Name: Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri come generare embrioni parabiotici di Danio rerio per studiare funzioni geniche cell-autonomous e non-cell-autonomous. Questo metodo chirurgico migliora la comprensione dell'autonomia cellulare in biologia dello sviluppo.

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Ringraziamo Julie R. Perlin per gli utili commenti sul manoscritto. D.I.S. è supportato da sovvenzioni dell'American Society of Hematology, della Cooley's Anemia Foundation e del NIH (K01DK085217 e R03DK100672). E.J.H. è un Howard Hughes Medical Institute Fellow della Helen Hay Whitney Foundation. B.L. è un Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. è supportato da una Irvington Fellowship del Cancer Research Institute e da un Young Investigator Premio dalla Conquer Cancer Foundation di ASCO. L.I.Z. è sostenuto da sovvenzioni del NIH (R01CA103846, P01HL032262 e R01HL04880), della Taub Foundation for MDS Research, dell'Harvard Stem Cell Institute ed è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute.

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato di cura e l&#39;uso di animali all&#39;ospedale dei bambini Boston. Questo protocollo viene modificato da un metodo precedentemente pubblicato 15. 1. Preparazione dei reagenti (giorni o settimane in anticipo) <ol><li> Preparare piatti 1,5% agarosio rivestite. Aggiungere 1,5 g di agarosio a 100 ml di mezzo Zebrafish E3 in una beuta. Calore, sciogliere l&#39;agarosio, e poi versare circa 5 ml in 100 mm di diametro x 20 mm piatti Petri di profondità. Nota: Questi sono usati per dechorionation di embrioni (Passo 3.1) e per la chirurgia parabiotic (passo 3,3). Conservare piatti agarosio rivestite a 4 ° C per un paio di settimane; portarli fuori dal frigo e caldo al Rt la mattina del giorno dell&#39;intervento parabiotic. </li><li> Preparare 4% metilcellulosa. Sciogliere 4 g di polvere di cellulosa di metile in 100 ml di E3 in una beuta con un ancoretta. Porre il pallone su un piatto mescolare a 4 ° C, impostare la velocità minima, e lasciate mescolareper un massimo di 2 giorni. <ol><li> Intermittenza usare una spatola per rompere grumi bianchi di metilcellulosa. I cristalli metil cellulosa non pienamente dissolvono a questa concentrazione. Quando la soluzione diventa chiara e appare omogeneo, senza grumi bianchi rimanente, un&#39;aliquota la soluzione in provette da 1,5 ml microcentrifuga e congelare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Nota: Le concentrazioni più basse di metil cellulosa possono essere utilizzate; tuttavia, tale percentuale più elevata, più viscoso metilcellulosa ha dato i migliori risultati. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione High Calcium Ringer (HCR). Per fare 400 ml di soluzione di HCR, mescolare 8 ml di 5M NaCl (116 mm finale), 400 ml di 3M KCl (2,9 mm finale), 800 ml di 5M CaCl 2 (10 mM finali), e 2 ml di 1M HEPES (5 mM finale) con 390 ml di E3 media. Nota: Conservare la soluzione HCR a 4 ° C per un paio di settimane; caldo a Rt la mattina del giorno dell&#39;intervento parabiotic. </li><li> Preparare 5 - 6 pipette Pasteur modificati per il trasferimentoanello blastula coppie. Brevemente riscaldare l&#39;estremità della pipetta su un becco Bunsen. Quindi, utilizzando grandi pinze, piegare l&#39;estremità della pipetta a circa 45 ° C mentre è ancora caldo. <ol><li> Per garantire non ci sono spigoli vivi che potrebbero danneggiare gli embrioni, tenere la punta della pipetta brevemente la fiamma per circa 3 sec. Questo sarà liscia / polacco alla fine della pipetta. Questo pipetta Pasteur di vetro modificato viene utilizzato in combinazione con una pompa pipetta 10 ml (Figura 1) al punto 3.5. </li></ol></li><li> Preparare strumenti ago di vetro per la cucitura chirurgica di coppie blastula. Pull 2 ​​- 3 aghi di vetro, come fatto per la microiniezione di embrioni di zebrafish. Utilizzare lab-pellicola per fissare ciascun ago di vetro al fine di un ago eccitante legna o plastica manico (Figura 1A). Utilizzando pinze, rompere l&#39;estremità dell&#39;ago a un diametro di circa 20 - 30 micron. Utilizzare un micrometro per guidare questo passaggio (Figura 1B). Nota: La dimensione del NEpunta edle è importante. Se la punta è troppo grande diventa difficile controllare con precisione e può causare danni eccessivi. Se la punta è troppo piccola, è difficile sufficientemente ferire gli embrioni. </li></ol> 2. Impostazione coppie nidificanti di