Name: Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Scopri la trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare topi retrogenici e studiare la funzione in vivo dei recettori T. Questo metodo consente di analizzare diversi TCR specifici per antigeni.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) per MLB, Pilot / fattibilità del programma del Diabetes Research Center (P30-DK079638) al BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, Carriere AAI in Immunologia Fellowship a MB, e The Robert e Janice McNair Fondazione.

Etica Dichiarazione: Ogni sforzo è fatto per mantenere il disagio degli animali o di stress al minimo durante l&#39;irradiazione e la coda vena iniezioni. I topi sono utilizzati come fonte di cellule in questi esperimenti; in quanto tale, non ci sono procedure o manipolazioni a parte l&#39;eutanasia. I topi saranno sacrificati da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Questa procedura è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull&#39;eutanasia della American Veterinary Medical Association. 1. Preparare retrovirale Construct <ol><li> Sotto-clone catene del recettore delle cellule T (TCR) alfa e beta, separati da un linker 2A, in un MSCV basata retrovirale 11 vettore (ad esempio, pMIAII o pMIGII) 11. NOTA: Il linker 2A permette di espressione stechiometrica e concorde delle catene alfa e beta TCR da un singolo fotogramma open reading. Il vettore comprende una cassetta IRES fluorescent proteina (ametrine o GFP) che viene utilizzato permonitorare le cellule trasdotte e efficienza di trasduzione. Per un protocollo dettagliato si rimanda Holst et al. 11 </li><li> Isolare plasmidi DNA utilizzando commercialmente ottenuto kit di preparazione al plasma o un prodotto simile. Utilizzare una concentrazione di lavoro di 1 - 2 mg ml -1. </li></ol> 2. Generazione di retrovirali produttrice di celle Lines <ol><li> Utilizzare un processo in due fasi per produrre linee cellulari produttore retrovirali. NOTA: Per un protocollo dettagliato, si prega di consultare Holst et al 11.. <ol><li> Genera retrovirus per trasfezione transiente di cellule 293T con tre plasmidi (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) e vettore di interessi 11) e prendere il surnatante retrovirale dalle cellule 293T di trasdurre la ecotropic linea cellulare produttore retrovirale GP + E86. </li><li> Isolare i primi 40% delle cellule che esprimono produttori fluorescenti GP + E86 da FACS e propagare le cellule produttrici + E86-GP transdcuced come fonte di virus. NOTA: La generazionedi produttori di alto titolo è fondamentale per un efficiente trasduzione di cellule del midollo osseo. Per un protocollo completo si prega di consultare Holst et al. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirus-mediata Stem Cell Gene Transfer (Giorno -5) <ol><li> Scongelare e cultura 0.5 -1.0 x 10 6 di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in completo DMEM 10% (vol / vol) FBS per consentire una crescita sufficiente per due confluenti piastre da 150 mm per giorno 0 di questo protocollo. NOTA: Scongelamento 0,5-1,0 x 10 6 di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in un piatto 10 centimetri consentirà di 30 - 50% di confluenza in occasione della Giornata 5. Ciò consente anche di 5 giorni di coltura al fine di espandere il GP + E86 linee cellulari di produttori alle due piastre confluenti 150 mm per giorno 0. <ol><li> Cultura linea cellulare produttore retrovirale nei media completa coltura tissutale contenente il 5% di siero di vitello feta, e la ciprofloxacina (10 mg / ml) per evitare la contaminazione da micoplasma. NOTA: Interrompere l&#39;uso della ciprofloxacina quando generating il surnatante virale per la trasduzione del midollo osseo. Evitare un eccesso di crescita della linea cellulare produttore, in quanto questo avrà un impatto negativo del midollo osseo efficienza di trasduzione. </li></ol></li></ol> 4. I topi donatori Iniettare con 5-fluorouracile (5-FU) (Giorno -3) <ol><li> Pesare il topo donatore (5 - 12 settimane) per determinare la quantità di 5-FU richiesto. Utilizzando topi di età inferiore a 5 settimane di risultati d&#39;età in bassa resa del midollo osseo. Per garantire l&#39;espressione di un singolo TCR, utilizzare un ceppo di topi carenti di cellule T, come SCID, straccio o TCR alfa topi deficienti come donatori di midollo osseo. </li><li> Lavorando in cappa coltura tissutale, diluire il magazzino 5-FU con PBS sterile per fare una sufficiente quantità di 10 mg ml -1 soluzione di lavoro di 5-FU per fornire 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo. </li><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 37 G, intraperitoneale iniettare 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo per topo donatore. NOTA: Usa il mouse 1 donatore per un destinatario per avviare e regolareil numero di topi donatori secondo il rendimento cella. Un metodo alternativo per il trattamento 5-FU per l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di progenitori midollari è selezione negativa di cellule positive lineage come descritto in Viret et al. </li></ol> 5. Bone Marrow Procedura di estrazione (giorno 0) <ol><li> Ottenere forbici dissezione e pinze per l&#39;isolamento delle ossa. Preparare supporti (HBSS integrata