Name: Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Scopri come fabbricare complessi polielettrolitici con eparina e protamina per il rilascio controllato di fattori di crescita osteogenici. Questo metodo riduce significativamente il dosaggio di BMP-2 nelle applicazioni di fusione spinale.

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Questi studi sono stati finanziati dal National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 e NMRC EDG/0022/2008.

1. alginato Soluzione Preparazione <ol><li> Sciogliere 200 mg di alginato di sodio (non irradiati) o 400 mg di 8 MRad irradiato alginato di sodio in 10 ml di acqua bidistillata e agitare per 1 ora per alginato non irradiata e 15 min per alginato irradiato. Conservare la soluzione di alginato a 4 ° C durante la notte. Filtrare la soluzione di alginato con un filtro siringa da 0,2 micron sterile prima alginato fabbricazione microperla. </li></ol> 2. alginato microperla Fabrication <ol><li> Disinfettare il generatore elettrostatico tallone e pompa a siringa con il 70% di etanolo e metterli in una classe II Cappa di sicurezza biologica (Figura 1). </li><li> Posizionare un bacino di vetro con un bastoncino magnetico all&#39;interno del generatore tallone. </li><li> Impostare l&#39;elettrodo braccio del generatore tallone 9 cm sopra il bacino. </li><li> Collegare il cavo elettrodo del generatore tallone alla vite zigrinata 2 dell&#39;elettrodo braccio e versare 80 ml ​​di soluzione 2 nel SRCLbacino. </li><li> Carico 5 ml di 0,2 micron soluzione di alginato filtrata nel tubo siringa e gomma. Dopo aver collegato il tubo di gomma all&#39;elettrodo braccio, accendere la pompa a siringa a 5 ml / h per 2 minuti per espellere l&#39;aria all&#39;interno del tubo e fornire la soluzione di alginato alla punta dell&#39;ugello. Spegnere la pompa a siringa. </li><li> Successivamente, accendere encapsulator e poi, la pompa a siringa per iniziare la generazione microperla. Impostare la velocità di flusso di alginato a 5 ml / ora e la tensione a 5,8 kV sul encapsulator. Scartare le microsfere generate durante i primi due minuti (o la soluzione di alginato iniziali 0,5 ml pompato dalla siringa), in quanto queste microsfere tendono ad essere irregolare dimensioni e forma. </li><li> Raccogliere le successive microsfere di soluzione di cloruro di 0,2 M di stronzio. Spegnere sia la pompa a siringa e encapsulator (in questo ordine) dopo il pompaggio il volume pre-pianificata di soluzione di alginato. Ripetere questa operazione per le successive partite di microperla fabbricazione. Al termine, girare dif la pompa a siringa prima, seguita dalla encapsulator. </li><li> Conservare le microsfere in 20 ml di soluzione di cloruro di stronzio 0.2 M a 4 ° C per una notte per completare reticolazione e stabilizzare il gel. </li></ol> 3. Misurazione Dimensioni di microperle alginato <ol><li> Raccogliere 0,5 ml di microsfere di alginato con una pipetta di plastica e posizionarlo su un vetrino. Guarda le microsfere sotto un microscopio ottico a 10X di ingrandimento. Prendere dieci immagini delle microsfere con una telecamera CCD microscopio. Salvare le immagini con barra della scala (500 micron) in formato TIFF a una risoluzione di 2.048 x 1.536. </li><li> Utilizzando gli strumenti di lunghezza in ImageJ, misurare le dimensioni delle microsfere e barra di scala (figura 2). Convertire la lunghezza microperle da pixel a micrometro. <ol><li> Clicca sugli strumenti di linea e tracciare una linea attraverso il centro del tallone alginato. </li><li> Fai clic su &quot;Analizza&quot; sulla barra dei menu e selezionare &quot;Measure&quot;. Viene visualizzata una finestra pop-up. </li><li&gt; Ripetere i punti 3.2.1-3.2.2 per misurare tutte le perline alginato all&#39;interno dell&#39;immagine. Misurare la barra della scala sull&#39;immagine. </li><li> Convertire il diametro del tallone alginato alla lunghezza reale utilizzando la formula: lunghezza del cordone di alginato / lunghezza della barra della scala x 500 um. Ad esempio, 1.420 (il diametro misurato da ImageJ) / 2.657 (scala di lunghezza misurata dal bar ImageJ) * 500 micron = 267 micron. </li></ol></li><li> Si consideri la dimensione media di 100 microsfere (media ± deviazione standard) come la dimensione rappresentativo di ciascun lotto di microsfere. </li></ol> 4. Sterilizzazione <ol><li> Raccogliere le microsfere con un 100 micron nylon colino e lavare le perline con acqua bidistillata. </li><li> Utilizzando una spatola, trasferire tutti i microperle fatte da 0,1 ml di soluzione di alginato in una provetta 2 ml e coprire con una garza per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Infine, sterilizzare