Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare embrioni parabiotici di zebrafish, che possono essere utilizzati per studiare le funzioni intrinseche delle cellule rispetto a quelle estrinseche cellulari per i geni candidati di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'autonomia cellulare. Ad esempio, nel sistema ematopoietico, i difetti vitali nella migrazione delle HSC sono intrinseci alle HSC o al microambiente di nicchia.

Il vantaggio principale di questo protocollo è una migliore capacità di generare con successo embrioni parabiotici di zebrafish. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché gli embrioni in via di sviluppo sono estremamente fragili e facilmente danneggiabili. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di sutura chirurgica possono essere difficili da imparare perché richiedono un alto grado di accuratezza e precisione.

Qui forniamo istruzioni dettagliate per generare embrioni parabiotici di pesce zebra mediante fusione chirurgica di blastule in via di sviluppo. Questo metodo dimostra come aumentare l'efficienza delle fusioni parabiotiche e migliorare la sopravvivenza degli embrioni congiunti. Dopo aver preparato i reagenti e gli strumenti secondo il protocollo di testo, preparare due o tre pipette Pasteur modificate riscaldando brevemente l'estremità della pipetta su un bruciatore Bunsen.

Quindi, utilizzando una pinza grande, mentre è ancora calda, piegare l'estremità della pipetta di circa 45 gradi. Per assicurarsi che non vi siano spigoli vivi che potrebbero danneggiare gli embrioni, tenere l'estremità della pipetta sopra un bruciatore Bunsen per uno o due secondi. Utilizzando il DNA plasmatico, l'mRNA o il morfinolino, microiniettare gli embrioni entro un'ora dalla raccolta e lasciarli sviluppare fino allo stadio di 256 cellule.

Quando gli embrioni si avvicinano allo stadio di 256 cellule, trasferire ogni background genetico in piastre separate rivestite di agarosio, becher di vetro antigraffio o piastre di Petri. Dopo aver dechorionato gli embrioni secondo il protocollo di testo, scongelare la metilcellulosa precedentemente preparata e utilizzare una centrifuga da tavolo alla massima velocità per pellettare i cristalli non disciolti, che danneggeranno gli embrioni o romperanno i tuorli. Nel frattempo, utilizzando un pennarello, segnare da 12 a 15 punti predeterminati sul lato inferiore di una capsula di Petri rivestita di agarosio da 100 millilitri.

Quindi, dopo la centrifugazione, utilizzando la frazione superiore chiara della metilcellulosa, trasferire da una a 1,5 centimetri di gocce nei punti contrassegnati della capsula di Petri. Quindi, preparare un'aliquota da 40 millilitri di ringer ad alto contenuto di calcio, o soluzione HCR per piatto rivestito di agarosio appena preparato. Ad ogni aliquota, aggiungere gli antibiotici come elencato qui.

Quando si è pronti per eseguire le fusioni di blastula, utilizzare le aliquote di HCR con antibiotici per riempire accuratamente ogni piatto contenente le goccioline di metilcellulosa, facendo attenzione a non interrompere le goccioline. Collegare una pipetta Pasteur di vetro modificata preparata in precedenza a una pompa per pipette da 10 millilitri. Quindi, sotto uno stereoscopio, raccogli un embrione dechorionato da ogni sfondo.

Prima di erogare i due embrioni, utilizzare la pipetta Pasteur per fare una piccola depressione al centro della goccia di metilcellulosa. Quindi, depositare i due embrioni nella depressione. Ora, usando un ago per stuzzicare con una punta di caricamento in gel all'estremità, usa movimenti ampi delicati senza toccare direttamente gli embrioni per riposizionare con cura gli embrioni all'interno della metilcellulosa, in modo che i loro poli animali si tocchino direttamente l'un l'altro.

Orientare correttamente gli embrioni in via di sviluppo determina il modo in cui gli embrioni si fonderanno e si svilupperanno. Per le fusioni testa a testa, assicurati che ogni fusione sia allineata ai poli degli animali. Lascia riposare gli embrioni per cinque minuti affinché la metilcellulosa si depositi intorno a loro.

Durante questo periodo, carica la coppia successiva in un'altra goccia. Per eseguire l'intervento chirurgico, utilizzando lo strumento dell'ago di vetro, avvolgere accuratamente ogni embrione nel punto di contatto. Quindi, con un leggero movimento di cucitura, estrarre le cellule dal primo embrione al secondo embrione e viceversa.

Alla fine del movimento, tieni l'ago in posizione per due o tre secondi prima di estrarlo molto lentamente. La precisione con l'ago di vetro è fondamentale per garantire che gli embrioni siano cuciti correttamente insieme. Bisogna fare attenzione a non danneggiare le sacche vitellino mantenendo una connessione sufficiente per una fusione di successo.