con 5% FCS (vol / vol)) per raccogliere le ossa in un tubo conico da 50 ml. Mantenere 50 ml conica contenente media su ghiaccio. Euthanize topi da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Pinch zampa al fine di garantire non vengono rilevati riflessi. </li><li> Sterilizzare il sito chirurgico e strumenti chirurgici con etanolo o metanolo. Rimuovere il femore, tibia, omero, e cingolo pelvico con cura dal primo taglio e sotto la cintura pelvica. Tagliare lungo il femore alla tibia. Rimuovere tutti i tessuti circostanti con le forbici e pinze per ottenere ossa pulite. Tenereossa idratata in HBSS + 5% (vol / vol) FBS. </li><li> Separare le ossa tagliando a livello delle articolazioni, avendo cura di tagliare entrambe le estremità fuori di ogni osso. Inserire un ago 25-gauge collegato a una siringa da 10 ml contenente HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Applicare una pressione e lavare tutto il midollo osseo attraverso un 70-micron filtro di riposo in una conica da 50 ml. </li><li> Periodicamente, spingere il midollo osseo attraverso il filtro 70 micron utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 ml e 3 ml. Risciacquare il filtro con HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Ciò garantirà una sospensione singola cella che è libero di frammenti ossei e dei tessuti. Mantenere le cellule sterili eseguendo la procedura in una cappa sterile. </li><li> cellule del midollo osseo centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li></ol> 6. midollo osseo Cultura (Giorno 0) <ol><li> supporti Decantare o aspirare e pellet cellulare risospendere in 1 ml di ammonio tampone a base di cloruro di lisi dei globuli rossi (RBC o tampone di lisi equivalente) per tubo da 50 ml. Dopo 1 min di incubazione a cameratemperatura, spegnere il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 10 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) FBS. </li><li> cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare o aspirare il surnatante e risospendere midollo osseo in 5 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS. Contare le cellule con una camera di conta Neubauer. NOTA: la resa generale dovrebbe essere di circa 5 - 10 x 10 6 cellule per il mouse; Tuttavia, la resa può variare tra i diversi ceppi di topi. </li><li> Piatto cellule del midollo osseo con una densità di 4 x 10 7 cellule per piastra da 150 mm in 30 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) supplementato con FBS IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1). NOTA: utilizzare citochine appena scongelati-aliquotati. Non utilizzare citochine che sono stati congelati e scongelati più di una o conservati a 4 ° C per più di 2 settimane. </li><li> Incubare midollo osseo durante la notte (circa 24 ore) a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol><ol><li> Piastra 3 x 10 cellule produttrici 6 retrovirali per piastra da 150 mm in 18 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Incubare cellule produttrici retrovirali a 37 ° C durante la notte. Anticipare una piastra da 150 mm per 15 milioni di cellule del midollo osseo (circa 2 - 3 topi donatore). </li></ol> 8. Retroviral Surnatante (1 ° giorno) <ol><li> Il giorno successivo (circa 24 ore più tardi), raccogliere il surnatante retrovirale dalle piastre di produttori (istituito nel passo 7) elaborando il surnatante retrovirale direttamente fuori della piastra di 150 mm con una siringa da 10 ml e filtro con un 0,45 Filtro siringa -μm. </li><li> Ricollocare accuratamente il surnatante retrovirale rimosso con 18 ml di DMEM fresco completa al 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Supplemento il surnatante retrovirale filtrata con IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) e Hexadimethrine bromuro (Polybrene) (6 &amp;# 956; g ml -1). NOTA: Hexadimethrine bromuro deve essere fatta fresca ogni 2 mesi per evitare un calo di efficacia di trasduzione retrovirale. </li></ol> 9. midollo osseo Harvest (1 ° giorno) <ol><li> Dopo aver completato la fase 8.3, raccogliere le cellule del midollo osseo a partire dal punto 6.4 e trasferire i supporti contenenti le cellule non aderenti in sterili tubi da 50 ml. </li><li> Lavare le piastre vigorosamente con 10 ml di PBS e raccogliere nel conica da 50 ml a partire dal punto 9.1. Se necessario, ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C, decantare il surnatante, risospendere le cellule in un piccolo volume (1 - 3 ml) completo DMEM 20% (vol / vol) FBS, e contano. Prevedere 50 - recupero 75% dal giorno 0. Risospendere midollo osseo a 1 x 10 6 cellule per 1 ml di surnatante retrovirale contenente citochine e Hexadimethrine bromuro. </li></ol> 10. midollo osseo trasduzione (1 ° giorno) <ol><li> Piatto il retrovirale surnatante ma / ossomiscela rrow ad un volume di 3 ml per pozzetto in una piastra di coltura tissutale sei pozzetti. Avvolgere le piastre in involucro di plastica per ridurre al minimo lo scambio di gas durante la centrifugazione al punto 10.2. </li><li> Spin le piastre a sei pozzetti avvolti a 1000 xg per 60 min a 37 ° C. </li><li> Dopo lo spin, rimuovere la pellicola trasparente e mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C di CO 2 per 24 ore. </li></ol> 11. retrovirale surnatante e trasduzione (2 