Rapid high-throughput Specie Identificazione del materiale botanico Utilizzando l'analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione Spettrometria di Massa

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare la specie di materiale botanico utilizzando la spettrometria di massa con ionizzazione ambientale. In combinazione con l'analisi statistica multivariata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della chimica e della biologia, come, ad esempio, quale specie di pianta si possiede in base alla sua impronta chimica.

È inoltre possibile ottenere informazioni sulle molecole bioattive presenti nel tessuto vegetale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è richiesta una preparazione minima del campione per l'analisi e i dati possono essere acquisiti entro pochi minuti. Questo metodo può essere utilizzato anche per risolvere altri problemi in chimica.

Ad esempio, il monitoraggio di intermedi e prodotti di reazione nella sintesi organica, l'analisi di matrici complesse di diversi tipi e l'analisi del headspace. Per preparare il materiale fresco di foglie di kratom, utilizzare un perforatore da sei millimetri di diametro per creare frammenti uniformi di foglie di kratom provenienti dalla pianta di M. speciosa. Ripetere questo processo cinque volte.

Per estrarre la polvere di kratom, lavorare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e sospendere una piccola quantità di polvere di kratom Bali in un millilitro di una miscela solvente etanolo-acqua uno a uno. Ripetere questo processo cinque volte. Sottoporre i campioni di estratto di polvere di kratom Bali a sonificazione in un bagno ad ultrasuoni per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, centrifugare i campioni di estratto di polvere di kratom Bali per due minuti a 750 ×g a temperatura ambiente. Decantare il solvente dalla polvere residua per l'analisi successiva. Per preparare i semi di datura, tagliare a metà un seme di D.stramonium lungo il piano trasversale utilizzando una lametta.

Ripetere questo processo utilizzando cinque semi diversi. Dopo aver configurato i parametri dello spettrometro di massa o MS come descritto nel protocollo testuale, premere Avvia Analisi nel software di controllo dello spettrometro di massa per analizzare la foglia di kratom. Sospendere il frammento di materiale vegetale della pianta di kratom tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa con una pinzetta fino a ottenere uno spettro.

Ripetere questa procedura cinque volte con campioni separati di materiale vegetale. Per calibrare lo spettro con polietilene glicole 600, abbreviato PEG, immergere l'estremità chiusa di un capillare per punto di fusione nella soluzione standard di PEG. Sospendere il capillare rivestito tra la sorgente di ioni e l'ingresso dello spettrometro di massa.

Selezionare il pulsante Arresta per terminare la corsa analitica. Premere Avvia corsa nel software di controllo dello spettrometro di massa per analizzare la foglia di kratom essiccata. Sospendere una piccola quantità di materiale di foglia essiccata tra la sorgente di ioni e l'ingresso dello spettrometro di massa con pinzette finché non si ottiene uno spettro.

Ripetere l'acquisizione cinque volte, analizzando ogni volta nuovo materiale vegetale. Calibrare lo spettro con PEG come in precedenza, quindi selezionare il pulsante Arresta per terminare la corsa analitica. Per analizzare la polvere di kratom, premere Avvia corsa nel software di controllo dello spettrometro di massa.

Immergere l'estremità chiusa di un capillare per punto di fusione nella polvere di kratom. Sospendere il capillare rivestito tra la sorgente ionica e l'ingresso dello spettrometro di massa fino a ottenere uno spettro. Ripetere l'analisi cinque volte utilizzando un capillare nuovo ogni volta, seguita da calibrazione con PEG.

Per analizzare l'estratto di kratom, immergere l'estremità di un tubo capillare nell'estratto. Sospendere il tubo capillare nel portacampioni 12 sulla guida lineare dello spettrometro di massa. Ripetere cinque volte utilizzando un estratto diverso ogni volta.

Premere Avvia esecuzione nel software di controllo dello spettrometro di massa. Utilizzando il pannello di controllo, selezionare il pulsante di avanzamento per far avanzare il binario lineare attraverso il flusso ionico a una velocità di un millimetro al secondo per raccogliere gli spettri. Calibrare lo spettro con PEG come in precedenza e premere Arresta per terminare l'esecuzione analitica.