Zebrafish e raccolta di embrioni (Giorno -1 al giorno 0) <ol><li> Impostare coppie nidificanti di zebrafish adulto. Impostare il pesce la sera prima della chirurgia parabiosis deve essere effettuata. Utilizzare divisori per separare maschi e femmine. Per aumentare le probabilità che gli embrioni desiderati saranno ottenuti, impostare diverse coppie di ogni linea. Troviamo che in genere 20 - 50% delle coppie si riproducono. </li><li> La mattina seguente, tirare i divisori e consentire l&#39;accoppiamento. Raccogliere eventuali embrioni usando una a maglia fine colino da tè, poi trasferirli in una capsula di Petri contenente E3 medio embrione 18. </li><li> Embrioni Micro-iniettare come desiderato (ad esempio, con 25 pg di DNA plasmidico, 200 pg mRNA, o: 1 - 6 ng morfolino) entro 1 ora di raccolta. permettere loro dicrescere fino a quando fase a 256 cellule. Se il costrutto di espressione del DNA è posto sotto il controllo di un promotore shock termico (ad esempio, hsp70, Figura 4B), controllano la tempistica di espressione genica dal calore shocking le parabionts a 37 ° C in una fase successiva (ad es., A 36 HPF ). Nota: In alternativa ad un transgene fluorescente, destrano fluorescente può essere aggiunto al DNA, RNA, o mix iniezione morfolino (ad esempio, destrano, blu cascata a 2 mg / ml). Il colorante destrano non interferirà con il normale sviluppo e consentirà per l&#39;embrione iniettato da identificare sotto la luce fluorescente appropriato dopo la fusione parabiotic. In alternativa, il parabiosis di un ceppo pigmentata (ad esempio, AB) con un ceppo non pigmentato (ad esempio, Casper) potrebbe essere utilizzato per identificare l&#39;embrione iniettato in fasi successive. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° C.Use uno stereoscopio per monitorare il loro sviluppo periodicamente in quanto nei pressi del dev-256 cellulefase elopmental (circa 2,5 HPF). Nota: Se necessario, spostare gli embrioni a temperature diverse per garantire la corrispondenza fase tra i partner parabiotic (ad esempio, gli embrioni morpholino-iniettato spesso sviluppano più lentamente rispetto alle loro controparti non-iniettato Spostando gli embrioni non-iniettata per RT, mentre gli embrioni morpholino-iniettata sono collocati. a 28,5 ° C si tradurrà in loro fasi allineamento dopo un paio d&#39;ore di sviluppo). </li></ol> 3. Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae <ol><li> Come gli embrioni si avvicinano alla fase 256 celle (circa 2,5 HPF), di trasferire gli embrioni da ogni background genetico (cioè, mutante genetico, linee transgeniche e / o manipolazione genetica) in piatti agarosio rivestite separate (per esempio, un piatto per morpholino- embrioni iniettati e un secondo piatto per gli embrioni di controllo). In alternativa, il trasferimento degli embrioni per la pulizia, bicchieri di vetro senza graffio o vetro piastre di Petri. Nota: evitare di utilizzare piatti di plastica non rivestite come gli embrioni che si attacchi alla plastica ed essere danneggiata una volta fuori dalle loro chorions. </li><li> Decantare il supporto E3 fino a poco abbastanza liquido rimane per coprire gli embrioni (circa 7 - 10 ml). Aggiungere 200 ml di 50 mg / ml della miscela di proteasi isolato dal liquido extracellulare di Streptomyces griseus (proteasi). Agitare delicatamente gli embrioni ogni paio di minuti. <ol><li> Quando il 50% degli embrioni sono usciti loro chorions, che prende tipicamente 5 - 10 min, risciacquarli tre volte con un volume generoso (circa 15 - 20 ml) di mezzo di E3 embrione fresco. <ol><li> Dechorionate eventuali embrioni rimasti nelle loro chorions trascinandoli delicatamente nella pipetta Pasteur di vetro modificato e poi delicatamente dissipare. Una volta che gli embrioni sono stati dechorionated e lavato, sostituire il supporto E3 con soluzione HCR. In alternativa alla proteasi, rimuovere le chorions manualmente utilizzando una pinza sottile. Obiettivo di avere 60 - 100 dechorembrioni ionated disponibili per ogni condizione sperimentale. Nota: Questo è molte volte più che in ultima analisi, essere usato, ma molti embrioni sono suscettibili di essere danneggiate durante la movimentazione o l&#39;intervento chirurgico per parabiosis. Una volta che gli embrioni sono dechorionated, tenerli sommerse e non permettere loro di toccare la superficie dell&#39;acqua, come la tensione superficiale causerà loro di essere distrutti. Tenete a mente che l&#39;utilizzo di una dose maggiore