Lasciare riposare gli embrioni per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, cuci altre coppie di embrioni. Dopo l'incubazione, valutare se gli embrioni sono rimasti attaccati e, se necessario, ripetere la fase di ferita.

Incubare gli embrioni nello stesso piatto e terreno a 28,5 gradi Celsius durante la notte. Entro la mattina seguente, gli embrioni saranno usciti dalla metilcellulosa per lo più disciolta. Rimuovere tutti gli embrioni che non si sono fusi con successo.

Quindi, decantare il terreno e utilizzare 25 millilitri di E3 per sostituirlo. Per acquisire le immagini degli embrioni fusi, preparare l'agarosio allo 0,8% a basso punto di fusione. Mentre è ancora caldo, aliquotare 1 millilitro di agarosio in provette per microfughe da 1,5 millilitri poste in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius.

Anestetizzare gli embrioni parabiotici aggiungendo un millilitro di quattro milligrammi per millilitro di tricaina a pH 7,0 ai 25 millilitri di terreno E3 contenenti gli embrioni. Agitare delicatamente il piatto in modo che gli embrioni si accumulino al centro. Quindi, utilizzando una pipetta di plastica a punta larga, aspirare gli embrioni in meno liquido possibile.

Quindi, capovolgere la pipetta in posizione verticale e far rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che si depositino sul fondo della pipetta. Quindi, trasferire gli embrioni in un'aliquota di 1 millilitro di agarosio a basso punto di fusione toccando leggermente la punta della pipetta sulla superficie dell'agarosio. Eliminare il liquido in eccesso dalla pipetta e utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni nell'agarosio.

Quindi, con la pipetta, trasferire l'agarosio e gli embrioni nel pozzetto di una piastra a sei pozzetti con fondo di vetro. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una punta di caricamento in gel fissata all'estremità di un ago per stuzzicare per posizionare gli embrioni vicino al vetro di copertura e nell'orientamento desiderato per l'imaging. Dopo che l'agarosio si è solidificato e il terreno con tricaina è stato aggiunto ai pozzetti, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser a epifluorescenza a campo largo invertito o un microscopio confocale a disco rotante per acquisire le immagini.

Per un campo visivo dell'intero embrione, utilizzare un obiettivo 4X. Usa un obiettivo 20X per visualizzare un tessuto specifico. Elabora le immagini secondo il protocollo di testo.

Come mostrato qui, dopo aver orientato due blastule con i loro pali animali uno di fronte all'altro, gli embrioni sono stati accuratamente feriti nel loro punto di contatto. Un maggior grado di ferita ha aumentato la probabilità che gli embrioni mantenessero una connessione che ha portato a una fusione di successo senza ulteriori difetti morfologici o sviluppo ritardato. Come dimostrato in questa figura, orientando le due blastule con i loro poli animali direttamente allineati, sono state generate fusioni affidabili testa a testa o sacco vitellino-sacco con circolazione condivisa.

Nella maggior parte dei casi, gli embrioni avevano due cuori che pompavano una circolazione comune condivisa. Per confermare che gli embrioni condividevano effettivamente la loro circolazione, gli embrioni transgenici fusi che avevano eritrociti GFP-positivi sono stati fusi con embrioni che avevano cellule endoteliali vascolari mCherry-positive. Come si vede in questo filmato, entro 48 ore dalla fecondazione, sono stati osservati eritrociti GFP-positivi che circolavano attraverso l'embrione partner Flik 1 HRAS mCherry.

Infine, per studiare il controllo temporale dell'espressione genica, a uno dei due embrioni è stato iniettato un costrutto di DNA EGFP hsp70. Dopo un breve shock termico di 30 minuti a 37 gradi Celsius, è stato stabilito un chiaro segnale GFP in uno degli embrioni e, in alcuni casi, sono state osservate cellule GFP-positive che circolavano nell'embrione partner non iniettato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione quando si cuciono insieme le due blastule e di rivisitare le fusioni se l'intervento chirurgico non ha avuto successo al primo tentativo. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi come l'imaging di cellule vive per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se le HSC wild-type possono funzionare normalmente in una nicchia mutante o, al contrario, se le HSC mutanti possono funzionare in una nicchia wild-type. Questa tecnica fornisce un metodo potente per i ricercatori nel campo dell'ematologia per studiare la regolazione dello sviluppo del sangue nel pesce zebra.

Non dimenticare che la tricaince può essere pericolosa e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare un abbigliamento di sicurezza adeguato. Dopo aver visto questo video e aver seguito le nostre tecniche consigliate, speriamo che sarai in grado di generare migliori embrioni biotici di pesce zebra con maggiore successo.