Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

L'obiettivo generale di questo procedimento è generare e distinguere macrofagi simili ad alveolari da cellule dendritiche in colture in vitro di cellule del midollo osseo murino integrate con GM-CSF. Questo metodo in vitro può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la funzione delle cellule dendritiche o dei macrofagi. Il principale vantaggio della tecnica è che può generare un numero sufficiente di cellule ed è in grado di distinguere tra cellule dendritiche e macrofagi simili ad alveolari.

Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla terapia della proteinosi polmonare, poiché facilita l'acquisizione di macrofagi simili agli alveolari, che possono essere utilizzati per trattare questa malattia. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno bisogno di pratica per isolare le ossa pulite ed eseguire il lavaggio del midollo osseo. Una dimostrazione visiva di questo metodo è utile, poiché non tutte le tecniche possono essere comprese facilmente mediante istruzioni scritte da sole.

15 minuti prima di iniziare la dissezione, accendere una cappa a sicurezza biologica per purificare l'aria all'interno della cappa e stabilizzare il flusso d'aria, quindi pulire la superficie della cappa con etanolo al 70%. Quando la cappa è pronta, posizionare un topo sopra uno o due fogli di carta assorbente in posizione prona e spruzzare l'animale con etanolo al 70%. Successivamente, con la mano non dominante, sollevare la pelle nella zona toracica e utilizzare le forbici per praticare un'incisione.

Afferrando entrambe le estremità dell'incisione, tirare con attenzione fino a quando le due estremità si incontrano a livello dello stomaco. Successivamente, posizionare il topo in posizione supina e utilizzare una mano per tirare verso il basso la metà inferiore della pelle fino a quando le zampe non sono esposte. Tenendo sollevato il piede, recidere i tendini d'Achille al di sopra dell'articolazione della caviglia e i legamenti che collegano i muscoli al piede all'estremità inferiore della tibia, per staccare il piede dalle ossa della gamba.

Mantenendo sollevata la gamba, rimuovere i muscoli e i legamenti intorno all'articolazione del ginocchio all'estremità distale del femore per staccare i muscoli della coscia dalla gamba. Utilizzando una pinzetta, tirare delicatamente i muscoli allentati lontano dalle superfici peroniera e femorale. Quindi, premendo le forbici in posizione aperta sull'articolazione dell'anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente sul femore per separare l'osso della gamba dall'articolazione dell'anca mentre si taglia la gamba liberandola dal corpo.

Ora, tenendo la gamba all'estremità dell'anca con una pinzetta sterile, utilizzare un'altra pinzetta per rimuovere il piede dall'estremità della caviglia. Successivamente, tenendo l'estremità distale del femore con una pinzetta e l'estremità prossimale della tibia e della fibula con un'altra, piegare con attenzione la tibia e la fibula in direzione opposta rispetto all'articolazione del ginocchio per separare la gamba inferiore dal femore e dalla rotula. Utilizzare la pinzetta per rimuovere i legamenti, i muscoli e la fibula residui dalle ossa della gamba inferiore e posizionare la tibia pulita su un coperchio di piastra di Petri capovolto, contenente da uno a due millilitri di HBSS/FCS.

Tenendo l'estremità inferiore del femore con un paio di pinzette e la rotula con un altro paio, piegare il ginocchio e i tessuti circostanti in direzione opposta per rimuovere l'articolazione. Successivamente, rimuovere eventuali tessuti connettivi residui dal femore e posizionare l'osso sul coperchio della piastra di Petri capovolto. Una volta raccolte tutte le ossa, utilizzare le pinzette per rimuovere qualsiasi tessuto residuo ancora aderente alle ossa e immergerle in 10 millilitri di HBSS/FCS all'interno della base della piastra di Petri.

Mantenendo la piastra parzialmente schermata con un coperchio sterile, tagliare ogni osso pulito a metà con delle forbici. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro, dotata di un ago da 26,5 gauge, per lavare con un millilitro di HBSS/FCS dall'interno della piastra l'estremità di ciascun pezzo osseo, fino a quando tutto il midollo rosso non è stato liberato. Far passare eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa più volte per ottenere una sospensione monocellulare, quindi mescolare accuratamente con una pipetta da 10 millilitri.

Trasferire le cellule in una provetta di raccolta e risciacquare una volta la piastra di Petri con cinque millilitri di HBSS/FCS per raccogliere eventuali cellule residue. Quindi unire il lavaggio alla provetta di raccolta e porre le cellule sul ghiaccio. Per allestire una coltura cellulare di midollo osseo, centrifugare le cellule raccolte ed aspirare il sopranatante mediante una pipetta di Pasteur in vetro sterile collegata a un’aspirazione sottovuoto.

Sciogliere il pellet ricco di globuli rossi con leggeri colpetti. Quindi aggiungere 10 millilitri di buffer per la lisi dei globuli rossi e risospendere le cellule mediante vortex. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, arrestare la lisi con 10 millilitri di HBSS/FCS e centrifugare le cellule, risospendendo il pellet in mezzo per cellule del midollo osseo.

Contare il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di tripano e trasferire le cellule necessarie in un nuovo tubo con mezzo per cellule del midollo osseo. Successivamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un mezzo per cellule del midollo osseo diluito a quattro milioni di cellule per millilitro, contenente 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF. Quindi, aggiungere 9,5 millilitri di mezzo per cellule del midollo osseo integrato con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF in ogni piastra di Petri sterile per coltura batterica e aggiungere 500 microlitri di cellule al centro di ciascuna piastra.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5 percento di CO2. Al terzo giorno, aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco per il midollo osseo integrato con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF a ciascuna coltura, avendo cura di minimizzare qualsiasi disturbo alle cellule. Al sesto giorno, trasferire con attenzione 10 millilitri di supernatante della coltura cellulare in un tubo conico sterile da 50 millilitri.

Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco per cellule del midollo osseo, contenente 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF. Quindi vortexare delicatamente la sospensione cellulare e reinserire le cellule nella piastra di coltura. Al primo giorno, le cellule del midollo osseo sono piccole e sparse, ma al terzo giorno il numero e le dimensioni delle cellule sono aumentati e alcune hanno iniziato ad aderire.

Al sesto giorno, sono presenti più cellule e si osservano sia la frazione aderente che quella non aderente. La coltura può essere raccolta dal settimo al decimo giorno e selezionata in base alla dimensione e alle cellule vitali, ottenendo una percentuale maggiore di cellule positive per CD11c dalle colture del decimo giorno. Al settimo giorno, la frazione non aderente raccolta è fortemente arricchita di cellule con morfologia dendritica.

Le popolazioni positive per CD11c e negative per GR1, isolate al settimo e al decimo giorno, possono essere suddivise in tre popolazioni principali. Macrofagi, cellule dendritiche immature e cellule dendritiche mature, in base all'espressione di MHCII e al legame con FL-HA. Curiosamente, MerTK, sebbene considerato un marcatore dei macrofagi, mostra un'espressione marcata sia nelle popolazioni di macrofagi che di cellule dendritiche immature, isolate al settimo e al decimo giorno, con un basso livello di espressione osservato nelle cellule dendritiche mature.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tecniche sterili durante tutto il prelievo del midollo osseo e la coltura cellulare. Dopo questa procedura, le cellule possono anche essere separate per esaminare le popolazioni cellulari singolarmente, oppure possono essere stimolate con agenti infiammatori e successivamente analizzate per la produzione di citochine mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule del midollo osseo e coltivarle in presenza di GM-CSF per generare sia cellule dendritiche che macrofagi simili ai macrofagi alveolari.