Rapid high-throughput Specie Identificazione del materiale botanico Utilizzando l'analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione Spettrometria di Massa

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare le specie di materiale botanico utilizzando la spettrometria di massa a ionizzazione ambientale. In combinazione con l'analisi statistica multivariata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica e della biologia come, ad esempio, quale specie di pianta hai in base alla sua impronta chimica.

E puoi anche ottenere informazioni sulle molecole bioattive che si trovano nel tessuto vegetale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è necessaria pochissima preparazione del campione per l'analisi e i dati possono essere acquisiti in pochi minuti. Questo metodo può essere utilizzato anche per risolvere altri problemi in chimica.

Ad esempio, il monitoraggio degli intermedi di reazione e dei prodotti nella sintesi organica, l'analisi di matrici complesse di diversi tipi e l'analisi dello spazio di testa. Per preparare il materiale fogliare fresco di kratom, utilizzare un perforatore di sei millimetri di diametro per creare ciuffi uniformi di materiale fogliare di kratom dalla pianta M.speciosa. Ripeti questo processo cinque volte.

Per estrarre la polvere di kratom, lavorare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e sospendere una piccola quantità di polvere di kratom Bali in un millilitro di una miscela di solvente da etanolo a uno per acqua. Ripeti questo processo cinque volte. Sonicare i campioni di estratto di polvere di kratom Bali in un bagno a ultrasuoni per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, centrifugare i campioni di estratto di polvere di kratom Bali per due minuti a 750 volte G a temperatura ambiente. Decantare il solvente dalla polvere residua per la successiva analisi. Per preparare i semi di datura, tagliare a metà un seme di D.stramonium sul piano trasversale utilizzando una lametta.

Ripeti questo processo usando cinque semi diversi. Dopo aver impostato lo spettrometro di massa o i parametri MS come descritto nel protocollo di testo, premere Start Run nel software di controllo dello spettrometro di massa per analizzare la foglia di kratom. Sospendi il ciad di materiale vegetale di foglie di kratom tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa con una pinzetta fino ad ottenere uno spettro.

Ripeti questa procedura cinque volte con pezzi separati di materiale vegetale. Per calibrare lo spettro con il PEG abbreviato in polietilenglicole 600, immergere l'estremità chiusa di un tubo capillare per il punto di fusione nello standard del piolo. Sospendere il capillare rivestito tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa.

Selezionare il pulsante Interrompi per terminare l'esecuzione analitica. Premi Start Run nel software di controllo dello spettrometro di massa per analizzare la foglia di kratom essiccata. Sospendi una piccola quantità di materiale fogliare essiccato tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa con una pinzetta fino ad ottenere uno spettro.

Ripeti l'acquisizione cinque volte analizzando ogni volta nuovo materiale vegetale. Calibrare lo spettro con PEG come in precedenza, quindi selezionare il pulsante Stop per terminare l'esecuzione analitica. Per analizzare la polvere di kratom, premere Start Run nel software di controllo dello spettrometro di massa.

Immergi l'estremità chiusa di un capillare del punto di fusione nella polvere di kratom. Sospendere il capillare rivestito tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa fino ad ottenere uno spettro. Ripetere l'analisi cinque volte con un nuovo capillare ogni volta, seguita dalla calibrazione PEG.

Per analizzare l'estratto di kratom, immergere l'estremità di un tubo capillare nell'estratto. Sospendere il tubo capillare nel supporto per 12 campioni sulla guida lineare dello spettrometro di massa. Ripeti cinque volte con un estratto diverso ogni volta.

Premere Start Run nel software di controllo dello spettrometro di massa. Utilizzando il pannello di controllo, selezionare il pulsante di avanzamento in avanti per far avanzare la guida lineare attraverso il flusso di ioni a una velocità di un millimetro al secondo per raccogliere gli spettri. Calibrare lo spettro con PEG come prima e premere Stop per terminare l'esecuzione analitica.

Per analizzare i semi di datura premere Start Run nel software di controllo dello spettrometro di massa. Sospendi la metà del seme di datura tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa con una pinzetta fino a quando non viene raccolto uno spettro. Assicurarsi che il lato di taglio sia orientato verso la sorgente ionica.