Per analizzare i semi di datura, premere Avvia Esecuzione nel software di controllo dello spettrometro di massa. Tenere con una pinzetta metà del seme di datura tra la sorgente di ioni e l'ingresso dello spettrometro di massa fino a quando non viene acquisito uno spettro. Assicurarsi che la superficie tagliata sia orientata verso la sorgente di ioni.

Ripetere questa procedura cinque volte, analizzando ogni volta una nuova metà di seme. Completare l'analisi con la calibrazione PEG e premere Stop per terminare la corsa analitica. Dopo aver eseguito l'elaborazione dei dati come descritto nel protocollo testuale, eseguire l'analisi delle componenti principali andando alla sezione Classify del software di analisi spettrale sotto la scheda Setup e creando classi per l'elaborazione dei dati selezionando Add Class.

Importare i file di testo dei dati selezionando Aggiungi file. Assegnare i file di dati alla classe di pianta appropriata selezionando File di testo e Imposta classe per i file selezionati. Selezionare le masse caratteristiche per la discriminazione da MS a partire dal set di addestramento e impostare la soglia percentuale all'1%. Successivamente, impostare una tolleranza di massa a 10 e selezionare Crea vettori dai file di dati.

Nella sezione Calcolo, eseguire l'analisi delle componenti principali selezionando la casella per il Grafico PCA 3D e fare clic su Calcola. Eseguire la validazione incrociata leave-one-out selezionando Convalida. Successivamente, generare la mappa termica dei dati passando alla scheda Plot di Frequenza del software di analisi spettrale e selezionando Mappa Termica.

Selezionare i dati salvati della soglia per impostare la soglia di abbondanza all'1%. Esportare la mappa termica in un foglio elettronico selezionando Salva mappa termica in Excel. Nel programma di foglio elettronico, salvare la mappa termica esportata come file di testo. Successivamente, per eseguire l'analisi di clustering gerarchico, importare la mappa termica come file di testo nel software Cluster 3.0.

Nella scheda Gerarchica di Cluster 3.0, sotto le caselle Geni e Array, selezionare Cluster e Calcola pesi. Impostare la soglia a 0,1 e l'esponente a uno. Selezionare il raggruppamento a collegamento singolo per eseguire l'analisi.

Infine, visualizzare il file di dati cdt generato nella vista ad albero di Java. Qui vengono mostrati spettri rappresentativi in modo ionizzazione morbida con ioni positivi di prodotti di kratom. Sono stati identificati composti precedentemente isolati da M. speciosa.

Inclusi i biomarcatori psicoattivi mitraginina e 7-idrossimitraginina. Vengono mostrati qui spettri rappresentativi in modalità ione positivo con ionizzazione soft di semi di datura. Sono stati identificati composti precedentemente isolati da datura, inclusi i biomarcatori psicoattivi atropina e scopolamina.

Rappresentazioni grafiche sotto forma di mappa termica dei dati spettrometrici di massa sono illustrate qui. Viene mostrato un grafico di analisi delle componenti principali, o PCA, relativo ai dati di kratom e datura. Il grafico PCA mostra chiaramente che i dati del kratom e quelli del datura sono ben distinti l'uno dall'altro.

L'analisi PCA ha inoltre rivelato che le singole varietà di kratom e le diverse specie di datura possono essere identificate e distinte l'una dall'altra. Sono mostrati i risultati dell'analisi gerarchica di clustering (HCA) dei dati spettrali di massa di kratom e datura. I risultati dell'HCA hanno evidenziato una differenziazione a livello di classe, specie e varietà, basata esclusivamente sui dati ottenuti mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione con analisi diretta in tempo reale, confermando così i risultati dell'analisi PCA.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora, a seconda del numero di campioni disponibili, se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare l'analisi diretta e la spettrometria di massa in tempo reale per analizzare campioni complessi e di come applicare l'elaborazione statistica dei dati per ottenere informazioni sulle specie. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante mantenere il campione nel flusso ionico per un tempo appropriato al fine di acquisire uno spettro di massa completo del campione.

Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di molti settori, tra cui l'Omica Vegetale, la Biologia Forense, la Chimica Organica e Analitica, di analizzare i composti volatili emessi dalle piante, identificare alternative legali per indurre effetti simili a quelli delle droghe e monitorare in tempo reale i prodotti delle reazioni.