Il nervo del perone Metodo Injury: Un test affidabile di individuare e testare i fattori che Repair neuromuscolari giunzioni

L'obiettivo generale di questo metodo di lesione dei nervi periferici è esaminare in modo affidabile le giunzioni neuromuscolari rigeneranti nei topi. Questo metodo ci aiuterà a identificare i cambiamenti molecolari, cellulari e funzionali associati alla rigenerazione delle giunzioni neuromuscolari. Il vantaggio principale di questa procedura è che il tasso di rigenerazione della giunzione neuromuscolare può essere confrontato in modo affidabile tra i gruppi sperimentali in gran parte in assenza di cambiamenti miogenici.

A dimostrare la procedura sarà William Dalkin, uno studente di medicina del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, utilizzare etanolo all'80% per pulire il sito chirurgico, la tavola e gli strumenti, seguita dalla disinfezione con iodio povidone. Quindi, posiziona il mouse sulla tavola chirurgica e conferma la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.

Allineare gli arti all'interno dei sistemi di ritenuta con l'arto posteriore bersaglio in una posizione anatomicamente naturale e le articolazioni del ginocchio leggermente estese senza rotazione interna o esterna. Quindi, trasferire l'animale sotto un microscopio operatorio e regolare la tavola fino a quando l'articolazione ossea del ginocchio e la cresta tra i muscoli tibiale anteriore e gastrocnemio sono visibili attraverso l'obiettivo. Usando un bisturi e una pinza, praticare un'incisione di circa tre centimetri attraverso la pelle, perpendicolare al decorso sottostante del nervo peroneale comune.

Continuare l'incisione attraverso la fascia superficiale esponendo i muscoli bicipite femorale e vasto laterale, seguita da un'incisione di uno o due centimetri attraverso la fascia profonda di collegamento per separare i muscoli. Successivamente, utilizzare divaricatori meccanici per arretrare il muscolo bicipite femorale caudalmente per rivelare il nervo peroneale comune. Tracciare il nervo prossimalmente fino a quando non si trova la sua intersezione con il tendine della testa laterale del muscolo gastrocnemio.

Quindi, usa una pinza sottile per afferrare il nervo allineando le punte parallele al bordo laterale del tendine del gastrocnemio e applica una pressione costante e concentrata per cinque secondi per schiacciare il nervo peroneale comune. Tenendo la pinza perpendicolare alla fibra, afferrare il tessuto con l'area appena dietro la punta della pinza e applicare una pressione decisa, ma delicata, per uno schiacciamento pulito e lineare del nervo lungo il bordo del tendine. Ispezionare visivamente il nervo attraverso il microscopio operatorio per confermare un completo schiacciamento del tessuto.

Il nervo apparirà traslucido nel sito della lesione. Se vengono utilizzati topi che esprimono proteine di fluorescenza negli assoni periferici, la fluorescenza scomparirà dal sito della lesione. Se il nervo è stato sufficientemente danneggiato, rimuovere i divaricatori e riallineare i muscoli nelle loro posizioni anatomiche.

Quindi, utilizzare suture di seta 6-0 per chiudere il sito di incisione con una o tre semplici suture interrotte e posizionare il mouse su un termoforo in una gabbia pulita con monitoraggio fino a quando non si è completamente ripreso. La compressione del nervo per cinque secondi con una pinza fine provoca la scomparsa di YFP dal sito della lesione. L'epinevrio rimane contiguo, fungendo da condotto per la rigenerazione precisa degli assoni ai loro bersagli originali.

Nei topi femmina di 70 giorni, la lesione nervosa è sufficiente a causare la degenerazione di tutti i segmenti assonali distali dal soma neuronale, a quattro giorni dopo lo schiacciamento. Entro sette giorni dalla frantumazione, le terminazioni nervose stanno attivamente rioccupando i siti post-sinaptici liberati. Il giorno 12, le terminazioni nervose continuano a differenziarsi in siti pre-sinaptici e le giunzioni neuromuscolari sono completamente reinervate.

C'è poca variabilità tra i topi denervati per lo stesso periodo di tempo, dimostrando che lo schiacciamento del nervo fibulare può essere utilizzato come test per confrontare la reinervazione dei muscoli tra animali della stessa età e sesso. Come previsto, si verificano una serie di cambiamenti negli assoni alfamotori mentre reinervano le fibre muscolari. I coni di crescita assonale si espandono e si ramificano quando entrano in contatto con i siti post-sinaptici, crescendo su specifiche regioni della post-sinapsi e culminando nella giustapposizione quasi completa delle terminazioni assonali con i siti post-sinaptici.

Come dimostrato dalla PCR quantitativa, i geni associati alla giunzione neuromuscolare aumentano dopo la denervazione e diminuiscono man mano che le giunzioni neuromuscolari vengono reinervate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 15 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prendersi il proprio tempo, visualizzare tutte le strutture e ricontrollare che sia stata ottenuta una cotta completa.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la QPCR per rispondere a ulteriori domande su quali geni vengono regolati verso l'alto o verso il basso. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare le rigenerazioni sinaptiche nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire uno schiacciamento del nervo fibulare per esaminare i tassi di reinervazione della giunzione neuromuscolare nei topi.