Un test cellulare gratuitamente utilizzando

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare estratti di uova ed embrioni di Xenopus per produrre un saggio in cui nuclei più grandi riducono di dimensione nuclei più piccoli. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla biologia cellulare del nucleo, ad esempio quali sono i meccanismi che regolano le dimensioni nucleari? Il principale vantaggio di questa tecnica è che la composizione e le attività dell'estratto acellulare di Xenopus possono essere facilmente modificate per valutare i fattori che influenzano le dimensioni nucleari.

Dopo aver preparato estratti di uova di Xenopus, spermatozoi desmembranati e nuclei assemblati secondo il protocollo descritto, raccogliere uova appena deposte tenendo le rane sopra una capsula di Petri in vetro riutilizzabile. Stimolare la deposizione delle uova applicando una leggera pressione sulla parte bassa della schiena vicino alla cloaca. Inclinare la capsula a circa 45 gradi per permettere alle uova di accumularsi lungo il bordo del recipiente.

Quindi, rimuovere il tampone in eccesso e aggiungere una quantità sufficiente di MMR a un terzo di X per coprire appena le uova. Utilizzando un pestello ben aderente, macerare e omogeneizzare un quarto di un testicolo in una provetta da 1,5 millilitri con 500 microlitri di soluzione salina di Barth modificata ad alto contenuto salino, o MBS. Successivamente, aggiungere il testicolo macerato alle uova e lasciare avvenire la fecondazione a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, ricoprire le uova con un terzo di X MMR. Quindi, da cinque a dieci minuti dopo, verificare la fecondazione controllando la contrazione del polo animale pigmentato scuro e la rotazione degli embrioni con i poli animali rivolti verso l'alto. Utilizzando una pipetta di plastica a largo foro, rimuovere con attenzione le uova morte, lisate o non fecondate e non divise, poiché indurranno rapidamente la morte negli embrioni adiacenti.

Da uno a 2,5 ore dopo la fecondazione, rimuovere la membrana gelatinosa degli embrioni utilizzando una soluzione di cisteina al due-tre percento disciolta in MMR un-terzo X, aggiustata a pH 7,9. Prima della rimozione della membrana gelatinosa, gli embrioni occupano un volume relativamente ampio. Eseguire due cambi di tampone, ciascuno della durata di tre-quattro minuti.

Quindi, lavare accuratamente gli embrioni con sei-dieci cambi brevi di MMR a un terzo di concentrazione per rimuovere ogni traccia di cisteina. Dopo la rimozione della membrana gelatinosa, gli embrioni si compattano strettamente e occupano un volume relativamente ridotto. Successivamente, utilizzando una pipetta di vetro a largo diametro, trasferire embrioni sani e fecondati in una piastra di Petri contenente MMR fresco a un terzo di concentrazione.

A temperatura ambiente, lasciarli sviluppare fino allo stadio desiderato. Continuare a rimuovere gli embrioni morti o lisiati, riconoscibili dall'assenza della prima divisione o dall'aspetto bianco e gonfio. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio 11,5-12, trasferirli in MMR fresco diluito a un terzo e integrato con cicloesessimide 0,5 millimolare e incubare gli embrioni a temperatura ambiente per un'ora per arrestarli in fase intermedia tardiva.

Con una pipetta in vetro o plastica a largo diametro, trasferire almeno 15 embrioni arrestati in interfase in una provetta microcentrifuga. Aggiungere un millilitro di buffer per la lisi delle uova, o ELB, integrato con un microlitro di soluzione stock di LPC agli embrioni. Capovolgere delicatamente la provetta per lavare gli embrioni.

Quindi lasciare sedimentare gli embrioni sul fondo del tubo. Prima di rimuovere il buffer, ripetere il lavaggio altre due volte. Risospendere gli embrioni in 500 microlitri di ELB, aggiungendo 0,5 microlitri di soluzione madre di LPC, 5 microlitri di cicloesimide 19,7 millimolare e 5 microlitri di citocalasina D 35,5 millimolare per inibire la polimerizzazione dell'actina.

Centrifugare i campioni in una centrifuga da banco a 200 ×g per un minuto, quindi rimuovere il buffer in eccesso e utilizzare una pestella per frantumare completamente gli embrioni. Posizionare i campioni frantumati in un rotore a cestelli oscillanti e centrifugare a 10.000 ×g e 16 °C per 10 minuti. Con una punta di pipetta da 200 microlitri, perforare lo strato lipidico dal lato superiore e, utilizzando una punta di pipetta pulita, trasferire lo strato citoplasmatico di colore ambrato intermedio in un tubo di dimensioni adeguate.

Integrare l'estratto embrionale con i seguenti reagenti. Quindi, capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Successivamente, dopo aver visualizzato i nuclei embrionali endogeni nell'estratto preparando uno striscio secondo il protocollo descritto nel testo, rimuovere i nuclei dall'estratto aggiungendo innanzitutto un volume uguale di ELB contenente i reagenti elencati qui.

Rovesciare delicatamente il tubo per mescolare. Centrifugare il campione in un rotore a cestelli oscillanti a 17.000 × g a 16 °C per 15 minuti. Successivamente, raccogliere il soprannatante, avendo cura di evitare qualsiasi residuo lipidico in superficie, lasciando intatto il pellet di nuclei sul fondo.

Preparare una poltiglia come descritto nel protocollo testuale per assicurarsi che la maggior parte dei nuclei sia stata rimossa. Successivamente, utilizzare l'estratto fresco oppure aliquotare il campione e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Isolare i nuclei assemblati nell'estratto uovo diluendo da 25 a 150 microlitri di nuclei pre-assemblati in un millilitro di ELB in un tubo da 1,5 millilitri.