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttore virale. Filtrare il surnatante retrovirale utilizzando una siringa da 10 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron. Supplemento surnatante filtrato retrovirale con IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) e Hexadimethrine bromuro (6 g ml -1). </li><li> Quindi, rimuovere delicatamente con pipetta o aspirare i primi 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo. NOTA: Work attenzione a non aspirare il midollo osseo, che di solito è concentrata nel centro del pozzo. In alternativa, il surnatante eliminato può essere centrifugata per recuperare eventuali cellule del midollo osseo persi. </li><li> Per ogni bene nel midollo osseo 6 pozzetti aggiungere 3 ml di surnatante contenente citochine virali freschi e Hexadimethrine bromuro. Avvolgere le piastre in plastica, e ripetere la trasduzione centrifugare a 1000 xg per 60 min a 37 ° C. Scartare le piastre e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (circa 24 ore). </li></ol> 12. L&#39;aggiunta di fresco Integrata DMEM (3 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore, rimuovere la parte superiore 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo, come al punto 11.2. Sostituire il supporto rimosso con DMEM fresco 20% (vol / vol) FBS supplementato con concentrazioni finali di IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) . </li><li> Incubare midollo osseopiastre a 37 ° C CO 2 incubatore per un altro 24 ore. </li></ol> 13. Harvest trasduzione del midollo osseo (4 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore, raccogliere le cellule del midollo osseo dalle piastre a sei pozzetti. Lavare le piastre energicamente con PBS per rimuovere tutte le cellule non aderenti. <ol><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il midollo osseo in un piccolo volume (1 ml) di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Supponendo 1 - 2 donatore al ricevente, il rendimento sarà sufficiente a trasferire almeno 4 x 10 6 cellule per topo ricevente. Risospendere il midollo osseo in un sufficiente volume di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS per iniettare 200 - 300 ml per topo. <ol><li> Iniettare almeno 2 x 10 6 cellule con una efficienza di trasduzionedel 25% (può iniettare fino a 8 x10 6 celle) per topo per via endovenosa. NOTA: Noi abitualmente iniettare cinque topi riceventi per due 6 pozzetti di cellule del midollo osseo. Se la resa è notevolmente inferiore, più topi donatori devono essere utilizzati fino a quando è possibile ottenere il numero di midollo osseo sufficiente. Al fine di raggiungere ricostituzione ottimale, almeno 5 x 10 5 trasdotte (fluorescente positiva) deve essere iniettato in ciascun destinatario. </li></ol></li><li> Con una micro pipetta, prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e di analizzare l&#39;efficienza di trasduzione mediante citometria a flusso basato sulla espressione del marcatore fluorescente (Figura 1A) 11. NOTA: in generale, la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Il numero di cellule del midollo osseo trasdotte necessario ricostituire un mouse sub-letale irradiate può variare a seconda della efficienza di trasduzione. Più basso è il tranefficienza sduction, le cellule del midollo più ossee richiesto e viceversa, maggiore è l&#39;efficienza di trasduzione midollo osseo, il minor numero di cellule nella ricostituzione. efficienza di trasduzione di sotto del 25% è ottimale e può provocare la ricostituzione e la sopravvivenza insufficiente. Al fine di garantire il recupero del midollo osseo ottimale e l&#39;efficienza di trasduzione, utilizzare i media e citochine coltura di tessuti preparati al momento. Quando esprimere una nuova TCR utilizzando il sistema retrogenic, la selezione di tale TCR in vivo è sconosciuta. A seconda ogni singolo affinità TCR, selezione TCR nel timo e di espressione di cellule T periferico varierà 17. </li></ol> 14. mouse irradiazione, midollo osseo iniezione e cura <ol><li> Irradiare topi il giorno prima dell&#39;iniezione di midollo osseo (stesso giorno Fase 13). Utilizzare i seguenti dosaggi: C57BL / 6 topi (e altri ceppi wild type), 900 rad; RAG1 - / - mice, 500 RADS; topi SCID, 300 RADS). <ol><li> topi Luogo destinatario sul amoxicillina (50 mg / kg / giorno) o un altro trattamento dell&#39;acqua antibiotico prima dell&#39;irraggiamento, e mantenere antibiotici per le prime due settimane dopo l&#39;iniezione di midollo osseo. NOTA: la dose di irradiazione ottimale può essere determinato empiricamente. </li></ol></li><li> Per l&#39;iniezione, caricare le cellule a partire dal punto 13.1 in una siringa da 1 ml con aghi smussati immediatamente prima dell&#39;iniezione, quindi cambiare l&#39;ago 27-gauge per l&#39;iniezione, espellere l&#39;aria per evitare embolia gassosa. topi calore sotto una lampada riscaldante e iniettano 0,2 ml di midollo osseo per topo per via endovenosa. NOTA: Non lasciate che le cellule si siedono nella siringa per un certo periodo di tempo o le cellule si accontentano. </li><li> Monitorare i topi settimanale per assicurarsi che rimangano in buona salute. </li><li> Dopo 5 - 6 settimane sfiatare i topi per verificare ricostituzione sulla base di GFP + / + ametrine e co-espressione TCR (Figura 1B) 11. </li></ol>