di proteasi permette embrioni a venire fuori dalle loro chorions più presto e in modo più sincronizzato. Quando si utilizza una dose minore di proteasi, gli embrioni richiedono più tempo per uscire dalla loro chorions e fanno in modo sincrono meno, che può risultare in una porzione degli embrioni essere danneggiato da una prolungata esposizione alle proteasi. </li></ol></li></ol></li><li> Scongelare la metilcellulosa (fatta al precedente punto 1.2) e centrifugare in una centrifuga da tavolo sulla velocità massima per 10 minuti per far sedimentare cristalli insoluti, che danneggiano gli embrioni o rompersi il tuorloS. <ol><li> Dopo centrifugazione, utilizzare la frazione superiore chiaro (circa il 75% del volume). Trasferimento 1-1,5 cm gocce del diametro di metilcellulosa in una capsula di Petri 1,5% agarosio rivestite. Fare attenzione ad evitare stesura qualsiasi cristalli pellettati dal fondo della provetta. </li><li> Utilizzare un marcatore per predeterminare la posizione di ogni gocciolina sul lato inferiore del piatto. Mettere 12 - 15 gocce (2 - del valore di 3 aliquote &#39;) di metilcellulosa ogni 100 mm di diametro piatto di Petri. Preparare come molti piatti come necessario per esperimento. Nota: utilizzare ogni goccia per la fusione di una singola coppia blastula. Il marchio designa la posizione di ogni goccia una volta che si aggiunge-in media che punto le gocce diventano quasi invisibili. </li></ol></li><li> Preparare un 40 ml un&#39;aliquota di soluzione HCR antibiotico-integrato per ogni piatto agarosio rivestite preparata sopra al punto 3.3. Per ogni 40 ml aliquota di HCR aggiungere penicillina-streptomicina a 50 U / ml, ampicillina a 50 U / ml, e kanamicina a 0.5 mg/ Ml. <ol><li> Quando si è pronti per eseguire blastula fusioni, riempire con cura ciascuno dei piatti contenenti goccioline metilcellulosa con 40 ml di soluzione HCR antibiotico-integrato. Se viene aggiunto troppo rapidamente la soluzione HCR, può disturbare le goccioline. </li></ol></li><li> Fissare la pipetta Pasteur di vetro modificata (fatta al precedente punto 1.4) ad una pompa pipetta 10 ml. Sotto uno stereoscopio raccogliere un embrione dechorionated da ogni background (ad esempio, un embrione morfolino-iniettata e una wild-type embrione). <ol><li> Prima di erogare i due embrioni, utilizzare la pipetta Pasteur di fare una piccola depressione nel mezzo della goccia metil cellulosa, poi delicatamente depositare due embrioni nella depressione. Nota: Durante il processo di trasferimento, ruotare la pipetta Pasteur leggermente verso l&#39;alto in modo che gli embrioni stabilirsi nella curva della pipetta Pasteur in modo da evitare il contatto making con la superficie del liquido nella parte superiore o inferiore della pipetta (che può portare a theiR rottura). </li></ol></li><li> Subito dopo aver depositato gli embrioni in metilcellulosa, utilizzare un ago eccitante legna o plastica manico con puntali gel di caricamento sulla estremità (Figura 1A) per riposizionare accuratamente gli embrioni all&#39;interno della metilcellulosa tale che i loro poli animali sono direttamente toccarsi. <ol><li> Utilizzare delicati movimenti radicali attraverso il metil cellulosa vicino agli embrioni per riposizionare loro senza toccarli direttamente. Lasciate che gli embrioni riposare per 5 minuti in modo che il metil cellulosa si assesterà intorno a loro. Durante questo tempo, caricare la coppia successiva in un&#39;altra goccia. Nota: evitare il contatto diretto con gli embrioni e prestare particolare attenzione a non toccare alcuna parte del sacco vitellino, che sarà facilmente rompersi. </li></ol></li><li> Utilizzando lo strumento ago di vetro, accuratamente avvolto ogni embrione al loro punto di contatto. Con un movimento di cucitura dolce, le cellule del primo embrione può essere tirato nel secondo embrione e poi di nuovo indietro.Al termine di questo movimento, tenere l&#39;ago in posizione per 2 - 3 secondi e quindi trascinare via molto lentamente. Nota: Vi è un periodo di circa 2 - 3 secondi dopo che gli embrioni sono feriti dove i due tessuti sembrano essere più adesivo e più probabile per collegare l&#39;uno all&#39;altro. Così, noi crediamo che tenere l&#39;ago in posizione brevemente dopo il ferimento aiuta a mantenere i tessuti feriti di ogni embrione in contatto per il periodo iniziale di tempo subito dopo il ferimento. </li><li> Lasciare questi embrioni di sedersi per 10 - 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, continuare