Name: Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Scopri come generare macrofagi alveolari e cellule dendritiche da midollo osseo di topo con GM-CSF. Questo metodo permette di distinguere i tipi cellulari e studiare le loro funzioni nel sistema immunitario.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (Grant MOP-119503) e le scienze e ingegneria Consiglio Naturale del Canada (NSERC). NSERC supportato anche borse di studio estive per YD e AA YD è sostenuto dalla University of British Columbia (UBC), con un premio borsa di studio di 4 anni, AA è supportato da CIHR con il premio di Master studente laureato (CGS-M). Ringraziamo Calvin Roskelley per l&#39;assistenza con il microscopio utilizzato per generare le immagini nella Figura 2. Riconosciamo inoltre sostegno da parte dei UBC animali e citometria a flusso strutture.

I topi sono stati sacrificati in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali per la ricerca animale etica da procedure approvate dalla University of Columbia Comitato Animal Care britannico. 1. L&#39;acquisizione di una singola cella di midollo osseo Sospensione dal mouse femore e tibia <ol><li> Accendere una cappa di sicurezza biologica (BSC) 15 minuti prima dell&#39;inizio della procedura per eliminare l&#39;aria mobile e consentire la stabilizzazione del flusso d&#39;aria, quindi pulire / spruzzo superficie BSC con il 70% di etanolo. Tenere tutto sterile come possibile per la totalità del protocollo. Non tagliare le ossa in condizioni non sterili. </li><li> Preparare strumenti di dissezione da immersione in etanolo al 70% (1 paio di forbici dissezione, 2 paia di pinze), soluzione salina bilanciata di Hank con il 5% di siero fetale bovino (HBSS-FCS), piastre sterili (100 mm x 15 mm), 1 siringhe ml, 26½ aghi calibro, provette per la raccolta coniche (15 ml o 50 ml), e asciugamani di carta del BSC. </li><li> Euthanize il mouse usandoprotocolli approvati dal comitato etico di ricerca animale dell&#39;istituzione. Portare in BSC, posto in cima ad uno o due asciugamani di carta e spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Nel BSC, aprire una sterile Petri in modo asettico, un&#39;aliquota di 10 ml di HBSS-FCS alla base e 1 - 2 ml al coperchio. </li><li> Posizionare il mouse sul suo stomaco con il dorso rivolto verso l&#39;alto e sollevare la pelle intorno alle sezioni del torace con le dita della mano non dominante. Usare le forbici per fare un&#39;incisione in cui viene sollevato la pelle. </li><li> Aggrappati a entrambe le estremità del taglio, una estremità con ogni mano e con attenzione separare la pelle intorno il mouse da dietro allo stomaco, continuare a tirare fino a due estremità dell&#39;incisione incontrano alla stomaco. </li><li> Capovolgere il mouse per lo stomaco rivolto verso l&#39;alto, e con una mano tirare la metà inferiore della pelle verso la gamba, continuare a tirare indietro la pelle fino a quando le gambe sono esposte. </li><li> Tenere il piede del mouse e tagliare i tendini di Achille sopra la caviglia ei legamenti che collegano i muscoli di fondo all&#39;estremità inferiore della tibia con le forbici. Ciò allenta il piede dalle ossa delle gambe. </li><li> Tenendo la gamba dal piede, tagliare i muscoli e legamenti con le forbici tutto il ginocchio all&#39;estremità inferiore del femore per tagliare i muscoli della coscia dal braccio inferiore. Utilizzare pinze per estrarre delicatamente i muscoli allentati dal perone e le superfici femorale. Fare attenzione a non recidere l&#39;arteria femorale per evitare gravi emorragie. </li><li> Con una mano aggrappata al piede, premere forbici giù aperti all&#39;estremità superiore del femore all&#39;articolazione dell&#39;anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente per separare il femore dall&#39;articolazione dell&#39;anca mentre usando le forbici per fare il taglio finale alla libera la gamba dal corpo. </li><li> Da questo punto in poi, contenere solo il