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<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nel protocollo, abbiamo dettaglio diversi passaggi critici per garantire la salute del midollo osseo ottimale, l&#39;efficienza di trasduzione e la ricostituzione. Il primo passo fondamentale è la generazione e la corretta manutenzione delle cellule produttrici virale GP + E86. Utilizzare linee cellulari produttori di passaggio precoce e mantenere a 80% di confluenza o inferiore prima dell&#39;uso. Quando si effettuano fresche cellule produttrici virale GP + E86, garantire le cellule 293T sono di passaggio precoce e in ...

Recettore delle cellule T (TCR) repertorio di esseri umani e topi è stato stimato a 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR unici rispettivamente 1,2. Questa grande diversità permette cellule T di riconoscere una vasta gamma di epitopi antigenici derivati ​​da auto-peptidi e da agenti patogeni presentati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle cellule presentanti l&#39;antigene (APC). Le sottili differenze nelle interazioni dei TCR con unici complessi peptide-MHC determinano se una cellula T subirà apoptosi, anergia, l&#39;attivazione, la differenziazione, la produzione di citochine e citotossicità. Tuttavia, a causa della grande repertorio TCR, analisi di come una determinata TCR risponderà a un particolare antigene richiede l&#39;utilizzo di sistemi singoli TCR. Vari topi transgenici TCR sono state generate per studiare la funzione di un singolo TCR in un modello in vivo 3-9. Tuttavia, ci sono avvertimenti di TCR topi transgenici compresa lacosto, la lunghezza di tempo per generare un singolo topo transgenico e il cosiddetto effetto fondatore di inserimento transgene casuale nel DNA germinale 10. Pertanto, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati per un dato antigene e le implicazioni funzionali di alta e bassa affinità TCR per lo stesso epitopo sono raramente affrontati. Per affrontare la necessità di un avvicinamento rapido alla schermata e studiare più TCR singolarmente o in combinazione, topi retrogenic ( &#39;retro&#39; da retrovirus e &#39;geniche&#39; dal transgenici) sono stati utilizzati come alternativa al TCR topi transgenici 11-13. Il motivo di consenso 2A peptide trovato all&#39;interno di diversi virus sono costituiti da un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, in cui scissione avviene tra la glicina del 2A e prolina del 2B da cis -acting attività idrolasi, con conseguente salto ribosomiale durante la traduzione 10,14-16. Per uno schema dettagliato raffigurante la cleavage dei vari peptidi 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consultare i riferimenti 10 - 12. In questo modo, 2 cistroni (TCR alfa e beta TCR) possono essere collegati con conseguente traduzione stechiometrica in un singolo vettore. Utilizzando questo approccio, siamo in grado di esprimere e confrontare direttamente più TCR specifici antigeni in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM, alto glucosio + glutammina</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Modifica di Dulbecco del terreno di Eagle con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &#181; m filtro per siringa</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Sterile Filtrato in dH2O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacina&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracile (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M soluzione</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale da 150 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Piastra piana a 6 pozzetti trattata con coltura Tisue</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &#181; m filtri cellulari in nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHC0063</tr><tr><td>Fattore di cellule staminali di topo</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringa da 10 ml</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Ago per scivolamento di precisione</td><td>BD</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>Ago per scivolamento di precisione 30 G x 1/2 BD</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule t del recettore retrogenic mice