a punto nuove coppie in altre gocce di metilcellulosa. Dopo 10 - 15 minuti, valutare se la prima coppia è rimasta attaccata (Figura 2A). Nota: Se gli embrioni sono più collegati, ripetere il processo di cucitura finché gli embrioni sono più giovani attorno al palco epiboly 30%. In genere questo permette fino a tre tentativi di cucire gli embrioni insieme. Se gli embrioni sembrano aver mantenuto un allegato ma il connection non è sostanziale, eseguire ulteriori cuciture sul bordo della connessione per rinforzarlo. Evitare di scuotere o spostare i piatti durante i periodi di chirurgia e di incubazione parabiotic. Nota: Nonostante la loro fase iniziale di sviluppo e fragilità percepita, le masse cellulari dei embrioni possono tollerare una notevole quantità di manipolazione (cioè, ferendo e cuciture), e ancora svilupparsi normalmente. Il tuorlo, tuttavia, può rompersi con solo il minimo tocco, uccidendo l&#39;embrione. Quando le due cuciture blastulae con l&#39;ago di vetro, non di entrare in contatto con l&#39;interfaccia tra la massa cellulare e tuorlo di ogni embrione. </li><li> Incubare gli embrioni O / N a 28,5 ° C nello stesso piatto e dei media (non modificare la media). Il mattino seguente, gli embrioni sono spostati fuori delle goccioline metil cellulosa prevalentemente disciolti. Rimuovere eventuali embrioni che non sono stati fusi con successo. Decantare i media e sostituirlo con un nuovo 25 ml E3. Nota: Se si lavora con unceppo pigmentata, aggiungere 500 microlitri phenylthiourea 0,15% (50x) (PTU) ad una concentrazione finale di 0,003% per bloccare la pigmentazione. Gli embrioni dovranno restare costantemente in PTU per mantenere la soppressione di pigmentazione. </li></ol> 4. Configurazione Microscopio, Immagine acquisizione, elaborazione e analisi <ol><li> Preparare 0,8% agarosio a basso punto di fusione (LMP): Aggiungere 0,8 g LMP agarosio a 100 ml E3 e di calore fino a completo scioglimento. Mentre caldo, aliquota 1 ml di LMP agarosio in provette da 1,5 ml microcentrifuga in C blocco riscaldante 37 °. L&#39;agarosio LMP rimarrà fuso a 37 ° C. Aggiungere 40 ml di 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaine ad ogni 1 ml aliquota di LMP agarosio a 37 ° C. Nota: Se si lavora con un ceppo pigmentata, aggiungere 20 ml di 0,15% (50x) PTU per ogni aliquota 1 ml. <ol><li> Conservare il restante LMP agarosio per diversi mesi in sigillati provette da 50 ml a 4 ° C. </li></ol></li><li> Anestetizzare gli embrioni parabiotic per essere ripreso con l&#39;aggiunta di 1 ml di 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaineai 25 ml di E3 che gli embrioni sono già in. </li><li> Agitare delicatamente il piatto in modo che gli embrioni piscina in mezzo. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica a livello di punta elaborare gli embrioni in appena liquido possibile. Girare la pipetta in posizione verticale e rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che essi depositano sul fondo della pipetta. <ol><li> Con gli embrioni nella parte inferiore della pipetta, trasferirli ad un&#39;aliquota di 1 ml di agarosio LMP toccando leggermente la punta della pipetta alla superficie del agarosio. Evitare di trasferire il liquido in eccesso come questo diluire il agarosio. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;espulsione del liquido in eccesso dalla pipetta, utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni all&#39;interno del agarosio, quindi utilizzare la pipetta per trasferire tutto il agarosio e embrioni al pozzo di un fondo di vetro (No. 1.5 vetrino), 6- pozzetti. Nota: Assicurarsi di scartare la pipetta dopo il trasferimento degli embrioni alla piastra di imaging. agarosio residua imposterà all&#39;interno della pipetta, rendering inefficace per ulteriore uso. Piuttosto, utilizzare una nuova pipetta ogni volta. </li><li> In uno stereoscopio, utilizzare un puntale gel-loading fisso sull&#39;estremità di un ago eccitante manico legno per posizionare gli embrioni verso il vetro di copertura (per garantire che siano all&#39;interno della distanza di lavoro del obiettivo microscopio) e nell&#39;orientamento desiderato per l&#39;imaging. Nota: Riposizionare continuamente fino l&#39;agarosio si è completamente impostata. Fare attenzione a montare gli embrioni parabiotic secondo cui embrione della coppia è quello di essere ripreso. Dato l&#39;orientamento casuale degli embrioni siamesi, per alcune coppie può essere