tessuto con una pinza sterile. Tenere sulla gamba ad una estremità ed estrarre il piede sull&#39;altro. NOTA: Questo non dovrebbe richiedere molta forza, come i legamenti di collegamento sono tagliati in fase di1.9. In alternativa, tagliare la tibia appena sopra la caviglia dove si fonde l&#39;osso. </li><li> Tenere la gamba dalla estremità distale del femore con una serie di pinze e dell&#39;estremità prossimale della tibia e fibula con un altro, piegare accuratamente la tibia e perone nella direzione opposta del ginocchio per separarli dal femore e rotula. </li><li> Utilizzare pinze per tirare giù i restanti legamenti e muscoli ancora attaccati alle ossa delle gambe inferiori. Qui, rimuovere il perone insieme con i tessuti connettivi con pinze in quanto è troppo piccolo per essere lavata per le cellule del midollo osseo. Posizionare la tibia pulita sul coperchio capovolto piastra di Petri. </li><li> Tenere l&#39;estremità inferiore del femore con una serie di pinze e rotula con un altro, piegare la rotula e tessuti circostanti nella direzione opposta del giunto per la rimozione. Poi pulire restante tessuto connettivo dal femore; tirando via con una pinza, e posizionarlo sul coperchio capovolto piastra di Petri. Eliminare la rotula. </li><li> ripetere 1.7- 1.13 con l&#39;altra gamba, se necessario. Trasferire le ossa a 1,6 ml provette da microcentrifuga contenente 1 ml sterile HBSS-FCS per il trasporto se necessario. </li><li> Posizionare ossa sul coperchio piatto Petri invertita, con 1 - 2 ml di HBSS-FCS, utilizzare pinze per pulire qualsiasi tessuto residuo ancora attaccato alla tibia e femore, quindi trasferire le ossa alla base della piastra Petri contenente 10 ml di HBSS- FCS. In alternativa, pulire le ossa e rimuovere il tessuto muscolare collegata con un fazzoletto di carta imbevuto di etanolo al 70%. </li><li> Tagliare ciascuna delle ossa a metà con le forbici. Parzialmente schermare la piastra di Petri con un coperchio sterile durante il taglio per garantire le ossa rimangono nel piatto. In alternativa, tagliare l&#39;estremità di ogni osso per consentire lavaggio nel passaggio successivo. </li><li> Fissare il 26½ ago G alla siringa 1 ml, e redige 1 ml HBSS-FCS dalla piastra di Petri. Inserire la punta di un ago nella fine di un pezzo di osso e scovare le cellule del midollo osseo (tessuti molli rosso all&#39;interno delle ossa). Inserire l&#39;ago nella testadell&#39;osso e l&#39;estremità aperta, fino a quando tutto il midollo colore rosso viene rimosso. Osservare le ossa come di colore bianco. </li><li> Passare eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa alcune volte per formare una sospensione di cellule singole. </li><li> Eliminare le ossa arrossate. Utilizzare una pipetta 10 ml per mescolare la sospensione cellulare bene e trasferire al tubo di raccolta. Lavare la piastra di Petri una volta con 5 ml di HBSS-FCS per raccogliere le cellule residue nel piatto. Mettere le cellule in ghiaccio. NOTA: La sospensione di cellule del midollo osseo è ancora valida se immagazzinato per 2 - 3 ore a 4 ° C. </li></ol> 2. placcatura e la coltura di cellule del midollo osseo (BMC) <ol><li> Preparare i seguenti reagenti e materiali di consumo. <ol><li> Preparare rosso tampone di lisi dei globuli (RBC) facendo cloruro di ammonio 0,84% in una soluzione finale di 2 mM Tris pH 7,2, poi sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micron. </li><li> Preparare supporti BMC con l&#39;aggiunta del 10% di FCS, 20 mM HEPES, aminoacido non essenziale 1x, 55 &amp; #181, M 2-mercaptoetanolo, 50 U / ml di penicillina e streptomicina, 1 mM di sodio piruvato, e 2 mM L-glutammina a RPMI medio 1.640. </li><li> Ottenere disponibile in commercio ricombinante GM-CSF o GM-CSF usare contenente surnatante da AG8.653 cellule di mieloma trasfettate con il gene GM-CSF 20. Determinare la concentrazione di GM-CSF nel supernatante mediante ELISA e aggiungere l&#39;equivalente di 20 ng / ml ai media