Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

L'obiettivo generale è quello di generare e distinguere macrofagi di tipo alveolare da cellule dendritiche in colture cellulari di midollo osseo murino in vitro integrate con GM-CSF. Questo metodo in vitro può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la funzione delle cellule dendritiche o dei macrofagi. Il vantaggio principale della tecnica è che può generare un numero sufficiente di cellule e può distinguere tra cellule dendritiche e macrofagi alveolari.

Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi alla terapia della proteinosi polmonare in quanto facilita l'acquisizione di macrofagi simili ad alveolari, che possono essere utilizzati per trattare questa malattia. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno bisogno di pratica con l'isolamento delle ossa pulite e il lavaggio del midollo osseo. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto non tutte le tecniche utilizzate sono facilmente comprensibili solo con l'istruzione scritta.

15 minuti prima di iniziare la dissezione, accendere una cabina di sicurezza biologica per spurgare l'aria della cabina e stabilizzare il flusso d'aria e pulire la superficie della cabina con etanolo al 70%. Quando l'armadietto è pronto, posiziona un topo sopra uno o due tovaglioli di carta in posizione prona e spruzza l'animale con il 70% di etanolo. Quindi, con la mano non dominante, sollevare la pelle intorno alla zona toracica e utilizzare le forbici per praticare un'incisione.

Afferrando entrambe le estremità dell'incisione, tirare con cautela fino a quando le due estremità dell'incisione non si incontrano allo stomaco. Quindi posiziona il mouse in posizione supina e usa una mano per tirare verso il basso la metà inferiore della pelle fino a quando le gambe non sono esposte. Tenendo il piede, tagliare i tendini d'Achille sopra l'articolazione della caviglia e i legamenti che collegano i muscoli al piede all'estremità inferiore della tibia per allentare il piede dalle ossa della gamba.

Mantenendo la gamba sollevata, rimuovere i muscoli e i legamenti attorno all'articolazione del ginocchio all'estremità inferiore del femore per sezionare i muscoli della coscia dalla parte inferiore della gamba. Usando una pinza, allontanare delicatamente i muscoli sciolti dalle superfici fibulare e femorale. Quindi, premendo le forbici in posizione aperta sull'articolazione dell'anca, ruotare la gamba e tirare delicatamente il femore per separare l'osso della gamba dall'articolazione dell'anca mentre si libera la gamba dal corpo.

Ora tenendo la gamba all'estremità dell'anca con una pinza sterile, usa un'altra pinza per rimuovere il piede dall'estremità della caviglia. Quindi, tenendo l'estremità distale del femore con una pinza e l'estremità prossimale della tibia e del perone con un'altra, piegare con cura la tibia e il perone nella direzione opposta dell'articolazione del ginocchio per separare la parte inferiore della gamba dal femore e dalla rotula. Usa le pinze per rimuovere i legamenti, i muscoli e le fibule rimanenti dalle ossa della parte inferiore della gamba e posiziona la tibia pulita su un coperchio di piastre di Petri rovesciato, contenente da uno a due millilitri di HBSS/FCS.

Tenendo l'estremità inferiore del femore con una serie di pinze e la rotula con un'altra, piegare il ginocchio e i tessuti circostanti nella direzione opposta per rimuovere l'articolazione. Quindi rimuovere i tessuti connettivi rimanenti dal femore e posizionare l'osso sul coperchio della capsula di Petri rovesciata. Quando tutte le ossa sono state raccolte, utilizzare una pinza per pulire il tessuto residuo ancora attaccato alle ossa e immergere le ossa in 10 millilitri di HBSS/FCS all'interno della base della capsula di Petri.

Mantenendo il piatto parzialmente schermato con un coperchio sterile, tagliare a metà ciascuna delle ossa pulite con le forbici. Quindi utilizzare una siringa da un millilitro, dotata di un ago calibro 26,5 per sciacquare un millilitro di HBSS/FCS dal piatto all'estremità di ciascun pezzo di osso fino a quando tutto il midollo rosso non è stato liberato. Passare più volte eventuali grumi visibili di midollo osseo attraverso la siringa per formare una sospensione di una singola cellula, seguita da un'accurata miscelazione con una pipetta da 10 millilitri.

Trasferire le cellule in una provetta di raccolta e sciacquare una volta la capsula di Petri con cinque millilitri di HBSS/FCS per raccogliere eventuali cellule residue. Quindi raccogliere il lavaggio nella provetta di raccolta e posizionare le celle sul ghiaccio. Per allestire una coltura cellulare di midollo osseo, centrifugare le cellule raccolte e aspirare il surnatante con una pipetta sterile di vetro Pasteur collegata all'aspirazione sottovuoto.

Allentare la pallina ricca di globuli rossi picchiettando. Quindi aggiungere 10 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi e risospendere le cellule con il vortex. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, arrestare la lisi con 10 millilitri di HBSS/FCS e far girare le cellule, risospendendo il pellet nel terreno cellulare del midollo osseo.

Contare il numero di cellule vitali mediante esclusione del Trypan Blue e trasferire le cellule necessarie in una nuova provetta con terreno cellulare del midollo osseo. Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet a una diluizione di quattro milioni di cellule per millilitro in terreno cellulare del midollo osseo con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF. Successivamente, aggiungere 9,5 millilitri di terreno cellulare del midollo osseo integrato con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF a una piastra di Petri batterica sterile per coltura e aggiungere 500 microlitri di cellule al centro di ciascuna piastra.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. Il terzo giorno, aggiungere 10 millilitri di terreno di midollo osseo fresco integrato con 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF a ciascuna coltura, avendo cura di ridurre al minimo eventuali disturbi alle cellule. Il sesto giorno, trasferire con cura 10 millilitri di surnatante per colture cellulari in una provetta conica sterile da 50 millilitri.

Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno cellulare fresco di midollo osseo, contenente 20 nanogrammi per millilitro di GM-CSF. Quindi agitare delicatamente la sospensione cellulare e rimettere le cellule nel piatto di coltura. Il primo giorno, le cellule del midollo osseo sono piccole e sparse, ma al terzo giorno le cellule sono aumentate in numero e dimensioni e alcune hanno iniziato ad aderire.

Entro il sesto giorno, ci sono più cellule e si osservano sia frazioni aderenti che non aderenti. La coltura può essere raccolta dal settimo al decimo giorno e controllata in base alle dimensioni e alle cellule vive con una percentuale più elevata di cellule CD11c-positive ottenute dalle colture del decimo giorno. Al settimo giorno, la frazione non aderente raccolta è notevolmente arricchita per le cellule con morfologia dendritica.

Le popolazioni CD11c-positive e GR1-negative, raccolte il settimo e il decimo giorno, possono essere suddivise in tre popolazioni principali. Macrofagi, cellule dendritiche immature e cellule dendritiche mature mediante espressione di MHCII e legame FL-HA. È interessante notare che MerTK, sebbene considerato un marcatore macrofagico, mostra una robusta espressione sia su popolazioni di macrofagi che di cellule dendritiche immature, raccolte nei giorni sette e 10, con un basso livello di espressione osservato su cellule dendritiche mature.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tecniche sterili durante il prelievo del midollo osseo e la coltura cellulare. Seguendo questa procedura, le cellule possono anche essere ordinate per esaminare separatamente le popolazioni cellulari, oppure possono essere stimolate con agenti infiammatori e successivamente analizzate per la loro produzione di citochine mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule del midollo osseo e coltivarle in GM-CSF per generare sia cellule dendritiche che macrofagi alveolari.