Name: Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario delluomo epiteliali bronchiali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri come ottenere un'alta efficienza di trasduzione in cellule epiteliali bronchiali primarie umane utilizzando lentivirus. Questo metodo mantiene l'efficienza durante la differenziazione in epitelio pseudostratificato.

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Ringraziamo l&#39;Alleanza Organo Agenzia Recupero Vita dell&#39;Università di Miami per la fornitura di polmoni. Ringraziamo anche il Dr. Lisa Künzi per la preparazione del DNA usato per gli esperimenti mostrati nella Figura 2B e 3-D, il Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak per il virus mCherry utilizzato per gli esperimenti nelle figure 3A a C. Ringraziamo anche Gabriel Gaidosh dalla struttura di imaging, Dipartimento di Oftalmologia presso l&#39;Università di Miami. Questo studio è stato sponsorizzato da finanziamenti del NIH, la Fondazione CF e l&#39;assistente di volo Medical Research Institute di Dr. Matthias Salathe.

1. Fase 1: cultura di HEK 293T <ol><li> Preparare cellule HEK supporti (denominato come HEK media) aggiungendo 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina ad alto glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM). </li><li> Cappotto uno 10 centimetri piatto di coltura di tessuti con collagene I. Mix 30 ml di collagene I in 2 ml di acqua distillata. Stendere l&#39;impasto sul piatto e incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Rimuovere la miscela e lasciare asciugare piatto in una cappa a flusso laminare per 15 min. </li><li> Cellule HEK piastra nel piatto rivestito ad una densità di celle 1 x 10 6 a 10 ml mezzi HEK e incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Quando le cellule HEK sono 50-60% confluenti (Figura 1a, 2-3 giorni dopo la placcatura), passare alla fase 2. Valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione. Nota: cellule HEK sono coltivate in mezzi HEK (vedi sopra). Quando raggiungono confluenza, they può essere suddiviso (ad esempio 1/5) o congelati verso il basso per un uso successivo. </li></ol> 2. Fase 2: Produzione e la concentrazione di lentivirus (LV) in cellule HEK Nota: I protocolli devono essere eseguiti in linea con le normative istituzionali e governative in + (Enhanced BSL-2) le condizioni negli Stati Uniti BSL-2. <ol><li> Trasfezione utilizzando una procedura di precipitazione di calcio (Lipofectamine e altri agenti di trasfezione non fosse efficiente come la procedura di precipitazione di calcio). Si consiglia l&#39;uso di un kit trasfezione commerciale per garantire la riproducibilità, anche se la procedura è modificato come segue. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente. Questo è il giorno 0. </li><li> Per ogni 10 centimetri piatto di cellule HEK293, mescolare 4,5 mg di busta DNA PMD2-VSVG, 7,5 mg il confezionamento di DNA pMDLg / pRRE, 3,75 mg di DNA pRSV-rev, 10 mg di DNA di vettori lentivirali di espressione, di 86 ml di una soluzione 2 M di calcio e acqua sterile in un tubo da centrifuga da 15 ml per un volume finale di 700 microlitri(Questi ultimi due soluzioni vengono forniti nel kit trasfezione commerciale). </li><li> Goccia a goccia, aggiungere 700 ml di soluzione fisiologica 2x HEPES-buffered (HBS, forniti nel kit trasfezione), mentre vortex (nella cappa a flusso laminare) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti (eseguire il passaggio 4 durante l&#39;attesa). </li><li> Durante il tempo di incubazione presto, deposito 5 microlitri della miscela su un vetrino. Controllare la goccia sotto un microscopio con un obiettivo 10X, concentrandosi lentamente su e giù. Un bel precipitato deve essere visibile, a conferma del processo di precipitazione di fosfato di calcio (Figura 1b). </li><li> Fermare la precipitazione dopo 30 minuti con l&#39;aggiunta di 10 ml di HEK cellule media e pipetta su e giù per mescolare. </li><li> Prendete il piatto di cellule HEK dal passaggio 2,1-2,5, e rimuovere il supporto (giorno 0). Aggiungere la soluzione precipitato dal punto 2.5 attentamente e lentamente lungo il bordo del piatto. </li><li> Il giorno successivo (giorno 1), rimuovere ed eliminare il supporto contenente il precipitato e sostituirlo wesimo 10 ml di terreno HEK. Controllare per fini precipitato sotto il microscopio: dovrebbe essere visibile nel piatto in spazi vuoti tra le cellule (Figure 1C e d). </li><li> Il giorno 2, raccogliere media con una siringa, filtro attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 3,8 ml di un glicole polietilene 40% soluzione (PEG). Inverti 5x per mescolare e conservare a 4 ° C per almeno 24 ore (per il PEG precipitare in modo da formare, ma non più di 5 giorni) fino a quando tutte le collezioni di virus sono completi. </li><li> Ripetere il passaggio 2.8 nei giorni 3 e 4. Il giorno 4 non sostituirli con media HEK ma decontaminare con il 10% di candeggina e scartare il piatto. </li><li> Centrifugare tutte le provette per la raccolta (in genere tutte le collezioni insieme il giorno 5) a 1.650 xg per 20 minuti a 4 ° C a pellet il virus. Rimuovere e scartare il surnatante, e far girare di nuovo a 1.650 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere e rimuovere ogni residuo di PEG surnatante. </li><li> Resuspend il pellet di ogni tubo in 200 ml di bronchiale mezzo di crescita epiteliale (BEGM) senza amfotericina B 8. riunirli e aliquota a 200 ml. virus Conservare a -80 ° C. Aliquota altri 10 