BMC. </li></ol></li><li> Centrifugare le cellule del midollo osseo a 314 xg per 5 min. Il pellet è di colore rosso, a causa di globuli rossi. Nel BSC, aspirare il surnatante con una pipetta di vetro sterile Pasteur collegato a vuoto di aspirazione, allentare il pellet toccando, quindi aggiungere 10 ml di tampone di lisi RBC. Vortex per risospendere le cellule e incubare in tampone di lisi RBC a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di HBSS-FCS poi girare cellule a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare il pellet cellulare come colore bianco. Risospendere le cellule in volume desiderato di supporto BMC. </li><li> Contare il Resu-cellule trascorsa utilizzando un emocitometro dopo colorazione cellule morte con il 0,4% trypan blu. NOTA: Se si usa il midollo osseo da una gamba (tibia singolo e femore), risospendere in 5 ml di mezzi BMC, prendere 10 ml di sospensione cellulare e diluire con 70 ml di 0,4% trypan blu, mescolare bene e trasferire 10 ml di la diluizione 1/8 cella alla camera emocitometro. Contare le cellule vitali in quattro quadranti: la media dei quattro quadranti conteggi x fattore di diluizione x 10 4 = numero di cellule per ml. Un femore e tibia da una gamba generalmente produrrà circa 2 - 4 x 10 7 cellule dopo RBC lisi. </li><li> Stima il numero di 10 ml piatti di colture di midollo osseo necessari per gli esperimenti a valle in base al numero di cellule totali necessari per esperimenti alla fine della cultura. NOTA: Ogni piatto richiede 2 x 10 6 cellule del midollo osseo a seeding iniziale e rendimenti 5 - 10 x 10 6 cellule a giorno 7. <ol><li> Aliquot il numero totale di cellule per la placcatura in una nuova provetta, centrifugare a 314 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante, e risospendere le cellule a 4 x 10 6 cellule / ml in mezzi BMC. </li></ol></li><li> Preparare una nuova sterile 100 millimetri x 15 mm piastra Petri con 9,5 ml di mezzi BMC contenente 200 ng di GM-CSF (ricombinante o da GM-CSF contenente surnatante). Aggiungere 500 ml di i / cellule del midollo osseo ml 4 x 10 6 cellule al centro del piatto Petri per la concentrazione finale di 2 x 10 5 cellule / ml in 10 ml. NOTA: E &#39;importante utilizzare un non piastra di Petri sterile un piatto di coltura di tessuti. Inoltre, quando si aggiungono le cellule, affinché le cellule rimangono concentrate al centro e minimizzare il disturbo ai piatti dopo la semina e durante le modifiche di supporto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2. Questo è il giorno 0 nella cultura. </li><li> Il giorno 3, aggiungere 10 ml di mezzi freschi BMC contenente 200 ng di GM-CSF per ogni piatto di cellule. Fare attenzione a minimizzare il disturbo of cellule concentrati in sospensione. Il volume totale di coltura cellulare è ora 20 ml. </li><li> Osservare le cellule sotto il microscopio ottico a ingrandimento 100X. Osservare numerose cellule non aderenti (rotonde) e un paio di cellule aderenti (piatti). Le cellule in gruppi di tre o quattro petali che ricordano di un fiore può essere visto, indicando la proliferazione. </li><li> Il giorno 6 eseguire un cambiamento mezzo dei media. Rimuovere con cautela 10 ml di media in un tubo da 50 ml conica sterile, spin down a 314 xg per 5 minuti, aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di media BMC freschi contenenti 20 ng / ml di GM-CSF, delicatamente vortice e aggiungere al piatto originale coltura cellulare per un volume totale di 20 ml. Osservare le cellule sotto il microscopio. NOTA: Giorno 7 cultura dovrebbe essere al 70% o superiore in confluenza con cellule piatte aderenti e nuvole dense di cellule non aderenti rotonde. </li></ol> 3. Raccolta e preparazione BMDC e BMDMs per citometria a flusso <ol> &lt;li&gt; Mantenere tutti i buffer a 4 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule dal giorno 7 al giorno 10. Per raccogliere le cellule, primo trasferimento 10 ml del surnatante cultura ad un tubo da 