Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica di trapianto di cellule staminali è generare un nuovo modello murino chimico con funzionalità epatica umana, utilizzando cellule progenitrici staminali epatiche umane immature che consentono la proliferazione, la maturazione e la differenziazione cellulare per l'acquisizione del metabolismo dei farmaci. Questo metodo fornisce uno strumento potente per creare un microambiente in grado di sostenere la progeneisi delle cellule staminali epatiche del donatore umano, permettendone l'espansione, la differenziazione e la ricostruzione del fegato del ricevente murino danneggiato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule proliferate possono maturare e che il fegato viene quasi completamente ripopolato.

Per iniziare, preparare una soluzione madre di tossina difterica o DT a un milligrammo per millilitro aggiungendo un millilitro di soluzione fenolata di cloruro di sodio 0,85% a un milligrammo di DT. Eseguire un'iniezione intraperitoneale di DT tenendo un mouse scid albtrek in posizione supina e al di sotto della piega delle ginocchia a sinistra o a destra della linea mediana, inserendo l'ago a un angolo di 45 gradi rispetto al corpo. Utilizzando una siringa per insulina, iniettare 100 microlitri di una soluzione appena preparata di 0,3 microgrammi per millilitro di DT per ogni mouse da 20 grammi. A 48 ore dall'iniezione di DT, posizionare il mouse in un contenitore restrittivo e riscaldare la coda in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per circa 10 minuti per dilatare i vasi sanguigni.

Quindi, a due centimetri dalla punta della coda, utilizzare una lama affilata di bisturi per praticare un piccolo taglio di un millimetro nella coda ed usare un capillare per raccogliere il sangue. Centrifugare il capillare contenente il sangue a 1500 ×g per cinque minuti e raccogliere il siero separando il soprannatante dal pellet cellulare. Pipettare 50 microlitri di un'opportuna diluizione 1:20 del siero su vetrini GOT ASTP3.

Quindi, utilizzando un analizzatore automatico multifunzione a chimica secca secondo il protocollo del produttore, misurare l'assorbanza del prodotto di reazione a 650 nanometri. Utilizzando un citofluorimetro, isolare le cellule staminali epatiche umane da cellule epatiche fetali primarie umane mediante gli antigeni cellulari CDCP1, CD90 e CD66, al fine di ottenere una sottopopolazione positiva per CDCP1, positiva per CD90 e negativa per CD66. Seminare le cellule in piatti di coltura codificati con collagene IV e incubare a 37 gradi Celsius.

Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, lavarle una volta con PBS. Quindi aggiungere tripsina EDTA allo 0,05% e incubare a temperatura ambiente. Quando al microscopio le cellule appaiono galleggiare o muoversi liberamente, arrestare la digestione enzimatica aggiungendo otto millilitri di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS.

Con una pipetta sierologica da 10 millilitri, sospendere lentamente le cellule prima di trasferirle in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 100 × g e a 4 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando 10 millilitri di DMEM/F12 con il 10% di FBS, risospendere attentamente il pellet cellulare e usare uno strumento per il conteggio cellulare per determinare il numero di cellule.

Dividere le cellule in aliquote di uno per 10 alla sesta cellule per 50 microlitri di PBS per ogni topo e conservare sul ghiaccio fino al trapianto. Dopo aver anestetizzato un topo secondo il protocollo indicato nel testo, verificare la presenza di un riflesso pizzicando leggermente la pianta del piede posteriore. Quindi applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccamento.

Con un rasoio elettrico, rasare la zona chirurgica e applicare etanolo al 70% e iodopovidone per disinfettare. Praticare un'incisione cutanea di un centimetro nel fianco sinistro appena al di sotto del margine costale delle costole. Successivamente, praticare un'incisione sulla parete addominale sinistra, seguita da un'incisione sul peritoneo.

Successivamente, esporre con attenzione la milza. Quindi, con un angolo di cinque gradi, inserire una siringa micro-iniettabile da 100 microlitri con un ago da 32 gauge e mezzo pollice a una profondità pari alla metà dello spessore della milza ed iniettare direttamente da un'estremità all'altra dell'organo un milione di cellule staminali epatiche umane in 50 microlitri di PBS, quindi rimuovere l'ago. Per prevenire la fuoriuscita delle cellule dopo l'iniezione, applicare delicatamente pressione con un dito per due minuti.