ml di eseguire il test Gag di HIV-1 (p24) l&#39;antigene ELISA. </li><li> Utilizzando un kit commerciale ELISA, eseguire un test dell&#39;antigene p24 secondo il protocollo del produttore. Il test fornisce una stima della p24 virale in pg / ml. </li></ol> 3. Fase 3: cellule di coltura HBE primaria <ol><li> Cellule Piatto HBE in 10 ml BEGM supporti (con 100 microlitri amfotericina B se il passaggio 0 cellule sono utilizzati per eliminare eventuali contaminazioni fungine) ad una densità di celle 1 x 10 6 in collagene I spalmato 10 centimetri piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere il supporto e sostituire con 10 ml BEGM (con 100 ml amfotericina B per il passaggio 0 cellule) per un totale di 4 giorni. Ritorno a incubatore. </li><li> Dopo 4 dAYS, utilizzare solo BEGM senza amfotericina B. Cambio media ogni due giorni. </li><li> Quando le cellule sono 80-90% confluenti (figura 2a; ~ 7 giorni dopo la placcatura), procedere con la trasduzione (prestare attenzione a 3,5 per la preparazione prima trasduzione). Ancora una volta, valutazione visiva di confluenza è sufficiente. Non è necessaria alcuna quantificazione. </li><li> Prima di trasduzione, cappotto gli inserti di supporto permeabili con una soluzione di collagene IV diluita 1/10 con acqua distillata sterile. Aggiungere 200 microlitri di ogni inserto e lasciare asciugare per una notte nella cappa a flusso laminare. </li></ol> 4. Fase 4: trasduzione delle cellule HBE <ol><li> Rimuovere supporti, aggiungere 3 ml di 0,1% tripsina in 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico in tampone fosfato isotonico (EDTA / PBS) e incubare 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare al microscopio (obiettivo 10X) per vedere se tutte le celle sono staccati. In caso contrario, tornare alla incubatore per un ulteriore 5 min. </li><li> Quando tutte le cellule sono staccati, aggiungere 3ml di inibitore della tripsina di soia (SBTI 1 mg / ml), mescolare e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Agglomerare le cellule facendo girare a 460 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di BEGM e procedere con il conteggio. </li><li> Risospendere le cellule HBE (ora di passaggio 1 o P1) in un rapporto di 2 x 10 5 cellule per un inserto di supporto permeabile 12 millimetri in 400 ml di BEGM (vedi tabella 2). Estrapolare questi numeri in base alla quantità di inserti di supporto permeabili che verranno trasdotte. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Superficie </td><td> Superficie </td><td> conta delle cellule </td><td> media </td><td> Volume (media) </td></tr><tr><td> 10 centimetri piatto </td><td> 52,7 cm 2 </td><td> 1 x 10 6 </td><td> BEGM </td><td> 10 ml </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Filtro 12 millimetri </td><td> 1.13 cm 2 </td><td> 2 x 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 400 ml </td></tr><tr><td> Filtro 24 millimetri </td><td> 4.52 cm 2 </td><td> 8 x 10 5 </td><td> BEGM </td><td> 800 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2: media estrapolazione per il conteggio delle cellule. <ol start="5"><li> Utilizzando una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungere il volume appropriato di virus alla sospensione cellulare. </li><li> Aggiungere bromuro hexadimethrine a 2 mg / ml concentrazione finale. </li><li> Dispensare 400 microlitri della miscela (BEGM, HBE cellule, virus e hexadimethrine bromuro) per inserto supporto permeabile nel vano apicale, e aggiungere 1 ml di BEGM solo al vano basolaterale. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO 2. cellule Sempre piastra HBE senza virus come il controllo e la selezione di test puromicina, se applicabile. </li><li> Il giorno successivo, remmezzi apicale e basolaterale ove, lavare con PBS, e sostituire entrambi i comparti con l&#39;interfaccia aria-liquido (ALI) supporto 8. </li><li> Quando le cellule sono confluenti, rimuovere il liquido apicale (noto come stabilire una interfaccia aria-liquido). Continuare cambiando il mezzo (ALI) nel comparto inferiore a giorni fino a raggiungere la piena maturità; di solito da 3 a 4 settimane dopo. Nota: Se il vettore lentivirale contiene un gene di selezione, come puromicina, le cellule possono essere selezionate aggiungendo puromicina secondo una curva concentrazione selezione. Per le cellule HBE, una concentrazione di 1 mg / ml è stato determinato per essere ideale per la selezione consistente di cellule trasdotte. Tuttavia, questa concentrazione potrebbe differire per le altre cellule o condizioni e deve essere determinata uccidendo curve. L&#39;aggiunta di puromicina può iniziare già a partire un giorno dopo i media è stato sostituito dai media ALI o successivi (2-3 giorni) per consentire la piena espressione del gene di selezione. Assicurarsi di aggiungere puromicina a un inserto che hcome non è stata trasdotte. Puromicina può essere aggiunto finché le cellule sono completamente differenziate. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui delineato assicura quasi il 100% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, ci sono passaggi durante il processo che sono importanti per raggiungere questo obiettivo. Per esempio, durante il processo di trasfezione, la presenza di precipitati nel mix trasduzione (drop) o nel piatto il giorno dopo trasduzione (figure 1b e d) sono entrambi rilevanti per una buona trasfezione. L&#39;assenza di un precipitato o la presenza di agglomerati può essere dovuto ad una omissione di ...