50 ml conica di raccolta, quindi inclinare il piatto in verticale di circa 30 gradi e lavare il piatto pipettando i restanti 10 ml della cultura dalla parte superiore del piatto. Ripetere questo lavaggio 5 volte, ogni volta ruotare la piastra di un terzo. </li><li> Trasferire i restanti 10 ml di cellule per lo stesso tubo di raccolta e scartare la piastra e cellule aderenti. NOTA: I lavaggi saranno rimuovere le cellule non aderenti e vagamente aderenti; le cellule aderenti piatte sono resistenti ai lavaggi. Tipicamente, tra 5 - 10 x 10 6 cellule non aderenti sono attesi da una piastra al giorno 7 e 2 - 5 x 10 6 cellule a giorno 10, anche se Lutz et al. segnalati 10 x 10 6 cellule al giorno 10. Le cellule aderenti non vengono normalmente adottate. Tuttavia, se queste cellule devono essere confrontati con le cellule non aderenti, Possono essere rimossi come segue. Aggiungere 5 ml di 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 al piatto dopo che le cellule non aderenti sono rimossi, incubare a 37 ° C per 5 min, pipetta su e giù per rimuovere le cellule aderenti e raccogliere in un tubo separato. </li><li> Spin giù le cellule raccolte a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere in 5 ml sterile supporto BMC a 4 ° C, vortice delicatamente per mescolare, e contare utilizzando trypan blu e emocitometro. NOTA: Ogni piatto sarà resa 5 - 10 x 10 6 cellule non aderenti da una cultura giorno 7. D&#39;ora in poi, eseguire tutti i passaggi a 4 ° C. </li><li> Per l&#39;analisi citofluorimetrica, trasferimento 2 x 10 5 cellule per ciascun campione in 5 ml di polistirene provette con fondo arrotondato, aggiungere 300 ml di tampone FACS a 4 ° C (1x tampone fosfato, 2 mM EDTA e 2% di siero albumina bovina) a ciascun campione. </li><li> Spin le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. Osservare bianco, pellet opaca visibile alfondo della provetta. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di non marcata recettore Fc Ab per bloccare il recettore Fc vincolante (Usa 1/10 surnatante da 2.4G2 producendo linea cellulare di mieloma) e incubare per 20 minuti a 4 ° C. Quindi aggiungere 300 ml di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare le cellule giù a 314 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di CD11c-PeCy7 a 0.2 mg / ml, Gr1-Pacific Blue a 0.25 mg / ml, MHCII-APC a 0,05 mg / ml, e FL-HA a circa 2 mg / ml per identificare i macrofagi e le cellule dendritiche. NOTA: FL-HA è stata preparata in casa con fluoresceina e gallo pettine sale sodico dell&#39;acido ialuronico come descritto in precedenza 21. </li><li> Incubare per 20 minuti a 4 ° C per consentire il legame alla superficie cellulare. Aggiungere 300 pl di tampone FACS per ogni campione, delicatamente vortice, poi girare celle in basso a 314 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. NOTA: Se bioGli anticorpi tinylated sono utilizzati in 3.8, ripetere 3,8-9 fluorescente-streptavidina. </li><li> Lavare le cellule con altri 300 ml di tampone FACS, delicatamente vortice di mescolare e centrifugare le cellule a 314 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di tampone FACS contenente 0.1 - 0.2 mg per ml di ioduro di propidio o DAPI per etichettare le cellule non vitali. Le cellule sono ora pronti per l&#39;analisi di citometria di flusso 22. NOTA: vedere i risultati e la Figura 3 per i dettagli delle popolazioni e di come le cellule sono state gated. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

In questo manoscritto, forniamo un metodo per generare macrofagi e cellule dendritiche GM-CSF derivati ​​da una singola coltura di midollo osseo di topo che è adattato da Lutz et al. 6. Espressione MHCII e FL-HA distingue tra DC immature e macrofagi vincolante in questa cultura (vedi Figura 3C), che in precedenza è stato difficile. Questo, insieme con un altro rapporto da Helft et al. 19, dimostra l&#39;eterogeneità all&#39;interno di GM-CSF culture BMDC indotte c...