Rimettere la milza all'interno del corpo del mouse e utilizzare una sutura continua normale per la muscolatura e la pelle al fine di chiudere la cavità. Trasferire immediatamente il mouse su un fianco in una gabbia preriscaldata a 37 gradi Celsius. Evitare il contatto tra la lettiera della gabbia e il sito dell'intervento chirurgico e monitorare l'animale secondo il protocollo descritto nel testo.

A quattro-sei settimane dopo il trapianto, dopo aver soppresso il topo secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare forbici chirurgiche per aprire la cavità addominale tagliando contemporaneamente cute e fascia. Utilizzando le forbici come divaricatore, dissezionare il tessuto connettivo al di sopra del peritoneo lungo la linea alba per aprire la cavità peritoneale. Con una pinza, sollevare lo sterno.

Quindi perforare il diaframma e tagliare su ciascun lato dello sterno fino alla cintura cervicale. Recidere la vena cava sul lato toracico del fegato e tirare l'esofago attraverso il fegato in direzione anteriore. Rimuovere il diaframma e, utilizzandolo come maniglia, iniziare a estrarre il fegato dalla cavità addominale.

La vena cava inferiore trattiene il fegato in posizione. Pertanto, recidere la vena cava inferiore avendo cura di non liberare prematuramente la surrenale destra. Separare i lobi del fegato l'uno dall'altro alle giunzioni e includerli in OCT seguendo il protocollo del produttore.

Congelare l'OCT contenente il tessuto epatico nelle griglie metalliche del criostato. Con il criostato, tagliare sezioni campione di cinque micrometri di spessore a meno 18 gradi Celsius e montarle su vetrini a temperatura ambiente. Conservare la provetta a meno 80 gradi Celsius.

Infine, preparare i vetrini per la colorazione H&E secondo procedure precedentemente descritte e per il saggio ELISA seguendo il protocollo indicato nel testo. Come mostrato in queste sezioni colorate con H&E, i topi trattati con DT hanno mostrato un'architettura epatica disorganizzata e segni di congestione con aumento dell'attività sierica di AST. A sei settimane dal trapianto, le cellule derivate da cellule staminali epatiche umane hanno ricostruito la struttura del fegato sostituendo gli epatociti murini residenti.

Macroscopicamente, a quattro giorni dal trapianto, sono stati rilevati piccoli aggregati epatici umani uniformemente distribuiti attorno al fegato. A 45 giorni, gli aggregati si erano moltiplicati formando ammassi più grandi. Come mostrato qui, la presenza di epatociti umani nei fegati di topo è stata confermata per la prima volta a sei settimane dal trapianto mediante colorazione con anticorpi contro le nuclei umane e la citocheratina 8/18.

Gli epatociti umani ALB positivi e CK19 negativi assomigliavano a epatociti funzionali, mentre le cellule che risultavano positivamente co-marcate per ALB umano e CK19 mostravano una capacità bi-potenziale di differenziarsi in epatociti e colangiociti. È stata rilevata la presenza di numerosi aggregati rotondi attorno ai lobi epatici, con nuclei umani ben definiti ed espressione di CK8/18, dimostrando la capacità delle cellule staminali epatiche umane di formare colonie nei fegati umanizzati. Infine, il livello di ripopolamento ha raggiunto fino al 90% un mese dopo il trapianto ed è stata rilevata la secrezione di albumina umana nei fegati murini ripopolati.

Una volta padroneggiata, la trapianto cellulare chirurgico può essere eseguito in 10 minuti se effettuato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il danno epatico dovrebbe essere limitato al fegato lizer supple. In caso di fuoriuscita cellulare, il trapianto cellulare dovrebbe essere evitato.

Combinando questa procedura con altri metodi, come la trasfezione genica per la riprogrammazione diretta in vitro con cellule umane, è possibile esplorare la convergenza delle cellule umane con il nostro modello attuale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epatologia per studiare il metabolismo dei farmaci nell'uomo, le interazioni tra farmaci, la tossicità epatica e il virus dell'epatite in un modello di fegato umanizzato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare ed espandere la cellula staminale epatica, indurre un danno epatico e trapiantare una cellula attraverso la milza per generare un modello murino chimera con funzionalità epatica umana.

Non dimenticare che la tossina difterica può essere controllata ed è importante adottare precauzioni, come evitare la necrosi del cuore e del fegato, durante l'esecuzione di questa procedura.