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

La segnalazione del recettore delle cellule T (TCR) è essenziale nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule T rispettivamente nel timo e nella periferia. La vasta gamma di TCR dimostra che lo studio di una specifica risposta antigenica è difficile. Pertanto, i topi transgenici TCR sono stati fatti per studiare la selezione positiva e negativa nel timo, nonché l'attivazione, la proliferazione e la tolleranza delle cellule T periferiche. Tuttavia, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati specifici per un dato antigene. Pertanto, sono mancati studi che coinvolgessero TCR di varie affinità per lo stesso peptide antigenico. La generazione di una nuova linea transgenica TCR può richiedere sei o più mesi. Inoltre, eventuali reincroci specifici possono richiedere altri sei mesi. Al fine di consentire una più rapida generazione e screening di TCR multipli, è stato stabilito un protocollo per la trasduzione retrovirale del midollo osseo con l'espressione stechiometrica delle catene TCRα e TCRβ e la generazione di topi retrogeni. Ogni topo retrogenico è essenzialmente un fondatore, negando virtualmente un effetto fondatore, mentre il periodo di tempo per generare un TCR retrogenico è ridotto da sei mesi a circa sei settimane. Qui presentiamo un'alternativa rapida e flessibile ai topi transgenici TCR che può essere espressa su qualsiasi sfondo scelto con qualsiasi TCR particolare.

Bone efficienza osseo trasduzione viene controllato nel passo 13.3 del protocollo prima del midollo osseo viene iniettato in vena della coda iv In rappresentante midollo osseo trasduzione figura (Figura 1A), circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l&#39;espressione ametrino. Generalmente la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Dopo 6 settimane inie...