Lo sviluppo di replica-difettose, lentivirus pseudotyped (LV) ha fornito ai ricercatori un metodo sicuro ed efficace per fornire transgeni in vitro 1. Grazie alla loro espressione a lungo termine, questi LV potrebbe essere utilizzato anche per l&#39;erogazione di agenti terapeutici in vivo 2,3. La produzione di LV richiede co-trasfezione di rene embrionali umane (HEK) cellule con diversi plasmidi: vettore di trasferimento, imballaggi gag / pol, imballaggi di giri, e la busta vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSV-G) plasmidi. Sistemi di imballaggio di terza generazione sono considerati più sicuri rispetto ai sistemi di seconda generazione perché il gene rev è codificato su un plasmide confezione separata, riducendo così la possibilità di ricombinazione per produrre un lentivirus competente replica. Anche se i sistemi di confezionamento di seconda generazione producono cinque unità di trasduzione totali superiori piega, la scissione del genoma virale originale per creareil sistema di terza generazione ha diminuito il livello di trasduzione solo minimamente 3,4. Mentre le linee cellulari possono essere trasdotte più semplice ed efficiente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per le cellule primarie, perché questi sono più rappresentativi di tessuti in vivo 5,6. Tuttavia, le cellule principali sono refrattari alla trasduzione. Mentre sono stati segnalati trasduzione di cellule delle vie aeree epiteliale completamente differenziate, l&#39;efficienza complessiva non sia superiore al 15% 7. Qui descritto è un protocollo che permette la produzione di LV alto titolo. Un approccio step-by-step è delineato per raggiungere quasi il 100% di efficienza di trasduzione in cellule HBE primarie. Più specificamente, il protocollo descrive le condizioni di coltura ottimali strumentali per riuscire 3. In breve, le cellule 293T HEK sono trasfettate utilizzando il lentivirale pCDH vettore di espressione con il EF-1 promotore di espressione di guida di una maggiore verde fluorescenteproteine ​​(eGFP) o mCherry, una proteina fluorescente rossa, e un sistema di confezionamento di terza generazione. LV rilasciate in media sono raccolti 24-72 ore più tardi. Le particelle virali sono concentrati con polietilene glicole (PEG), un metodo conveniente e facile della concentrazione virale, prima stima titolo utilizzando un kit di p24 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Successivamente, le cellule HBE primarie indifferenziate sono trasdotti in mezzi proliferazione (terreno di crescita epiteliale bronchiale o BEGM) 8, mentre si collega (dopo essere tripsinizzati), ad una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungendo hexadimethrine bromuro e incubando per 16 ore ( durante la notte). Le cellule sono poi lasciati differenziare. Poiché il transgene è espresso virale a lungo termine (utilizzando il promotore appropriato, vedere la discussione), espressione verrà mantenuta per tutto differenziazione in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato o può essere indotta (utilizzando un promotore inducibile) dopo la differenziazione. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Questo protocollo è di grande interesse per i ricercatori che desiderano utilizzare le cellule HBE primarie, invece di linee cellulari, e potrebbe essere adattabile ad altri difficili da trasdurre tipi di cellule.