Diversi metodi in vitro di coltura sono stati descritti per generare osso macrofagi derivate dal midollo (BMDMs) e DC derivate dal midollo osseo (BMDCs) utilizzando uno o una combinazione di fattori di crescita. BMDMs può essere generato da coltura di cellule di midollo osseo utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) o GM-CSF 1,2. Per BMDCs, l&#39;aggiunta di FLT3 ligando alla cultura midollo osseo comporta non aderenti DC classici e plasmacitoidi (alta CD11c / MHCII alta e CD11c lo, B220 + rispettivamente) dopo 9 giorni di coltura 3,4. Al contrario, le cellule non aderenti generati dopo 7 a 10 giorni in coltura con solo GM-CSF 5,6, GM-CSF e IL-4 7, o GM-CSF e FLT3 ligando 8,9 generano BMDCs più da vicino assomiglia DC infiammatorie (alta CD11c, MHCII alta CD11b +) 10. Mentre queste colture in vitro sono utilizzati per generare macrofagi oDC, non è chiaro se ogni cultura dà luogo a popolazioni puri. Ad esempio, anche se le cellule aderenti nelle colture GM-CSF sono descritti come macrofagi 5, le cellule non aderenti dalla stessa cultura vengono utilizzati come DCS 6,11-13, con la presunzione che sono omogenei e ogni variabilità osservata è a causa di diversi stadi di sviluppo 14,15. Inoltre, gli studi hanno trovato GM-CSF di essere un fattore di crescita essenziale per lo sviluppo dei macrofagi alveolari in vivo 16,17, e può essere impiegato in vitro per generare macrofagi alveolari simile 16,17,18. Oltre aderenza, le procedure per la generazione di macrofagi e cellule dendritiche da GM-CSF trattata colture di midollo osseo sono molto simili suggerendo eterogeneità possono esistere all&#39;interno di GM-CSF colture di midollo osseo. Questo sembra davvero essere il caso come due documenti segnalare la presenza di BMDMs nella frazione non aderente di culture BMDC. In un articolo, che identified una popolazione di cellule come CD11c +, CD11b +, MHCII metà, MerTK + e CD115 +, che ha espresso una firma espressione genica che più assomigliava macrofagi alveolari e aveva una ridotta capacità di attivare le cellule T 19. La seconda carta utilizzata MHCII e FL-HA per identificare una popolazione macrofago-come alveolare (CD11c +, MHCII medio / basso, FL-HA alto), che è stato distinto da immaturi (CD11c +, MHCII metà, FL-HA basso) e maturo DC (CD11c +, MHCII alto), sia fenotipicamente e funzionalmente 18. Queste carte entrambe illustrano che le culture GM-CSF BMDC sono eterogenei, contenente sia macrofagi e le popolazioni DC che indicano che si deve prestare attenzione quando si interpretano i dati provenienti da culture BMDC. Questo protocollo descrive come isolare il midollo osseo, cellule del midollo cultura ossee in GM-CSF, e identificare il alveolari macrofago-likepopolazione dalle DC immature e mature nella cultura midollo osseo di citometria a flusso utilizzando FL-HA vincolante e di espressione MHCII. Questa procedura è basata sulla procedura stabilita Lutz et al 6 ed è in grado di generare 5 -. 10 x 10 6 cellule non aderenti il giorno 7 di una cultura 10 ml. La cultura è utilizzabile da 7 a 10 giorni e produce una popolazione eterogenea di macrofagi, cellule dendritiche immature e mature, così come alcuni progenitori al giorno 7. Questo fornisce un metodo semplice per crescere e isolare in vitro macrofagi alveolari simili in grandi quantità.

<table><tbody><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD&nbsp;</td>Microscopio invertito automatizzato <td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Centrifuga DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di Biosicurezza</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 Gauge Ago</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Conico&nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*Provette Eppendorf marca Falcon</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistirene provette a fondo tondo</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione</td><td>Strumenti per la scienza fine&nbsp;</td><td>*Vari&nbsp;</td><td>*Forbici da dissezione, pinza dumont e pinza standard&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon marca</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina Fisher</td><td>Bioreagenti</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico</td></tr><tr><td>acido L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Ultrapure Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Pettine di gallo ialuronato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td> <td>* Utilizzato per produrre acido ialuronico fluoresceinato</td></tr><tr><td>RPMI-1640 &nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>Senza piruvato di sodio, senza glutammina. Media caldi a 37&nbsp; &#176; C prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>5271-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano</td><td>Fisher Bioreagenti</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fc Recettore (non marcato), surnatante per colture tissutali</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Clone: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clone: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clone: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clone: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinilato Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>Capra policlonale IgG</td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di Propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione e identificazione di gm-csf derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

I macrofagi e le cellule dendritiche (DC) sono cellule immunitarie innate trovati nei tessuti e negli organi linfoidi che giocano un ruolo chiave nella difesa contro gli agenti patogeni. Tuttavia, essi sono difficili da isolare in numero sufficiente per studiarli in dettaglio, di conseguenza, sono stati sviluppati modelli in vitro. In vitro culture di osso macrofagi derivate dal midollo e cellule dendritiche sono metodi di valore ben consolidati e per gli studi immunologici. Qui, un metodo per la coltura e l&#39;identificazione sia DC e macrofagi da una sola coltura di cellule del midollo osseo principale del mouse utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi citochina (GM-CSF) è descritto. Questo protocollo si basa sulla procedura stabilita prima sviluppato da Lutz et al. nel 1999 per l&#39;osso DC derivate dal midollo. La cultura è eterogenea, e MHCII e acido ialuronico fluoresceinato (FL-HA) sono utilizzati per distinguere i macrofagi da DC immature e mature. Questi GM-CSF derivato macrofagi provide una comoda fonte di in vitro macrofagi derivati ​​che ricordano da vicino macrofagi alveolari sia in fenotipo e la funzione.