Ripeti questa procedura cinque volte analizzando ogni volta una nuova metà del seme. Completare l'analisi con la calibrazione PEG e premere Stop per terminare l'esecuzione analitica. Dopo aver eseguito l'elaborazione dei dati come descritto nel protocollo di testo, eseguire l'analisi dei componenti principali accedendo alla sezione Classifica del software di analisi spettrale nella scheda Configurazione e creando classi per l'elaborazione dei dati selezionando Aggiungi classe.

Importare i file di testo dei dati selezionando Aggiungi file. Assegnare i file di dati alla classe di impianto appropriata selezionando File di testo e Imposta classe per i file selezionati. Selezionare le masse delle caratteristiche per la discriminazione da MS dal set di addestramento e impostare la percentuale di soglia su 1%Successivamente, impostare una tolleranza di massa su 10 e selezionare Crea vettori da file di dati.

Nella sezione Calcola eseguire l'analisi dei componenti principali selezionando la casella per Grafico PCA 3D e selezionare Calcola. Eseguire la convalida incrociata leave-one-out selezionando Convalida. Quindi, generare la mappa di calore dei dati navigando nella scheda Grafico di frequenza del software di analisi spettrale e selezionando Mappa di calore.

Selezionare Soglia dati salvati per impostare la soglia di abbondanza su 1%Esportare la mappa termica in un foglio di calcolo selezionando Salva mappa termica in Excel. Nel programma per fogli di calcolo, salva la mappa di calore esportata come file di testo. Quindi, per eseguire l'analisi del clustering gerarchico, importare la mappa di calore come file di testo nel software Cluster 3.0.

Nella scheda Gerarchica di Cluster 3.0, in Geni e array, nelle caselle di controllo Cluster e Calcola pesi. Impostate il cutoff su 0,1 e l'esponente su uno. Selezionare il clustering a collegamento singolo per eseguire l'analisi.

Infine, visualizza il file di dati cdt generato nella visualizzazione ad albero Java. Qui sono mostrati gli spettri rappresentativi della modalità ionica positiva a ionizzazione morbida dei prodotti a base di kratom. Sono stati identificati composti precedentemente isolati da M. speciosa.

Compresi i biomarcatori psicoattivi Mitraginina e 7-idrossi-mitraginina. Qui sono mostrati spettri rappresentativi della modalità ionica positiva a ionizzazione morbida dei semi di datura. Sono stati identificati composti precedentemente isolati dalla datura, tra cui i biomarcatori psicoattivi atropina e scopolamina.

I rendering della mappa di calore dei dati di spettrometria di massa sono illustrati qui. Viene mostrata un'analisi dei componenti principali o un grafico PCA dei dati di kratom e datura. Il grafico PCA mostra chiaramente che i dati sul kratom e i dati sulla datura sono ben risolti l'uno dall'altro.

L'analisi PCA ha anche rivelato che le singole varietà di kratom e le diverse specie di datura possono essere identificate e distinte l'una dall'altra. Vengono mostrati i risultati dell'analisi gerarchica dei clustering gerarchici o HCA dei dati spettrali di massa del kratom e della datura. I risultati dell'HCA hanno rivelato la differenziazione di classe, specie e varietà esclusivamente sulla base di analisi diretta in dati derivati dalla spettrometria di massa ad alta risoluzione in tempo reale e hanno confermato i risultati dell'analisi PCA.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora a seconda del numero di campioni che hai, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'analisi diretta e la spettrometria di massa in tempo reale per analizzare campioni complessi e utilizzare l'elaborazione dell'analisi statistica dei dati per ottenere informazioni sulle specie. Durante il tentativo di questa procedura è importante tenere il campione nel flusso ionico per un periodo di tempo appropriato al fine di acquisire uno spettro di massa completo del campione.

Questa tecnica ha permesso ai ricercatori in molti campi, tra cui l'omia vegetale, la medicina legale, la chimica organica e analitica, di esplorare l'analisi dei volatili emessi dalle piante, identificare alternative legali per suscitare droghe e monitorare i prodotti di reazione in tempo reale.