<table><tbody><tr><td>HEK293T/17 cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>utilizzare al 10%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>utilizzare a 1x</td></tr><tr><td>Collagene I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>diluire 1:75 in acqua distillata</td></tr><tr><td>Calphos</td><td>Clontech</td><td>631312</td><td>Kit di trasfezione contenente 2 M di soluzione di calcio, 2x soluzione tamponata HEPES (HBS) e H2O sterile</td></tr><tr><td>Glicole politenico 8000</td><td>VWR scientific</td><td>101108-210</td><td>stock del 40% di</td></tr> <tr><td>amfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A9528</td><td>utilizzare a 1x</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 12 mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C7521</td><td>diluito 1:10 in acqua distillata</td></tr><tr><td>Bmidrato di esadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>stock di 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Puromicina (10.000x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11138-03</td><td>uso a 1x</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td><td>System Biosciences</td><td>CD532A-2</td><td>vettore di espressione lentivirale</td></tr><tr><td>pMD2-VSVG</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>imballaggio DNA</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td>imballaggio DNA</td></tr><tr><td>pRSV-rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td>imballaggio DNA</td></tr></tbody></table>

ottimale lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell&#39;uomo epiteliali bronchiali

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In coltura in vitro di cellule primarie umane epiteliali bronchiali (HBE) utilizzando condizioni di interfaccia aria-liquido fornisce un modello utile per studiare i processi di differenziazione cellulare delle vie aeree e la funzione. Negli ultimi anni, l&#39;uso di vettori lentivirali per la consegna transgene diventata pratica comune. Mentre ci sono segnalazioni di trasduzione di cellule epiteliali delle vie aeree completamente differenziate con alcuni lentivirus pseudo-digitato non-HIV, l&#39;efficienza complessiva di trasduzione è di solito inferiore al 15%. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per produrre lentivirus e di trasdurre cellule epiteliali bronchiali umane primarie. Usando cellule epiteliali bronchiali indifferenziate, trasduzione in terreni di crescita epiteliale bronchiale, mentre le cellule attaccano, con una molteplicità di infezione di fattore 4 fornisce efficienze vicino al 100%. Questo protocollo descrive, passo dopo passo, la preparazione e la concentrazione di vettori lentivirali alto titolo e esimoprocesso di trasduzione e. Si discute gli esperimenti che hanno determinato le condizioni di coltura ottimali per raggiungere trasduzione altamente efficienti di cellule epiteliali bronchiali umane primarie.

La figura 1 illustra diversi passaggi chiave della valutazione cellule e soluzioni durante il processo di trasfezione. Figura 1A mostra la confluenza ottimale delle cellule HEK293T prima trasfezione per produzione di virus. È importante che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il piatto. Figura 1b rivela il precipitato in una goccia della miscela di trasfezione usando ottica in campo chiaro e un obiettivo 10X. Quanto più i ...