le microsfere in autoclave utilizzando la modalità di liquido (115 ° C, 15 min) o in conformità con mle specifiche del fabbricante. Aggiungere 1,5 L di acqua distillata alla camera per evitare perline da essiccazione. </li></ol> 5. protamina e Eparina Coating <ol><li> All&#39;interno della cappa BSL-2, incubare le microsfere sterili con 1 ml di 2 mg / ml soluzione protamina (sterilizzato utilizzando un filtro a siringa da 0,2 micron) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione le microsfere per 1 ora (Step 5.1), raccogliere 150 ml di soluzione di protamina per il test di micro acido bicinconinico (microBCA) (sezione 6). </li><li> Lavare le microsfere rivestite protamina due volte con acqua bidistillata. Spin giù utilizzando una centrifuga da banco a 200 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare l&#39;acqua con una siringa. </li><li> Incubare rivestito protamina microsfere con 1 ml di 0,5 mg / ml soluzione di eparina (sterilizzato utilizzando un filtro a siringa da 0,2 micron) per 30 minuti per creare complessi polielettrolita (PEC). </li><li> Dopo l&#39;incubazione il rivestito protamina microsfere fo 30 minuti (punto 5.4), raccogliere 400 ml di soluzione di eparina per determinare il contenuto di eparina (sezione 7). </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare l&#39;eparina non legato dai PEC lavando due volte con acqua bidistillata. </li></ol> 6. protamina contenuti <ol><li> Eseguire il test microBCA secondo le istruzioni del produttore. In breve, aggiungere 150 ml soluzione di protamina (raccolti prima e dopo incubazione con microsfere) in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 150 ml soluzione di lavoro microBCA. </li><li> Utilizzare soluzione di albumina (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 e 200 mcg / ml) come standard di calibrazione. </li><li> Incubare la miscela per 60 minuti a 60 ° C. Misurare l&#39;assorbanza con uno spettrofotometro a 562 nm. </li><li> Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di protamina ciascun campione sconosciuto secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Determinare il contenuto protamina delle microsfere sottraendo la quantità totale di protamina nelsoluzione di rivestimento (prima dell&#39;incubazione con microsfere) dalla quantità di protamina rimanente nella soluzione di rivestimento (dopo incubazione con microsfere). </li></ol> 7. eparina contenuti <ol><li> Preparare i 10 ml di soluzione di lavoro sciogliendo 4 mg blu di toluidina e 20 mg di cloruro di sodio in 0,01 N di acido cloridrico. </li><li> Aggiungere 400 microlitri di campione (dal punto 5.5) alla soluzione di lavoro con un rapporto di 2: 3 e vortex per 30 sec. </li><li> Aggiungere 600 ml di n-esano (volume equivalente alla soluzione di reagente di lavoro) e agitare la miscela per estrarre il toluidina complesso eparina blu. </li><li> Aspirare 200 ml di fase acquosa di siringa dopo la separazione di fase. </li><li> Misurare la quantità di blu di toluidina un-estratto contenuta nella fase acquosa utilizzando uno spettrofotometro a 631 nm. </li><li> Preparare soluzioni standard con eparina di 0-20 mg / ml. </li><li> Tracciare la lettura 631 nm di ogni standard di eparina vs concentrazione di eparina in mg / ml. Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di eparina di ciascun campione. </li></ol> 8. confocale Immagine di Struttura Layer-by-layer <ol><li> Fabbricare protamina, eparina e Nell-1 / BMP-2 analogico fluorescente CF-405 protamina (blu), CF 594 eparina (rosso) e FITC etichettato Nell-1 / FITC marcato (verde) BMP-2 + eparina + protamina secondo il fornitore di scheda tecnica. </li><li> Coat 100 mcg microsfere con 300 ml di analogico fluorescente (metodo di rivestimento come descritto in 5,3-5,6) CF-405 protamina (blu) (2 mg / ml, incubazione 1 ora), CF 594 eparina (rosso) (0,5 mg / ml, 30 min) e FITC etichettati Nell-1 / FITC marcato (verde) BMP-2 (1,5 mg / ml, durante la notte). Lavare le microsfere due volte con acqua distillata per eliminare la non legato protamina fluorescenti, eparina e Nell-1 / BMP-2. </li><li> Osservare la struttura layer-by-layer (Figura 3) utilizzando un microscopio confocale a ingrandimento 10X. 7 </li></ol> 9. BMP-2e Nell-1 assorbimento e di rilascio <ol><li> Carico 13.3 ml di 1,5 mg / ml di BMP-2 o NELL-1 soluzione sul 100 mg di PEC. Incubare PEC a 4 ° C sotto i 30 giri che agitano le 10 ore. </li><li> Porre le microsfere in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C con costante agitazione (30 rpm). </li><li> Raccogliere 1 ml del supernatante e sostituirlo con 1 ml di PBS dopo 1, 3, 6, 10 e 14 