Un test cellulare gratuitamente utilizzando Laevis Xenopus Embryo Estrae per studiare i meccanismi del regolamento Size nucleare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare gli estratti di uova ed embrioni di Xenopus per produrre un test in cui i nuclei di grandi dimensioni si restringono più piccoli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla biologia delle cellule nucleari, ad esempio quali sono i meccanismi che regolano le dimensioni nucleari? Il vantaggio principale di questa tecnica è che la composizione e le attività dell'estratto libero da cellule di Xenopus sono facilmente manipolabili per valutare i fatti sulle dimensioni nucleari.

Dopo aver preparato gli estratti di uova di Xenopus, lo sperma demembranato e i nuclei assemblati secondo il protocollo di testo, raccogli le uova appena deposte tenendo le rane su una capsula di Petri di vetro riutilizzabile. Favorire la deposizione delle uova applicando una leggera pressione sulla parte bassa della schiena vicino alla cloaca. Appoggiare il piatto a circa 45 gradi per consentire alle uova di raccogliersi lungo il bordo del piatto.

Quindi, rimuovete il tampone in eccesso e aggiungete un terzo di X MMR sufficiente a coprire a malapena le uova. Usando un pestello ben aderente, macerare e omogeneizzare 1/4 di testicolo in un tubo da 1,5 millilitri con 500 microlitri di soluzione salina modificata di Barth, o MBS, ad alto contenuto di sale. Quindi aggiungere il testicolo macerato alle uova e lasciare che la fecondazione avvenga a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, inondate le uova con un terzo di X MMR. Quindi, da cinque a 10 minuti dopo, confermare la fecondazione controllando la contrazione del palo animale pigmentato scuro e ruotando gli embrioni con i poli animali rivolti verso l'alto. Utilizzando una pipetta di plastica a foro largo, rimuovere diligentemente gli ovuli morti, lisati o non fecondati e non scissi, poiché indurranno rapidamente la morte negli embrioni vicini.

Da una a 2,5 ore dopo la fecondazione, gli embrioni di dejelly in cisteina dal due al tre percento si sono disciolti in un terzo X MMR, che è stato regolato a pH 7,9. Prima della degelatina, gli embrioni occupano un volume relativamente grande. Eseguire due cambi di buffer per tre o quattro minuti ciascuno.

Quindi, lavare accuratamente gli embrioni con 6-10 brevi cambi di un terzo di X MMR per rimuovere tutte le tracce di cisteina. Dopo la degelizzazione, gli embrioni si impacchettano strettamente e occupano un volume relativamente piccolo. Successivamente, utilizzando una pipetta di vetro a foro largo, trasferire gli embrioni sani e fecondati in una capsula di Petri contenente un terzo di X MMR fresco.

E a temperatura ambiente, lasciali sviluppare fino allo stadio desiderato. Continuare a rimuovere gli embrioni morti o lisati come indicato da una mancanza di prima divisione o da un aspetto bianco e gonfio. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio da 11,5 a 12, trasferirli in un terzo X MMR fresco integrato con cicloesimide 0,5 millimolare e incubare gli embrioni a temperatura ambiente per un'ora per arrestarli nell'interfase tardiva.

Con una pipetta di vetro o di plastica a foro largo, trasferire un minimo di 15 embrioni arrestati per interfase in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere agli embrioni un millilitro di tampone per la lisi degli ovuli, o ELB, integrato con un microlitro di stock LPC. Capovolgere delicatamente il tubo per lavare gli embrioni.

Quindi lasciare che gli embrioni cadano sul fondo del tubo. Prima di rimuovere il tampone, ripetere il lavaggio altre due volte. Risospendere gli embrioni in 500 microlitri di ELB, più 0,5 microlitri di LPC, 5 microlitri di cicloesimide da 19,7 millimolari e 5 microlitri di citocalasi D da 35,5 millimolari per inibire la polimerizzazione dell'actina.

Centrifugare i campioni in una centrifuga da tavolo a 200 volte G per un minuto, quindi rimuovere il tampone in eccesso e utilizzare un pestello per schiacciare completamente gli embrioni. Posizionare i campioni frantumati in un rotore a secchiello oscillante e centrifugare a 10.000 volte G e 16 gradi Celsius per 10 minuti. Con un puntale per pipetta da 200 microlitri, forare lo strato lipidico dall'alto e, utilizzando un puntale pulito, rimuovere lo strato citoplasmatico centrale di colore ambrato in un tubo di dimensioni adeguate.

Integrare l'estratto di embrione con i seguenti reagenti. Quindi, capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Quindi, dopo aver visualizzato i nuclei embrionali endogeni nell'estratto preparando una zucca secondo il protocollo di testo, rimuovere i nuclei dall'estratto aggiungendo prima un volume uguale di ELB contenente i reagenti qui elencati.

Capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Centrifugare il campione in un rotore a secchiello oscillante a 17.000 volte G a 16 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, raccogliere il surnatante, facendo attenzione a evitare eventuali residui di lipidi nella parte superiore, e lasciare indisturbati i nuclei pellettati nella parte inferiore.

Prepara una zucca come descritto nel protocollo di testo per assicurarti che la maggior parte dei nuclei sia stata rimossa. Quindi utilizzare l'estratto fresco, o aliquotare il campione, e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Isolare i nuclei assemblati nell'estratto di uovo diluendo da 25 a 150 microlitri di nuclei preassemblati in un millilitro di ELB in una provetta da 1,5 millilitri.

