoversi liberamente, arrestare la digestione enzimatica aggiungendo otto millilitri di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS.Con una pipetta sierologica da 10 millilitri, sospendere lentamente le cellule prima di trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 100 × g e a 4 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando 10 millilitri di DMEM/F12 con il 10% di FBS, risospendere attentamente il pellet cellulare e usare uno strumento per il conteggio cellulare per determinare il numero di cellule.Dividere le cellule in aliquote di uno per 10 alla sesta cellule per 50 microlitri di PBS per ogni topo e conservare sul ghiaccio fino al trapianto. Dopo aver anestetizzato un topo secondo il protocollo indicato nel testo, verificare la presenza di un riflesso pizzicando leggermente la pianta del piede posteriore. Quindi applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccamento.Con un rasoio elettrico, rasare la zona chirurgica e applicare etanolo al 70% e iodopovidone per disinfettare. Praticare un'incisione cutanea di un centimetro nel fianco sinistro appena al di sotto del margine costale delle costole. Successivamente, praticare un'incisione sulla parete addominale sinistra, seguita da un'incisione sul peritoneo.Successivamente, esporre con attenzione la milza. Quindi, con un angolo di cinque gradi, inserire una siringa micro-iniettabile da 100 microlitri con un ago da 32 gauge e mezzo pollice a una profondità pari alla metà dello spessore della milza ed iniettare direttamente da un'estremità all'altra dell'organo un milione di cellule staminali epatiche umane in 50 microlitri di PBS, quindi rimuovere l'ago. Per prevenire la fuoriuscita delle cellule dopo l'iniezione, applicare delicatamente pressione con un dito per due minuti.Rimettere la milza all'interno del corpo del mouse e utilizzare una sutura continua normale per la muscolatura e la pelle al fine di chiudere la cavità. Trasferire immediatamente il mouse su un fianco in una gabbia preriscaldata a 37 gradi Celsius. Evitare il contatto tra la lettiera della gabbia e il sito dell'intervento chirurgico e monitorare l'animale secondo il protocollo descritto nel testo.A quattro-sei settimane dopo il trapianto, dopo aver soppresso il topo secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare forbici chirurgiche per aprire la cavità addominale tagliando contemporaneamente cute e fascia. Utilizzando le forbici come divaricatore, dissezionare il tessuto connettivo al di sopra del peritoneo lungo la linea alba per aprire la cavità peritoneale. Con una pinza, sollevare lo sterno.Quindi perforare il diaframma e tagliare su ciascun lato dello sterno fino alla cintura cervicale. Recidere la vena cava sul lato toracico del fegato e tirare l'esofago attraverso il fegato in direzione anteriore. Rimuovere il diaframma e, utilizzandolo come maniglia, iniziare a estrarre il fegato dalla cavità addominale.La vena cava inferiore trattiene il fegato in posizione. Pertanto, recidere la vena cava inferiore avendo cura di non liberare prematuramente la surrenale destra. Separare i lobi del fegato l'uno dall'altro alle giunzioni e includerli in OCT seguendo il protocollo del produttore.Congelare l'OCT contenente il tessuto epatico nelle griglie metalliche del criostato. Con il criostato, tagliare sezioni campione di cinque micrometri di spessore a meno 18 gradi Celsius e montarle su vetrini a temperatura ambiente. Conservare la provetta a meno 80 gradi Celsius.Infine, preparare i vetrini per la colorazione H&E secondo procedure precedentemente descritte e per il saggio ELISA seguendo il protocollo indicato nel testo. Come mostrato in queste sezioni colorate con H&E, i topi trattati con DT hanno mostrato un'architettura epatica disorganizzata e segni di congestione con aumento dell'attività sierica di AST. A sei settimane dal trapianto, le cellule derivate da cellule staminali epatiche umane hanno ricostruito la struttura del fegato sostituendo gli epatociti murini residenti.Macroscopicamente, a quattro giorni dal trapianto, sono stati rilevati piccoli aggregati epatici umani uniformemente distribuiti attorno al fegato. A 45 giorni, gli aggregati si erano moltiplicati formando ammassi più grandi. Come mostrato qui, la presenza di epatociti umani nei fegati di topo è stata confermata per la prima volta a sei settimane dal trapianto mediante colorazione con anticorpi contro le nuclei umane e la citocheratina 8/18.Gli epatociti umani ALB positivi e CK19 negativi assomigliavano a epatociti funzionali, mentre le cellule che risultavano positivamente co-marcate per ALB umano e CK19 mostravano una capacità bi-potenziale di differenziarsi in epatociti e colangiociti. È stata rilevata la presenza di numerosi aggregati rotondi attorno ai lobi epatici, con nuclei umani ben definiti ed espressione di CK8/18, dimostrando la capacità delle cellule staminali epatiche umane di formare colonie nei fegati umanizzati. Infine, il livello di ripopolamento ha raggiunto fino al 90% un mese dopo il trapianto ed è stata rilevata la secrezione di albumina umana nei fegati murini ripopolati.Una volta padroneggiata, la trapianto cellulare chirurgico può essere eseguito in 10 minuti se effettuato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il danno epatico dovrebbe essere limitato al fegato lizer supple. In caso di fuoriuscita cellulare, il trapianto cellulare dovrebbe essere evitato.Combinando questa procedura con altri metodi, come la trasfezione genica per la riprogrammazione diretta in vitro con cellule umane, è possibile esplorare la convergenza delle cellule umane con il nostro modello attuale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epatologia per studiare il metabolismo dei farmaci nell'uomo, le interazioni tra farmaci, la tossicità epatica e il virus dell'epatite in un modello di fegato umanizzato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare ed espandere la cellula staminale epatica, indurre un danno epatico e trapiantare una cellula attraverso la milza per generare un modello murino chimera con funzionalità epatica umana.Non dimenticare che la tossina difterica può essere controllata ed è importante adottare precauzioni, come evitare la necrosi del cuore e del fegato, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino umanizzato duale con un sistema immunitario umano e cellule epatiche. Comporta il trapianto di cellule epatiche umane e cellule staminali e progenitrici ematopoietiche in un topo immunodeficiente transgenico tramite iniezione intrasplenica, portando all'attecchimento delle cellule epatiche e allo sviluppo di cellule immunitarie umane.

Sviluppo di un modello murino umanizzato con cellule epatiche umane e cellule immunitarie

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Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

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Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

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