giorni. </li><li> Valutare l&#39;assorbimento e il rilascio efficienza della BMP-2 con il metodo ELISA secondo il protocollo del produttore. Valutare l&#39;assorbimento e il rilascio efficienza di Nell-1 utilizzando il metodo di determinazione della proteina carboxybenzoyl chinolina-2-carboxaldehyde (CBQCA) secondo il protocollo del produttore. </li><li> Determinare rilascio progressivo al tempo (t): rilascio cumulativo al momento (t) = uscita al momento (t) + rilascio precedente al momento (t-1). </li><li> Tracciare rilascio cumulativo di BMP-2 e Nell-1 contro il tempo. </li></ol> 10. In Vitro bioattivitàdi Nell-1 Nota: la bioattività di Nell-1 rilasciato dalla PEC è stata valutata misurando la sua capacità di aumentare l&#39;espressione di fosfatasi alcalina (ALP) nelle cellule staminali del midollo coniglio ossee (rBMSC). <ol><li> Seed 20.000 rBMSCs per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e consentire loro di crescere per un giorno con 1 ml di Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) + 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di 1 ml di un mezzo osteogenico (DMEM supplementato con 10% FBS, 2% di penicillina streptomicina, / ml di acido ascorbico 50 mg, 10 mmol / L beta-glicerofosfato e 10 -8 mol / L desametasone ) per 7 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Mettere 300 mg PEC-nell-1 (dal punto 8.2) e PEC all&#39;interno inserti colture cellulari (TC insert) per mantenere i PEC separati dalle cellule (questo evita il dilavamento delle microsfere PEC durante la osteogenica cambio medio). Luogo TC inserire nel 24 ben plmangiato per 14 giorni. </li><li> Una volta ogni tre giorni, aspirare 1 ml del mezzo osteogenico inserendo un ago al di fuori l&#39;inserto TC, e sostituirlo con 1 ml di mezzo fresco osteogenico. </li><li> Dopo 7 e 14 giorni di incubazione, determinare l&#39;attività ALP con un kit di test ALP secondo il protocollo del produttore del kit. <ol><li> cellule Lisare con tampone contenente 0,1% TritonX-100 a 4 ° C per 10 min. Raschiare le cellule aderito con un raschietto cellulare. Incubare sospensione cellulare a 4 ° C sotto agitazione per almeno 60 min. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 2500 xga 4 ° C per 10 min. Raccogliere il surnatante per il saggio ALP. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione standard di fosfatasi alcalina serialmente diluiti 200-0 ng / ml ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Gli importi finali delle serie fosfatasi alcalina sono 10, 5, 2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15, e 0 ng / pozzetto. </li><li> Aggiungere il surnatante dal punto 10.5.2 (50 ml / pozzetto) e diluire con la diluizione bUffer. </li><li> Aggiungere 50 ml di p -nitrophenyl soluzione di fosfato (pNPP) substrato in ciascun pozzetto. Mescolare i reagenti agitando delicatamente la piastra per 30 sec. Incubare la miscela per 30 minuti al buio. Misurare l&#39;assorbanza a 405 nm con lettore di piastre. </li><li> Calcola l&#39;attività ALP alla curva di taratura. </li></ol></li><li> Determinare contenuto proteico utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​microBCA secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare l&#39;attività ALP dividendo l&#39;attività ALP dal contenuto proteico. </li></ol> 11. vitalità cellulare <ol><li> Incubare 200 mg di PEC-nell-1 con 1 ml di DMEM + 10% FBS a 37 ° C per 24 ore per la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) saggio. </li><li> Seme 2.000 rBMSCs per pozzetto (in 100 ml di DMEM con 10% FBS) in una piastra da 96 pozzetti e incubare per 1 giorno a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Sostituire DMEM + 10% FBS con 100 ml di estratto di PEC-nell-1 / PEC e incubarea 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Dopo 1 giorno o 3 giorni di incubazione, aggiungere 10 ml di 5 mg / ml soluzione MTT e in seguito incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 4 ore al buio. </li><li> Aggiungere 100 ml di DMSO soluzione ad ogni pozzetto per sciogliere i cristalli formazano. </li><li> Determinare l&#39;assorbanza a 570 nm con un lettore di micropiastre. </li><li> Calcolare il tasso di crescita relativo: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> 12. Imballaggio in Ponteggio e BMP-2 &amp; NELL-1 Caricamento in corso <ol><li> Confezione i PEC nei pori di una bioresorbable grado medico Polycaprolactone - fosfato tricalcico (MPCL-TCP) scaffold usando una spatola sterilizzato all&#39;interno di una camera BSL-2. </li><li> Aggiungere 1,5 mg / ml soluzione di BMP-2 o NELL-1 sul patibolo MPCL-TCP imballato con PEC e incubare una notte a 4 ° C. </li></ol>