difficile immagine entrambe embrioni. In questo scenario, recuperare gli embrioni dal agarosio utilizzando una pinza e una vasta a punta pipetta di trasferimento di plastica e poi rimontare per l&#39;imaging da una prospettiva diversa. </li><li> Una volta che l&#39;agarosio si è impostato, coprire con 2 - 3 ml di E3 integrato con tricaine (e PTU se necessario). </li><li> Immagine gli embrioni utilizzando una rovesciata a grande campo epi-fluorescenza, lasconfocale er-scansione o disco rotante microscopio confocale. Selezionare l&#39;obiettivo più appropriato per imaging desiderata. Per un campo intero embrione di vista, utilizzare un obiettivo 4x. Selezionare un ingrandimento superiore, come un obiettivo 20x, all&#39;immagine un tessuto specifico 16, 19. Nota: Se si utilizza un microscopio in posizione verticale, il montaggio a LMP agarosio (simile al precedente) su un vetrino di vetro. Capovolgere il vetrino di vetro su un vetrino da microscopio in vetro che ha un anello di grasso per vuoto riempito con lo stesso E3-tricaine-PTU 16, 19. </li><li> Processo di immagini utilizzando libere pacchetti software di analisi delle immagini, quali NIH Immagine J / FIJI 16, 19 acquisito. Nota: Contare il numero di cellule e quantificare le dinamiche quali la migrazione delle cellule e la divisione cellulare utilizzando la segmentazione e monitoraggio di algoritmi di 16, 19. </li></ol>

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<li>Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-inducible+expression+of+a+reporter+gene+detected+by+transient+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish.</a> Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Fusion Parabiotic è stato un potente strumento per studiare le funzioni cellulari di geni candidati in modelli murini adulti e embrioni di pollo 10-14. Più di recente, un metodo di fusione blastula è stata descritta per la generazione di embrioni di zebrafish siamesi 15. Nel presente protocollo, video tutorial-based sono utilizzati per dimostrare e meglio descrivere la metodologia per la creazione di parabiotic embrioni di zebrafish di diversi background genetico al fine di studiare i ruoli tempora...

La creazione di mosaici genetici (chimere) tra wild-type e animali geneticamente modificati è una strategia ben consolidata e classica per indagare cellule intrinseca contro le funzioni delle cellule-estrinseca di geni candidati 1-6. Blastula trapianto in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per generare embrioni chimerici per gli studi di cellule-autonomia 7-9. A seconda del tessuto di interesse, tuttavia, può essere difficile per indirizzare prevedibile cellule del donatore al tessuto desiderato (ad esempio, sangue) 1-3, 7-9. Genetisti mouse hanno a lungo utilizzato metodi chirurgici parabiotic per generare organismi congiunti con una tiratura condiviso 10-14. Perché gli animali parabiotic condividono un flusso sanguigno comune, le interazioni tra le cellule che ha avuto origine da un animale con cellule del altro animale di un diverso background genetico possono essere studiati 10-16. Di recente, il gruppo di Karima Kissa elegantemente dimostrato la capacità di create embrioni di zebrafish siamesi e quindi utilizzare questo sistema per studiare staminali ematopoietiche e la migrazione 15 cellule progenitrici (HSPC). Inoltre, parabiosis zebrafish è stato recentemente utilizzato per studiare il ruolo della caderina endoteliali 5 di cellule staminali ematopoietiche (HSC) comparsa e la migrazione, e 16 per studiare il ruolo delle cellule stromali nella nicchia HSPC durante lo sviluppo zebrafish 17. A differenza di topi, embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono la visualizzazione diretta delle cellule durante lo sviluppo parabiotic, rendendo il sistema unico potente. L&#39;utilità di parabiosis in zebrafish, tuttavia, è limitato da una ripida curva di apprendimento, e la chirurgia parabiotic sugli embrioni delicati può essere tecnicamente impegnativo, senza istruzioni dettagliate e dimostrazione visiva. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video tutorial basati su come generare embrioni di zebrafish parabiotic per lo studiotemporale, cellule intrinseca, o funzioni delle cellule-estrinseca di un gene candidato (s) dalla fusione chirurgica di sviluppare blastulae. modifiche chiave e ulteriori raccomandazioni per aumentare la sopravvivenza parabiont e nuove applicazioni sperimentali sono inclusi.