Centrifugare a 1600 ×g e 4 °C per tre minuti. Quindi rimuovere il tampone, avendo cura di non disturbare il pellet. Aggiungere al pellet un volume di estratto di embrione pari al volume originale dell'estratto di uovo, e battere delicatamente il tubo per disintegrare il pellet e risospendere i nuclei.

Incubare a temperatura ambiente per 90 minuti, agitando delicatamente il tubo per mescolare ogni 15-30 minuti. Al termine dell'incubazione, agitare il tubo per risospendere i nuclei subito prima di aggiungere 500 microlitri di ELB con il 15% di glicerolo e il 2,6% di paraformaldeide. Capovolgere immediatamente il tubo e posizionarlo su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 15 minuti.

Preparare le provette per la centrifugazione posizionando inserti di plastica a fondo rotondo all'interno di provette di vetro da 15 millilitri con fondo rotondo. Aggiungere 5 millilitri di tampone per il cuscino nucleare, quindi inserire delicatamente una coprioggetto circolare da 12 millimetri nella provetta, assicurandosi che si adagi piatta sulla superficie dell'inserto di plastica. Utilizzando una punta per pipetta a grande apertura, stratificare delicatamente la soluzione di nuclei fissati sopra il cuscino nucleare.

Centrifugare in un rotore a cestello oscillante a 1.000 × g e 16 °C per 15 minuti. Successivamente, utilizzare un aspiratore per rimuovere tutto il tampone e tenere l'inserto di plastica in alto rispetto al tubo. Quindi, con una pinzetta fine, rimuovere il vetrino, avendo cura di notare il lato del vetrino su cui sono stati centrifugati i nuclei.

Fissare il vetrino in metanolo freddo per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire il vetrino, con il lato dei nuclei rivolto verso l'alto, su un foglio di pellicola di paraffina plastica che riveste una grande piastra di Petri in plastica. Quindi posizionare salviette monouso umide lungo i bordi della piastra per prevenire la disidratazione.

Riidratare i nuclei sul coverslip con 500 microlitri di PBS NP40 per cinque-dieci secondi e aspirare. Quindi, stratificare attentamente 75 microlitri di PBS con BSA al 3% sul coverslip e lasciare bloccare a temperatura ambiente per un'ora o a quattro gradi Celsius durante la notte. Rimuovere il buffer di bloccaggio e incubare con l'anticorpo primario diluito in PBS con BSA al 3%.

Quindi lavare i campioni con cinque cambi immediati di PBS NP40. Ripetere questi passaggi di incubazione e lavaggio con gli anticorpi secondari. Incubare con 10 microgrammi per millilitro di Hoechst diluito in PBS 3% BSA per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavare cinque volte con PBS NP40 ed eliminare tutto il tampone in eccesso. Infine, montare il coverslip su un vetrino con cinque microlitri di mezzo di montaggio anti-sfaldamento. Usare smalto per unghie trasparente per sigillare il coverslip e acquisire immediatamente le immagini mediante microscopio a epifluorescenza oppure conservare a 40 gradi Celsius per successive acquisizioni.

Questa figura mostra l'assemblaggio dei nuclei nell'estratto di uovo. Da 30 a 45 minuti dopo l'inizio della reazione, i nuclei spermatici sottili a forma di S dovrebbero cominciare ad ispessirsi formando masse di cromatina simili a lumache. Dopo che è avvenuto l'assemblaggio nucleare, la forma nucleare dovrebbe diventare più arrotondata e il volume nucleare dovrebbe aumentare con l'espansione dell'involucro nucleare e l'importazione delle proteine nucleari.

Come mostrato qui, uno schiacciamento colorato con Hoechst di un piccolo aliquota dell'estratto di embrione mostra molti nuclei colorati, indicando che la preparazione dell'estratto è stata efficace. Dopo la rimozione dei nuclei mediante centrifugazione, rispetto al primo schiacciamento, dovrebbero rimanere pochissimi nuclei nell'estratto, come rivelato in questo pannello, assicurando che i nuclei endogeni non interferiscano con le analisi successive. Se i nuclei sono ancora presenti, è necessario un secondo ciclo di centrifugazione.

In questo saggio di riduzione nucleare, i nuclei dell'estratto uovo sospesi in un estratto di embrione in stadio avanzato diventano con successo più piccoli nel tempo. Tuttavia, i nuclei incubati con estratto di embrione inattivato termicamente non lo fanno. Ripetere l'esperimento più volte è importante per affrontare la variabilità intrinseca del saggio.

Una volta acquisita padronanza, l'intero protocollo può essere eseguito in due giorni, con il saggio di riduzione nucleare che richiede circa quattro ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordarsi di verificare periodicamente la qualità delle uova e degli embrioni ed essere molto accurati nel evitare il pellet e gli strati lipidici durante il prelievo dell'estratto citoplasmatico dopo la centrifugazione. I risultati ottenuti seguendo questa procedura dovrebbero essere convalidati.

Ad esempio, la microiniezione di embrioni o la trasfezione di colture cellulari. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare la regolazione della dimensione di altri organelli. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare nucleare per esplorare i meccanismi regolatori della dimensione nucleare e il ruolo funzionale della dimensione nucleare nello sviluppo e nella carcinogenesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare e isolare nuclei da estratto di uovo di Xenopus, generare embrioni di Xenopus ed estratto di embrione, eseguire il saggio di riduzione della dimensione nucleare e visualizzare i risultati.