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<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

Non abbiamo alcun conflitto di interessi.

Questo protocollo presenta un metodo per la preparazione dei PEC attraverso layer-by-layer autoassemblaggio. La struttura layer-by-layer viene visualizzato per mezzo analoghi fluorescenti di protamina, eparina, microscopia BMP-2 e Nell-1 e confocale. Assorbimento e rilascio prove dimostrano che l&#39;eparina sulla PEC media osteogenica fattore di crescita l&#39;assorbimento e il rilascio. L&#39;efficienza di assorbimento del metodo PEC è: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Il vettore PEC ha una migliore modulazion...

L&#39;incidenza di pseudoartrosi è stato segnalato per essere alto come 10 a 45% in degenerative fusione spinale e revisione chirurgia spinale 1. Per ridurre il tasso di pseudoartrosi durante la fusione spinale e altri interventi chirurgici ricostruttivi ossa, fattori di crescita osteogeniche come BMP-2, Nell-1 1 e fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) sono stati introdotti per la promozione de novo osteogenesi. Tra questi, BMP-2 è una scelta popolare per la fusione spinale 2. Sebbene la potenza di BMP-2 nell&#39;induzione e facilitare la formazione di nuovo osso è stato ben stabilito 3; complicanze clinicamente significative come la formazione di osso eterotopico, sieroma e formazione di ematomi, la risposta infiammatoria, radicolite, vertebrali osteolisi corpo, e eiaculazione retrograda continuano ad essere questioni di interesse a causa degli importi utilizzati sovrafisiologici 4,5. Pertanto, abbassando la dose di BMP-2 rimane una strategia rilevante in alletenta di ridurre al minimo gli effetti collaterali. Inoltre, i sistemi di trasporto efficienti sono tenuti a sopprimere il rilascio scoppio iniziale di BMP-2 osservata in sistemi di trasporto spugna di collagene contemporanea e rafforzare ulteriormente la consegna prolungata e localizzato di questo potente citochina. Il layer-by-layer autoassemblaggio di alternare polielettroliti cationici ed anionici può essere impiegato come metodo sintonizzabile per costruire complessi polielettroliti sulla superficie delle matrici impalcature o materiali impiantabili 6. A questo proposito, eparina (noto per avere la più alta densità di carica negativa di tutti gli agenti biologici) è stato riconosciuto di impegnare avidamente con una varietà di fattori di crescita tramite domini elettrostatiche ed eparina vincolanti. Infatti, eparina ha dimostrato di prolungare l&#39;emivita e potenziarne la bioattività di diversi fattori di crescita così. Sulla base di questo, il nostro gruppo adattato un protocollo di auto-assemblaggio layer-by-layer per fabbricare un complesso polielettrolita eparina-based (PEC) che<html> carichi e conserva le bioattività dei fattori di crescita osteogeniche durante l&#39;immobilizzazione 7,8. Il nucleo microbead alginato è stato fabbricato per reticolazione α-L-guluronate (G) residui di alginato con ioni bivalenti cationi di calcio e stronzio. Il nucleo alginato è una matrice scaffold biodegradabili; che dopo l&#39;impianto, viene riassorbito nel letto fusion fornire spazio per crescita ossea. Poly-L-lisina (PLL) o protamina viene utilizzato come strato cationico di intrecciare sia con la matrice scaffold (in questo caso, il nucleo alginato carrier microbead) e l&#39;eparina carica negativa; mentre le funzioni di livello eparina anionici per stabilizzare e localizzare fattori di crescita caricati. Il triplo strato PEC ha dimostrato di aumentare la capacità di carico del fattore di crescita in un modello suino 9. Recentemente, vettori PEC hanno dimostrato di ridurre con successo la dose efficace di BMP-2 di almeno 20 volte nel ratto 10 e modelli suina di fusione spinale 8. S copi &quot;&gt; Qui, riportiamo i metodi di fabbricazione di PEC per una crescita maggiore consegna fattore di fusione spinale e gli altri interventi di chirurgia ricostruttiva delle ossa utilizzando BMP-2 come fattore di modello di crescita osteogenico.