Presentiamo un protocollo rapido e flessibile per un sistema di espressione in vivo basato su un singolo recettore delle cellule T (TCR) basato su retrovirus. I vettori retrovirali sono utilizzati per trasdurre le cellule progenitrici del midollo osseo per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione di un singolo TCR in vivo come alternativa ai topi transgenici TCR.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Lo scopo di questa procedura è generare topi retrogenici per determinare la funzione in vivo di diversi recettori delle cellule T. Questo viene ottenuto utilizzando un costrutto retrovirale che codifica le catene alfa e beta del recettore delle cellule T, collegate da un motivo consenso di peptidi 2A. Questo metodo può effettivamente contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia: analizzando diversi TCR specifici per diversi antigeni, è possibile determinarne la funzione in vivo.Il vantaggio principale di questa tecnica è che, una volta completato il costrutto retrovirale, il compartimento di cellule T nei topi retrogenici sarà ricostituito in circa sette settimane. Inoltre, ogni topo retrogenico è essenzialmente un fondatore, quindi analizzando più topi si elimina l'effetto del fondatore. A dimostrare questa parte della procedura sarà la dottoressa Maria Bettini.Preparare il prelievo del midollo osseo posizionando forbici e pinzette da dissezione sterili nell'area chirurgica e raffreddando il mezzo di dissezione in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Dopo l'eutanasia del topo e la conferma della morte mediante dislocazione cervicale, utilizzare le forbici da dissezione per tagliare verso l'alto e sotto la cintura pelvica per rimuoverla. Successivamente, tagliare lungo il femore fino alla tibia e rimuovere con cura il femore, la tibia e l'omero.Trasferire le ossa in una piastra contenente mezzo di dissezione all'interno della cappa a flusso laminare e utilizzare forbici e pinze per rimuovere tutti i tessuti circostanti, ottenendo ossa pulite. Separare le ossa tagliando alle articolazioni, assicurandosi di rimuovere entrambe le estremità di ciascun osso. Inserire quindi un ago da 25 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri contenente mezzo di dissezione all'interno di un osso.Applicare pressione e far passare tutto il midollo osseo attraverso un filtro da 70 micron, posizionato su un tubo conico da 50 millilitri. Periodicamente, spingere il midollo osseo attraverso il filtro da 70 micron utilizzando lo stantuffo di una siringa da un millilitro e risciacquare il filtro con il mezzo. Centrifugare la sospensione di cellule singole del midollo osseo a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, decantare o aspirare il mezzo e risospendere ogni pellet cellulare in un millilitro di tampone lisico per globuli rossi a base di cloruro di ammonio. Incubare a temperatura ambiente per un minuto. Successivamente, interrompere la lisi dei globuli rossi aggiungendo 10 millilitri di mezzo di semina e quindi centrifugare come in precedenza.Dopo aver rimosso il soprannatante, risospendere il midollo osseo in cinque millilitri di mezzo di semina ed eseguire un conteggio cellulare utilizzando una camera di conta di Neubauer. Il rendimento dovrebbe essere di circa cinque-dieci volte 10 alla sesta cellule per topo, ma può variare tra ceppi diversi. Aggiungere 30 millilitri di mezzo di semina, integrato con IL-3, IL-6 e SCF scongelati al momento, in piastre per colture cellulari da 150 millimetri.Quindi, aggiungere quattro volte 10 alla settima cellule del midollo osseo a ogni piastra e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica. A dimostrare questa parte della procedura sarà Thomas Lee. Successivamente, seminare tre volte 10 alla sesta cellule produttrici di retrovirus in piastre da 150 millimetri contenenti 18 millilitri di mezzo di semina.Incubare le cellule produttrici di retrovirus durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare una siringa da 10 millilitri e un filtro da 0,45 micron per raccogliere e filtrare il sopranatante retrovirale dalle piastre produttrici. Sostituire con attenzione il sopranatante retrovirale rimosso con 18 millilitri di mezzo di semina fresco.Integrare il surnatante retrovirale filtrato con IL-3, IL-6, MSCF e bromuro di esadimetrina. Successivamente, procedere al raccolto delle cellule del midollo osseo trasferendo innanzitutto il mezzo contenente le cellule non aderenti in un tubo sterile da 50 millilitri. Quindi lavare vigorosamente la piastra con 10 millilitri di PBS e aggiungere il lavaggio al tubo conico da 50 millilitri.Dopo aver centrifugato le cellule a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, decantare il soprannatante e quindi risospendere le cellule in uno-tre millilitri di mezzo di semina. Dopo aver effettuato il conteggio cellulare, aggiungere le cellule del midollo osseo alla zuppa. Piastrare questa miscela cellulare in un volume di tre millilitri per pozzetto in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti.Avvolgere le piastre contenenti le cellule del midollo osseo con della pellicola trasparente per ridurre al minimo lo scambio gassoso, quindi centrifugare le piastre a 1.000 × g per 60 minuti a 37 °C. Al termine della centrifugazione, rimuovere la pellicola trasparente e posizionare le piastre in un incubatore con anidride carbonica a 37 °C per 24 ore. Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttrice di virus.A questo punto, le cellule dovrebbero essere ben distanziate e presentare una morfologia caratteristica. Successivamente, aspirare con attenzione i due millilitri superiori di mezzo da ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente le cellule del midollo osseo. Evitare di aspirare le cellule del midollo osseo, che di solito sono concentrate al centro del pozzetto.Aggiungere tre millilitri di supernatante virale appena integrato in ogni pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente cellule del midollo osseo. Dopo aver avvolto le piastre nella pellicola, come in precedenza, ripetere la trasduzione mediante centrifugazione, quindi posizionare le piastre senza pellicola nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 24 ore, al terzo giorno, rimuovere e sostituire due millilitri di mezzo dai pozzetti.Nel quarto giorno, raccogliere le cellule del midollo osseo dalla piastra a sei pozzetti lavando vigorosamente con PBS, quindi raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule a 300 ×g per 10 minuti a 4 °C, decantare il sopranatante e risospendere il midollo osseo in un millilitro di PBS contenente lo 0,5 percento di FBS inattivato per riscaldamento. Porre il tubo contenente le cellule sul ghiaccio.Successivamente, dopo aver effettuato un conteggio cellulare, risospendere il midollo osseo in un volume sufficiente di PBS contenente lo 0,5 percento di FBS inattivato per riscaldamento, in modo da iniettare almeno due volte 10 alla sesta cellule in un volume di 200-300 microlitri per topo. Infine, utilizzando una micropipetta, prelevare un campione di 10 microlitri per ogni condizione di midollo osseo e aggiungerlo a 100 microlitri di PBS per l'analisi dell'efficienza di trasduzione mediante citometria a flusso. L'efficienza di trasduzione delle cellule del midollo osseo è stata analizzata in base al marcatore fluorescente ametrina.Il pannello di sinistra mostra la diffusione anteriore e laterale delle cellule del midollo osseo dopo cinque giorni di coltura. Il pannello di destra è stato selezionato in base all'ametria impositiva e include le cellule del midollo osseo transdotte. Una transduzione del midollo osseo riuscita produrrà una percentuale di cellule fluorescenti positive compresa tra il 25 e il 70 percento.Questa immagine mostra linfociti T retrogenici per il recettore dei linfociti T nel sangue periferico a sei settimane dal trapianto del midollo osseo. Dopo la lisi dei globuli rossi, le cellule rimanenti sono state marcate per il recettore beta dei linfociti T. Il pannello destro mostra un'analisi rappresentativa dell'espressione di ametrina e dell'anticorpo anti recettore beta dei linfociti T.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasdurre retroviralmente e coltivare cellule del midollo osseo per rigenerare topi retrogenici.