Centrifugare a 1600 volte G e quattro gradi Celsius per tre minuti. Quindi rimuovere il tampone, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere al pellet un volume di estratto di embrione pari al volume originale di estratto di uovo e picchiettare delicatamente il tubo per rompere il pellet e risospendere i nuclei.

Incubare a temperatura ambiente per 90 minuti, picchiettando delicatamente la provetta per mescolare ogni 15-30 minuti. Dopo l'incubazione, picchiettare la provetta per risospendere i nuclei appena prima di aggiungere 500 microlitri di ELB con il 15% di glicerolo e il 2,6% di paraformaldeide. Capovolgere immediatamente la provetta e posizionare la provetta su un rotatore a temperatura ambiente per 15 minuti.

Preparare i tubi spin-down dotando i tubi di vetro a fondo tondo da 15 millilitri con inserti in plastica a fondo tondo. Aggiungere 5 millilitri di tampone a cuscino nucleare, quindi far cadere un vetrino coprioggetti circolare da 12 millimetri nel tubo, assicurandosi che sia piatto sopra l'inserto di plastica. Utilizzando un puntale per pipetta a foro largo, sovrapporre delicatamente la soluzione di nuclei fissati sopra il cuscino nucleare.

Centrifugarlo in un rotore a secchiello oscillante a 1.000 volte G e 16 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, utilizzare un aspiratore per rimuovere tutto il tampone e tenere l'inserto di plastica sulla parte superiore del tubo. Quindi, con un paio di pinze sottili, rimuovere il vetrino, avendo cura di notare il lato del vetrino su cui sono stati filati i nuclei.

Host fissare il vetrino coprioggetti in metanolo freddo per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferisci il vetrino coprioggetti, con i nuclei rivolti verso l'alto, su un foglio di pellicola di paraffina di plastica che riveste una grande capsula di Petri di plastica. Quindi posizionare salviette usa e getta bagnate lungo il lato del piatto per prevenire la disidratazione.

Con 500 microlitri di PBS NP40, reidratare i nuclei sul vetrino coprioggetti per cinque-10 secondi e aspirare. Quindi, sovrapporre con cura 75 microlitri di PBS 3%BSA sul vetrino coprioggetti e lasciarlo bloccare a temperatura ambiente per un'ora, o quattro gradi Celsius durante la notte. Rimuovere il tampone bloccante e incubare con l'anticorpo primario diluito in PBS 3%BSA.

Quindi lavare i campioni con cinque cambi immediati di PBS NP40. Ripetere queste fasi di incubazione e lavaggio con anticorpi secondari. Incubare con 10 microgrammi per millilitro di Hoechst dilatato in PBS 3%BSA per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavare cinque volte con PBS NP40 e rimuovere tutto il tampone in eccesso. Infine, montare il vetrino coprioggetti su un vetrino con cinque microlitri di mezzo di montaggio anti-sbiadimento. Utilizzare uno smalto trasparente per sigillare il vetrino coprioggetti e ottenere immediatamente l'immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza o conservare a 40 gradi Celsius per l'imaging successivo.

Questa figura mostra l'assemblaggio dei nuclei dell'estratto di uovo. 30-45 minuti dopo l'inizio della reazione, i sottili nuclei spermatici a forma di S dovrebbero iniziare ad addensarsi in masse di cromatina a forma di lumaca. Dopo che si è verificato l'assemblaggio nucleare, la forma nucleare dovrebbe diventare più arrotondata e il volume nucleare dovrebbe aumentare man mano che l'involucro nucleare si espande e le proteine nucleari vengono importate.

Come mostrato qui, una zucca colorata di Hoechst di una piccola aliquota dell'estratto di embrione mostra molti nuclei colorati che indicano che la preparazione dell'estratto ha avuto successo. Dopo la rimozione dei nuclei mediante centrifugazione, rispetto alla prima zucca, dovrebbero essere rimasti pochissimi nuclei nell'estratto, come rivelato in questo pannello, assicurando che i nuclei endogeni non interferiscano con l'analisi a valle. Se i nuclei sono ancora presenti, è necessario un secondo ciclo di centrifugazione.

In questo test di restringimento nucleare, i nuclei dell'estratto di uova risospesi nell'estratto embrionale in fase avanzata, diventano più piccoli con successo nel tempo. Tuttavia, i nuclei incubati con estratto di embrione inattivato termicamente non lo fanno. Ripetere l'esperimento più volte è importante per affrontare la variabilità intrinseca del test.

Una volta padroneggiato, l'intero protocollo può essere eseguito in due giorni con il test di restringimento nucleare stesso che richiede circa quattro ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare la qualità degli ovuli e degli embrioni e di fare molta attenzione a evitare gli strati di pellet e lipidi quando si raccoglie l'estratto citoplasmatico dopo la centrifugazione. I risultati ottenuti seguendo questa procedura devono essere convalidati.

Ad esempio, la mia microiniezione di embrioni o la trasfezione di colture cellulari. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per esplorare la regolazione delle dimensioni di altri organelli. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule nucleari per esplorare i meccanismi di regolazione delle dimensioni nucleari e il ruolo funzionale delle dimensioni nucleari nello sviluppo e nella cancerogenesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare e isolare i nuclei dell'estratto di uovo di Xenopus, generare embrioni di Xenopus ed estratto di embrioni, eseguire il test di restringimento nucleare e visualizzare i risultati.