Le cellule epiteliali bronchiali umane primarie sono difficili da trasdurre. Questo protocollo descrive la produzione di lentivirus e la loro concentrazione, nonché le condizioni di coltura ottimali necessarie per ottenere trasduzioni altamente efficienti in queste cellule durante la differenziazione in un epitelio pseudostratificato.

Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell&#39;uomo epiteliali bronchiali

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è ottenere una trasduzione altamente efficiente di cellule epiteliali bronchiali primarie umane mediante l'utilizzo di lentivirus. Questo metodo può essere utile per i ricercatori che desiderano utilizzare cellule epiteliali bronchiali primarie umane anziché linee cellulari, e potrebbe essere adattabile ad altri tipi cellulari difficili da trasdurre. Il principale vantaggio di questa tecnica è un'elevata efficienza di trasduzione mantenuta durante tutta la differenziazione in un epitelio pseudostratificato.Il protocollo deve essere eseguito nel rispetto delle normative istituzionali e governative, in condizioni di BSL-2 potenziato negli Stati Uniti. Dopo aver preparato il mezzo per HEK in una piastra rivestita con Collageno I, secondo il protocollo descritto, utilizzare 10 millilitri di mezzo per seminare un milione di cellule HEK nella piastra rivestita. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 50-60%.Questo sarà considerato il Giorno 0. Al Giorno 0, all'interno di una cappa a flusso laminare, utilizzando un kit commerciale di trasfezione, portare i reagenti

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Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Lentivirus Produzione

Qui si descrive un metodo dettagliato per la coltivazione primaria cellule epiteliali bronchiali umane da espianti di tessuti umani delle vie aeree bronchiali tra cui la crescita differenziati su un aria-liquido. Questo metodo fornisce una fonte abbondante di cellule primarie per indagare il ruolo dell'epitelio delle vie aeree dei polmoni umani nella salute e nella malattia.

Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

Lentivirus sono un valido strumento di ricerca per esplorare la funzione del gene, tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione di codifica lentivirus pantropic oncogeni noti o sospetti. In alternativa, vi presentiamo un protocollo più sicuro per l'utilizzo del lentivirus ecotropic su cellule umane modificate per esprimere la mSlc7a1 ecotropic recettore.

Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

Vettori di espressione lentivirali sono i veicoli più efficaci per esprimere stabilmente diverse molecole effettrici o costrutti reporter nel dividere e non la divisione delle cellule di mammiferi e di interi organismi. Qui forniamo un protocollo su come confezionare costrutti di espressione lentivector particelle pseudoviral e di trasdurre cellule bersaglio utilizzando le particelle pseudoviral.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

Qui, usiamo trasduzione retrovirale e trasfezione concatemeric per creare una linea cellulare che può esprimere le componenti di un vettore lentivirale (LV) in assenza di tetraciclina. Questo LV codifica GFP ed è pseudotyped con una glicoproteina, SVGmu, che è specifico per un recettore sulle cellule dendritiche.

Una linea cellulare tetraciclina regolata produce vettori lentivirali ad alto titolo che si rivolgono specificamente cellule dendritiche

Qui presentiamo protocolli che offrono una base flessibile e strategica per manipolare viralmente le cellule precursori degli oligodendrociti per sovraesprimere proteine di interesse al fine di interrogare specificamente il loro ruolo negli oligodendrociti attraverso il modello in vitro di mielinizzazione del sistema nervoso centrale.

Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Questo protocollo descrive un metodo per realizzare l'integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano di sistema Sleeping Beauty trascrizionalmente regolato. Preparazione dell'integrazione dei vettori lentivirali difettosi, la trasduzione in vitro di cellule umane e l'analisi molecolare sulle cellule trasdotte sono segnalati.

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

Qui vengono presentati protocolli dettagliati per coltura la linea 32D/G-CSF-R cellula precursore mieloide murino, eseguendo le infezioni virali e svolgere le analisi di proliferazione e differenziazione. Questa linea cellulare è adatta per lo studio dello sviluppo delle cellule mieloidi e il ruolo dei geni di interesse in crescita delle cellule mieloidi e differenziazione neutrophilic.

Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo descrive in dettaglio un'indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

Scopri come ottenere un'alta efficienza di trasduzione in cellule epiteliali bronchiali primarie umane utilizzando lentivirus. Questo metodo mantiene l'efficienza durante la differenziazione in epitelio pseudostratificato.

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Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell'uomo epiteliali bronchiali

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