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Immunologia e Infezioni

Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l'induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Dimostriamo qui che riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) può essere utilizzato come uno strumento per generare modelli di topo con pre-definito recettore delle cellule T (TCR) specificità. Questi topi transnuclear esprimono il corrispondente TCR dal loro luogo endogena sotto il controllo del promotore endogeno.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

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Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

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Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B

La generazione e la caratterizzazione di cellule T specifiche tumorali usando topi umanizzati è descritto qui. Umana tessuto timico e geneticamente modificate cellule staminali ematopoietiche vengono trapiantate in topi immunocompromessi. Ciò comporta la ricostituzione di un ingegnerizzato sistema immunitario umano consentendo in esame vivo delle risposte immunitarie anti-tumorali.

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La manipolazione dell'espressione genica temporale nelle cellule staminali embrionali (ESC) differenzianti può essere ottenuta utilizzando sistemi genici inducibili. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari è costosa e richiede tempo. Questo protocollo consente di ottenere una rapida espressione di un transgene in cellule derivate da ES in differenziazione e la successiva analisi della differenziazione ematopoietica a valle.

L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.

Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

I combines di protocollo corrente singola cella coppia umana TCR alfa e beta catena sequenziamento con snella generazione di vettori retrovirali compatibile con espressione TCR in vitro e in vivo .

Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

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Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione retrovirale e il trasferimento adottivo di cellule murine B-1a per esaminare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a in vivo. Questo protocollo può essere esteso per diversi saggi funzionali a valle, tra cui la quantificazione della localizzazione cellulare B-1a del donatore o l'analisi dei fattori seminati derivati dalla cellula donatrice durante il trasferimento post-adozione.

Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

Presentiamo un protocollo per la trasduzione retrovirale dell'RNA guida in cellule T primarie da topi transgenici Cas9, fornendo un'alternativa efficiente per l'editing genetico nello studio del differenziamento Th17.

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

Scopri la trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare topi retrogenici e studiare la funzione in vivo dei recettori T. Questo metodo consente di analizzare diversi TCR specifici per antigeni.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

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