<table><tbody><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Componenti singoli per E3/HCR:</td><td></td><td>Per 1L: 14,61 g NaCl, 0,63 g KCl, 2,43 g CaCl2-2H2O, 1,99 g MgSO4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Cloruro di sodio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloruro di potassio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Cloruro di calcio diidrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (Magnessium solfato eptaidrato)</td>Soluzione tampone <td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M</td>) <td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Numero</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco di Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sale sodico</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato da Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronasi da Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>vetro capillare utilizzato per gli aghi (Capillary Glass & Filamenti)</td><td>Strumento Sutter</td><td>ARTICOLO#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per stuzzicare con manici in legno</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per pipette da 10 ml (verde) (Pipetta per pipetta)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica da 100 mm di diametro/ 20 mm di profondità (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, TRASPARENTE, CON PRESE D'ARIA, DESIGN PESANTE, 15 PZ./SACCHETTO )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. la scorta di lavoro è dello 0,003% (50x è 0,15%). per 500 ml, 0,75 g di N-Phenylthiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina (polvere) (Tricaina metanosulfonato, Tricaina-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP agarosio (agarosio LMP ultrapuro)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>pipetta di trasferimento in plastica (solo quella con estremità larga, credo)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti con fondo in vetro utilizzate per l'imaging</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>punta di caricamento in gel western in plastica fissata all'estremità di un ago da dissezione con manico in legno (punte GELoader)</td><td>Vetrini di copertura in vetro Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>, vetrini e grasso per vuoto se montati per un microscopio verticale:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasso sottovuoto Dow Corning® ( Dow Corning® grasso siliconico per alto vuoto incolore, peso 5,3 oz (tubo) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td> <td>coprioggettiCorning Scienze della vita</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di sviluppo blastulae

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

parabiosis chirurgica di due animali di differenti background genetico crea uno scenario unico per lo studio delle cellule-intrinseco rispetto a ruoli di cellule-estrinseca per geni candidati di interesse, i comportamenti migratori delle cellule, e segnali secreti in contesti genetici distinti. Perché gli animali parabiotic condividono una circolazione comune, il sangue o fattore ematica da un animale saranno scambiati con il suo partner e viceversa. Così, cellule e fattori molecolari derivate da uno sfondo genetico possono essere studiati nel contesto di una seconda background genetico. Parabiosis di topi adulti è stato ampiamente utilizzato per l&#39;invecchiamento della ricerca, il cancro, il diabete, l&#39;obesità, e lo sviluppo del cervello. Più di recente, parabiosis di embrioni di zebrafish è stato utilizzato per studiare la biologia dello sviluppo di emopoiesi. In contrasto con i topi, la natura trasparente di embrioni di zebrafish permette la visualizzazione diretta delle cellule nel contesto parabiotic, che lo rende un metodo unico potente per indagare fmeccanismi cellulari e molecolari FONDAMENTALI. L&#39;utilità di questa tecnica, tuttavia, è limitata da una curva di apprendimento ripida per generare gli embrioni zebrafish parabiotic. Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo su come fondere chirurgicamente la blastulae di due embrioni di zebrafish di diversi background genetici per studiare il ruolo dei geni candidati di interesse. Inoltre, gli embrioni di zebrafish parabiotic sono tolleranti a shock termico, rendendo il controllo temporale dell&#39;espressione genica possibile. Questo metodo non richiede un sofisticato set-up e ha ampie applicazioni per lo studio migrazione delle cellule, specifica il destino, e la differenziazione in vivo durante lo sviluppo embrionale.

In linea con gli studi pubblicati in precedenza 15, con successo la fusione parabiotic di embrioni di zebrafish dipende la messa in scena e l&#39;orientamento dei due embrioni e la concentrazione di metilcellulosa. Con pochi e semplici, poco costosi strumenti, blastulae in via di sviluppo chirurgicamente fuse sono stati generati che è cresciuta in embrioni parabiotic con circolazione condiviso. Questi strumenti inclusi una pipetta Pasteur modificato, una pompa pipetta 10 ml, e...

Questo protocollo fornisce istruzioni passo dopo passo su come generare embrioni di pesce zebra parabiotico di diversi background genetici. Se combinato con le impareggiabili capacità di imaging dell'embrione di zebrafish, questo metodo fornisce un mezzo straordinariamente potente per studiare le funzioni autonome delle cellule rispetto a quelle non autonome delle cellule per i geni candidati di interesse.