Un diagramma di flusso che sintetizza le fasi principali di questo metodo è illustrato in Figura 1. La densità e la morfologia della cultura midollo osseo in diversi momenti della coltura sono mostrati in Figura 2. Al giorno 1, le cellule sono piccole e sparse, ma al giorno 3, ci sono più celle, alcuni sono più grandi e alcuni hanno cominciato ad aderire. Di giorno 6 c&#39;è un aderente definito e frazione non aderente (Figura 2A). La co...

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è generare e distinguere macrofagi simili ad alveolari da cellule dendritiche in colture in vitro di cellule del midollo osseo murino integrate con GM-CSF. Questo metodo in vitro può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la funzione delle cellule dendritiche o dei macrofagi. Il principale vantaggio della tecnica è che può generare un numero sufficiente di cellule ed è in grado di distinguere tra cellule dendritiche e macrofagi simili ad alveolari.Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla terapia della proteinosi polmonare, poiché facilita l'acquisizione di macrofagi simili agli alveolari, che possono essere utilizzati per trattare questa malattia. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno bisogno di pratica per isolare le ossa pulite ed eseguire il lavaggio del midollo osseo. Una dimostrazione visiva di questo metodo è utile, poiché non tutte le tecniche possono essere comprese facilmente mediante istruzioni scritte da sole.15 minuti prima di iniziare la dissezione, accendere una cappa a sicurezza biologica per purificare l'aria all'interno della cappa e stabilizzare il flusso d'aria, quindi pulire la superficie della cappa con etanolo al 70%. Quando la cappa è pronta, posizionare un topo sopra uno o due fogli di carta assorbente in posizione prona e spruzzare l'animale con etanolo al 70%. Successivamente, con la mano non dominante, sollevare la pelle nella zona toracica e utilizzare le forbici per praticare un'incisione.Afferrando entrambe le estremit&agrave; dell'incisione, tirare con attenzione fino a quando le due estremit&agrave; si incontrano a livello dello stomaco. Successivamente, posizionare il topo in posizione supina e utilizzare una mano per tirare verso il basso la met&agrave; inferiore della pelle fino a quando le zampe non sono esposte. Tenendo sollevato il piede, recidere i tendini d'Achille al di sopra dell'articolazione della caviglia e i legamenti che collegano i muscoli al piede all'estremit&agrave; inferiore della tibia, per staccare il piede dalle ossa della gamba.Mantenendo sollevata la gamba, rimuovere i muscoli e i legamenti intorno all'articolazione del ginocchio all'estremit&agrave; distale del femore per staccare i muscoli della coscia dalla gamba. Utilizzando una pinzetta, tirare delicatamente i muscoli allentati lontano dalle superfici peroniera e femorale. Quindi, premendo le forbici in posizione aperta sull'articolazione dell'anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente sul femore per separare l'osso della gamba dall'articolazione dell'anca mentre si taglia la gamba liberandola dal corpo.Ora, tenendo la gamba all'estremità dell'anca con una pinzetta sterile, utilizzare un'altra pinzetta per rimuovere il piede dall'estremità della caviglia. Successivamente, tenendo l'estremità distale del femore con una pinzetta e l'estremità prossimale della tibia e della fibula con un'altra, piegare con attenzione la tibia e la fibula in direzione opposta rispetto all'articolazione del ginocchio per separare la gamba inferiore dal femore e dalla rotula. Utilizzare la pinzetta per rimuovere i legamenti, i muscoli e la fibula residui dalle ossa della gamba inferiore e posizionare la tibia pulita su un coperchio di piastra di Petri capovolto, contenente da uno a due millilitri di HBSS/FCS.Tenendo l'estremit&agrave; inferiore del femore con un paio di pinzette e la rotula con un altro paio, piegare il ginocchio e i tessuti circostanti in direzione opposta per rimuovere l'articolazione. Successivamente, rimuovere eventuali tessuti connettivi residui dal femore e posizionare l'osso sul coperchio della piastra di Petri capovolto. Una volta raccolte tutte le ossa, utilizzare le pinzette per rimuovere qualsiasi tessuto residuo ancora aderente alle ossa e immergerle in 10 millilitri di HBSS/FCS all'interno della base della piastra di Petri.Mantenendo la piastra parzialmente schermata con un coperchio sterile, tagliare ogni osso pulito a metà con delle forbici. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro, dotata di un ago da 26,5 gauge, per lavare con un millilitro di HBSS/FCS dall'interno della piastra l'estremità di ciascun pezzo osseo, fino a quando tutto il midollo rosso non è stato liberato. Far passare eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa più volte per ottenere una sospensione monocellulare, quindi mescolare accuratamente con una pipetta da 10 millilitri.Trasferire le cellule in una provetta di raccolta e risciacquare una volta la piastra di Petri con cinque millilitri di HBSS/FCS per raccogliere eventuali cellule residue. Quindi unire il lavaggio alla provetta di raccolta e porre le cellule sul ghiaccio. Per allestire una coltura cellulare di midollo osseo, centrifugare le cellule raccolte ed aspirare il sopranatante mediante una pipetta di Pasteur in vetro sterile collegata a un’aspirazione sottovuoto.Sciogliere il pellet ricco di globuli rossi con leggeri colpetti. Quindi aggiungere 10 millilitri di buffer per la lisi dei globuli rossi e risospendere le cellule mediante vortex. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, arrestare la lisi con 10 millilitri di HBSS/FCS e centrifugare le cellule, risospendendo il pellet in mezzo per cellule del midollo osseo.Contare il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di tripano e trasferire le cellule necessarie in un nuovo tubo con mezzo per cellule del midollo osseo. Successivamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un mezzo per cellule del midollo osseo diluito a quattro milioni di cellule per millilitro, contenente 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF. Quindi, aggiungere 9,5 millilitri di mezzo per cellule del midollo osseo integrato con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF in ogni piastra di Petri sterile per coltura batterica e aggiungere 500 microlitri di cellule al centro di ciascuna piastra.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5 percento di CO2. Al terzo giorno, aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco per il midollo osseo integrato con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF a ciascuna coltura, avendo cura di minimizzare qualsiasi disturbo alle cellule. Al sesto giorno, trasferire con attenzione 10 millilitri di supernatante della coltura cellulare in un tubo conico sterile da 50 millilitri.Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco per cellule del midollo osseo, contenente 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF. Quindi vortexare delicatamente la sospensione cellulare e reinserire le cellule nella piastra di coltura. Al primo giorno, le cellule del midollo osseo sono piccole e sparse, ma al terzo giorno il numero e le dimensioni delle cellule sono aumentati e alcune hanno iniziato ad aderire.Al sesto giorno, sono presenti più cellule e si osservano sia la frazione aderente che quella non aderente. La coltura può essere raccolta dal settimo al decimo giorno e selezionata in base alla dimensione e alle cellule vitali, ottenendo una percentuale maggiore di cellule positive per CD11c dalle colture del decimo giorno. Al settimo giorno, la frazione non aderente raccolta è fortemente arricchita di cellule con morfologia dendritica.Le popolazioni positive per CD11c e negative per GR1, isolate al settimo e al decimo giorno, possono essere suddivise in tre popolazioni principali. Macrofagi, cellule dendritiche immature e cellule dendritiche mature, in base all'espressione di MHCII e al legame con FL-HA. Curiosamente, MerTK, sebbene considerato un marcatore dei macrofagi, mostra un'espressione marcata sia nelle popolazioni di macrofagi che di cellule dendritiche immature, isolate al settimo e al decimo giorno, con un basso livello di espressione osservato nelle cellule dendritiche mature.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tecniche sterili durante tutto il prelievo del midollo osseo e la coltura cellulare. Dopo questa procedura, le cellule possono anche essere separate per esaminare le popolazioni cellulari singolarmente, oppure possono essere stimolate con agenti infiammatori e successivamente analizzate per la produzione di citochine mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule del midollo osseo e coltivarle in presenza di GM-CSF per generare sia cellule dendritiche che macrofagi simili ai macrofagi alveolari.

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Immunologia e Infezioni

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