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

L'obiettivo generale di questo metodo è generare embrioni di zebrafish parabiotici, che possono essere utilizzati per studiare le funzioni intrinseche alla cellula rispetto a quelle estrinseche alla cellula per geni candidati di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sull'autonomia cellulare. Ad esempio, nel sistema ematopoietico, difetti vitali nella migrazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono intrinseci alle HSC stesse o al microambiente della nicchia. Il vantaggio principale di questo protocollo è una maggiore capacità di generare con successo embrioni di pesce zebra parabiotici. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché gli embrioni in via di sviluppo sono estremamente fragili e si danneggiano facilmente. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto le fasi di sutura chirurgica possono risultare difficili da apprendere perché richiedono un elevato grado di accuratezza e precisione.Qui forniamo istruzioni dettagliate per generare embrioni di pesce zebra parabiotici mediante fusione chirurgica di blastule in via di sviluppo. Questo metodo illustra come aumentare l'efficienza delle fusioni parabiotiche e migliorare la sopravvivenza degli embrioni congiunti. Dopo aver preparato reagenti e strumenti secondo il protocollo descritto, preparare due o tre pipette Pasteur modificate riscaldando brevemente l'estremità della pipetta su un becco di Bunsen.Quindi, utilizzando pinze grandi, mentre è ancora calda, piegare l'estremità della pipetta di circa 45 gradi. Per assicurarsi che non vi siano bordi taglienti che potrebbero danneggiare gli embrioni, mantenere l'estremità della pipetta sopra un becco di Bunsen per uno o due secondi. Utilizzando DNA plasmidico, mRNA o morpholino, microiniettare gli embrioni entro un'ora dalla raccolta e lasciarli sviluppare fino alla fase di 256 cellule.Quando gli embrioni si avvicinano allo stadio di 256 cellule, trasferire ciascun background genetico in piatti separati rivestiti di agarosio, becher di vetro senza graffi o piastre di Petri. Dopo aver dechorionato gli embrioni seguendo il protocollo indicato nel testo, scongelare la metilcellulosa precedentemente preparata ed utilizzare una centrifuga da banco alla velocità massima per formare un pellet dei cristalli non disciolti, che potrebbero danneggiare gli embrioni o rompere i tuorli. Nel frattempo, utilizzando un pennarello, segnare 12-15 punti predeterminati sul lato inferiore di una piastra di Petri da 100 millilitri rivestita di agarosio.Successivamente, dopo la centrifugazione, utilizzando la frazione superiore limpida della metilcellulosa, trasferire da una a 1,5 gocce di centimetro negli spazi segnati nella piastra di Petri. In seguito, preparare un'aliquote da 40 millilitri di soluzione Ringer ad alto contenuto di calcio, o soluzione HCR, per ogni piastra rivestita con agarosio appena preparata. Ad ogni aliquota, aggiungere gli antibiotici elencati qui.Quando si è pronti per eseguire le fusioni di blastula, utilizzare gli aliquote di HCR con antibiotici per riempire con attenzione ogni piastra contenente le gocce di metilcellulosa, avendo cura di non disturbare le gocce. Collegare una pipetta di vetro di Pasteur modificata, preparata in precedenza, a una pompa per pipetta da 10 millilitri. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, raccogliere un embrione dechorionato da ciascun ceppo genetico.Prima di distribuire i due embrioni, utilizzare la pipetta di Pasteur per creare una piccola depressione al centro della goccia di metilcellulosa. Quindi, depositare i due embrioni all'interno della depressione. Ora, utilizzando un ago da dissezione con una punta per caricamento di gel all'estremità, eseguire delicati movimenti di spazzolamento senza toccare direttamente gli embrioni, in modo da riposizionarli con attenzione all'interno della metilcellulosa, facendo in modo che i loro poli animali si tocchino direttamente.L'orientamento corretto degli embrioni in via di sviluppo determina in che modo gli embrioni si fonderanno e si svilupperanno. Per le fusioni testa-testa, assicurarsi che ogni fusione sia allineata ai rispettivi poli animali. Lasciare gli embrioni in posa per cinque minuti, in modo che la metilcellulosa si depositi intorno a essi.Nel frattempo, caricare la coppia successiva in un'altra goccia. Per eseguire l'intervento, utilizzando lo strumento a ago di vetro, ferire con attenzione ciascun embrione nel punto di contatto. Quindi, con un delicato movimento simile a un punto di sutura, tirare le cellule dal primo embrione nel secondo embrione e nuovamente indietro.Alla fine del movimento, mantenere l'ago in posizione per due o tre secondi prima di ritrarlo molto lentamente. La precisione nell'uso dell'ago di vetro è fondamentale per assicurare che gli embrioni vengano cuciti correttamente insieme. È necessario fare attenzione a non danneggiare le sacche vitelline, mantenendo al contempo un collegamento sufficiente per una fusione riuscita.Lasciare gli embrioni a riposo per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, cucire ulteriori coppie di embrioni. Al termine dell'incubazione, verificare se gli embrioni sono rimasti attaccati e ripetere il passaggio di lesione se necessario.Incubare gli embrioni nella stessa piastra e nel mezzo a 28,5 gradi Celsius durante la notte. Entro la mattina successiva, gli embrioni si saranno spostati fuori dalla metilcellulosa per la maggior parte disciolta. Rimuovere tutti gli embrioni che non si sono fusi correttamente.Quindi, versare con cautela il mezzo e sostituirlo con 25 millilitri di E3. Per ottenere immagini degli embrioni fusi, preparare agarosio a basso punto di fusione allo 0,8%. Mentre è ancora caldo, aliquotare 1 millilitro di agarosio in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri posizionate in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius.Anestetizzare gli embrioni parabiotici aggiungendo un millilitro di tricaina a quattro milligrammi per millilitro, pH 7,0, ai 25 millilitri di mezzo E3 contenente gli embrioni. Ruotare delicatamente la piastra in modo che gli embrioni si raggruppino al centro. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica con punta larga, aspirare gli embrioni con il minor quantitativo possibile di liquido.Successivamente, posizionare la pipetta in verticale e muoverla delicatamente su e giù in modo che gli embrioni si accumulino sul fondo della punta. Trasferire quindi gli embrioni in un'aliquote da 1 millilitro di agarosio a basso punto di fusione toccando leggermente la superficie dell'agarosio con la punta della pipetta. Rimuovere con attenzione il liquido in eccesso dalla pipetta e utilizzarla per mescolare delicatamente gli embrioni all'interno dell'agarosio.Quindi, con la pipetta, trasferire l'agarosio e gli embrioni nel pozzetto di una piastra in vetro a sei pozzetti con fondo in vetro. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una punta per caricamento gel fissata all'estremit&agrave; di un ago da dissezione per posizionare gli embrioni vicino al vetrino e nell'orientamento desiderato per l'acquisizione delle immagini. Dopo che l'agarosio si &egrave; solidificato e il mezzo con tricaina &egrave; stato aggiunto ai pozzetti, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser ad epifluorescenza widefield invertito, oppure un microscopio confocale a disco rotante, per acquisire le immagini.Per un campo visivo di tutto l'embrione, utilizzare un obiettivo 4X. Utilizzare un obiettivo 20X per acquisire immagini di un tessuto specifico. Elaborare le immagini seguendo il protocollo descritto nel testo.Come mostrato qui, dopo aver orientato due blastule con i loro poli animali rivolti l'uno verso l'altro, gli embrioni sono stati delicatamente feriti nel punto di contatto. Un grado maggiore di ferita aumentava la probabilità che gli embrioni mantenessero una connessione che portava a una fusione riuscita, senza difetti morfologici aggiuntivi o ritardi nello sviluppo. Come dimostrato in questa figura, orientando le due blastule con i poli animali perfettamente allineati, si sono ottenute fusioni testa a testa o sacco vitellino a sacco vitellino affidabili, con circolazione condivisa.Nella maggior parte dei casi, gli embrioni presentavano due cuori che pompavano una circolazione comune condivisa. Per confermare che gli embrioni effettivamente condividessero la loro circolazione, embrioni transgenici con eritrociti positivi per GFP sono stati fusi con embrioni che presentavano cellule endoteliali vascolari positive per mCherry. Come mostrato in questo filmato, entro 48 ore dalla fecondazione, eritrociti positivi per GFP sono stati osservati in circolo attraverso l'embrione partner Flik 1 HRAS mCherry.Infine, per studiare il controllo temporale dell'espressione genica, uno dei due embrioni è stato iniettato con un costrutto di DNA hsp70 EGFP. Dopo un breve shock termico di 30 minuti a 37 gradi Celsius, in uno degli embrioni si è stabilizzato un chiaro segnale GFP e, in alcuni casi, sono state osservate cellule GFP-positive in circolo nell'embrione compagno non iniettato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se realizzata correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di prestare molta attenzione nel cucire insieme le due blastule e di ripetere le fusioni qualora l'intervento chirurgico non fosse riuscito al primo tentativo. Dopo questa procedura, possono essere utilizzati metodi aggiuntivi come l'imaging di cellule vive per rispondere ad altre domande, ad esempio se le CSC di tipo selvatico possano funzionare normalmente in un compartimento mutante o, viceversa, se le CSC mutate possano funzionare in un compartimento di tipo selvatico. Questa tecnica fornisce un metodo potente ai ricercatori nel campo dell'ematonologia per studiare la regolazione dello sviluppo ematico nel pesce zebra.Non dimenticare che la tricaina può essere pericolosa e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visionato questo video e seguito le nostre tecniche raccomandate, speriamo che tu sia in grado di ottenere embrioni di zebrafish biotici di migliore qualità con un maggior tasso di successo.

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