<table><tbody><tr><td>Acrodisc per scienze della vita 25&nbsp; mm Filtro a siringa con 0,2&nbsp; &micro; m Membrana Supor PALL</td><td>&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>Protamina sterile, soluzione di eparina mediante ultrafiltrazione</td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Cell Star&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti Nuclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>Misura della citotossicità di PEC-NELL-1</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Precipitato CF-405 Protamina marcata</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>Misura della citotossicità del kit di</td></tr><tr><td>dosaggio della fosfatasi alcalina (ALP)</td> PEC-BMP-2 <td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>Reagente di arresto nella marcatura FITC</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido anidro (DMSO)</td> <td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Solvente per isotiocianato fluorescente I</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido ( DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Dissolve&nbsp; formazan&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>Sterilizzare le perle di alginato a vapore</td></tr><tr><td>Beta-glicerofosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (Infondere l'innesto osseo Large II Kit)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA</td><td>7510800</td><td>Fattore di crescita osteogenico, la dialisi è necessaria per rimuovere il componente stabilizzatore che interferisce con l'accoppiamento FITC</td></tr><tr><td>Carbossibenzoilchin-2-carbossaldeide (CBQCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>Per quantificare la proteina NELL-1</td></tr><tr><td>Filtro cellulare (100&nbsp; &micro; m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>Tenere PEC per il test ALP</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare 290&nbsp; mm Larghezza lama 20&nbsp; mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>Staccare la cellula dalla piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>CF 405S, Succinimidyl Ester</td><td>Sigma Aldrich SCJ4600013</td><td></td><td>Colorante fluorescente blu per l'etichettatura della protamina</td></tr><tr><td>CF 594, Hydrazide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>Colorante fluorescente rosso intenso per l'etichettatura dell'eparina</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Componente del mezzo di crescita osteogenico</td></tr><tr><td>destrano Colonne di desalinizzazione</td><td>Pierce (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Gibco&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Kit ELISA Quantikine</td><td>R& D System</td><td>DBP200</td><td>Determinare il rilascio di BMP-2</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoesceina, Isomero I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>Colorante fluorescente verde per la marcatura NELL-1 e BMP-2</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari ThinCert, Per piastre a 24 pozzetti, Greiner sterile</td><td>&nbsp;</td><td>662630</td><td>Previene il dilavamento PEC quando si cambia il mezzo osteogenico</td></tr><tr><td>Pompa a siringa Havard Appartus (11 plus)</td><td>Apparato Havard</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-esano (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Si lega con il fattore di crescita osteogenico con dominio di legame dell'eparina</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (37%)</td><td>Merck</td><td>100317</td> Legante per incubatore <td>altamente corrosivo</td></tr><tr><td></td><td>C8150</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine MicroBCA</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>Per saggi ALP e microBCA</td></tr><tr><td>Incapsulatore cellulare Nisco Nisco</td><td>Engineering Inc</td><td>Unità di incapsulamento VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>Scaffold IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP (la dimensione dei pori è 1,3&nbsp; mm)</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>Tenere PEC per studio in vivo</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina 10.000 unità/ml, 100&nbsp; ml</td><td>Coltura cellulare Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x Soluzione,</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina di grado ultra puro MW 15.000-30.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>Sale di solfato di protamina per policatione</td></tr><tr><td>, da Salmon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Agitatore per policatione</td></tr><tr><td></td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi in pelle di serpente 3.500 MWCO 22&nbsp; mm x 35 piedi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>Rimuovere il FITC non reagito mediante dialisi</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>US Biological</td><td>S4000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Cloruro di stronzio Esaidrato</td><td>Sigma Aldrich 255521</td><td></td><td>Crosslinker per alginato</td></tr><tr><td>Spatola</td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>Il diametro della siringa influisce sulla portata</td></tr><tr><td>75 cm2 Pallone per colture cellulari Collo inclinato</td><td>Corning</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>Toluidina Blue</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 52040</td><td>Saggio</td></tr> <tr>dell'eparina<td>Tripsina 1x</td><td>Coltura cellulare di iclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Alginato di sodio</td><td>Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>Materiale di base delle microsfere</td></tr></tbody></table>

polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita osteogenica dominio di consegna

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Durante interventi di chirurgia ricostruttiva di ossa, quantità sovrafisiologici di fattori di crescita sono empiricamente caricati su ponteggi per promuovere fusione ossea successo. Le grandi dosi di agenti biologici molto potenti sono necessari a causa del fattore di crescita instabilità a seguito della degradazione enzimatica rapida nonché inefficienze carrier nella localizzazione di sufficienti quantità di fattore di crescita nei siti implantari. Quindi, le strategie che prolungano la stabilità dei fattori di crescita come la BMP-2 / NELL-1, e controllare il loro rilascio potrebbe effettivamente ridurre il loro dosaggio efficace e quindi ridurre la necessità di dosi più elevate durante i futuri interventi di rigenerazione ossea. Questo a sua volta consentirà di ridurre gli effetti collaterali e costi dei fattori di crescita. PEC auto-assemblati sono stati fabbricati per fornire un migliore controllo della BMP-2 / NELL-1 consegna via vincolante eparina e l&#39;ulteriore crescita potenziare fattore bioattività, migliorando la stabilità in vivo. Qui illustriamo la semplicità di fabbricazione PEC, che aiuta nella delivery di una varietà di fattori di crescita durante chirurgia ricostruttiva ossee.

Nel nostro vettore, protamina stato scelto come sostituto di poli-L-lisina come ha proprietà chimiche simili ed è approvato dalla FDA come antidoto di eparina. Risultati microscopio ottico mostrato che le microsfere non irradiate sono di forma sferica con un diametro di 267 ± 14 micron. (0,35 millimetri ugello, portata di 5 ml / ora e 5,8 kV). La maggior parte delle microsfere irradiati sono di forma a goccia. Il diametro misurato sulla parte turno delle microsfere irradiati era (ugello ...

I complessi polielettrolitici autoassemblati (PEC) fabbricati da eparina e protamina sono stati depositati su perle di alginato per intrappolare e regolare il rilascio di fattori di crescita osteogenici. Questa strategia di somministrazione consente una riduzione di 20 volte della dose di BMP-2 nelle applicazioni di fusione spinale. Questo articolo illustra i vantaggi e la fabbricazione dei PEC.

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

L'obiettivo generale di questa procedura è la fabbricazione di un involucro mediante complessazione di polielettroliti. Un vettore in grado di intrappolare e regolare il rilascio di una vasta gamma di fattori di crescita con un dominio di legame per l'eparina. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale ortopedica per l'intrappolamento efficiente e la somministrazione dedicata di fattori di crescita.I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede spesso l'uso di sostanze organiche, le quali sono note per influenzare le attività biologiche dei fattori di crescita. Sciogliere 200 milligrammi di alginato di sodio non irradiato oppure 400 milligrammi di alginato di sodio irradiato ad otto megarad in 10 millilitri di acqua bidistillata.E agitare per un'ora. Conservare la soluzione di alginato a quattro gradi Celsius durante la notte. Filtrare la soluzione di alginato con un filtro sterile per siringa da 0,2 micron prima della fabbricazione dei microsferette di alginato.Disinfettare il generatore elettrostatico BE e la pompa per siringa con etanolo al 70% e posizionarli all'interno di un cabinet di sicurezza biologica di classe due. Successivamente, posizionare un contenitore di vetro con un agitatore magnetico all'interno del generatore BE. Regolare l'elettrodo a braccio del generatore BE a nove centimetri sopra il contenitore.Collegare il cavo dell'elettrodo del generatore BE al secondo vite neuro dell'elettrodo dell'arto. Versare quindi 80 millilitri di soluzione di cloruro di stronzio nel bacino. Successivamente, caricare cinque millilitri di soluzione di alginato filtrata con filtro da 0,2 micron nella siringa collegata al tubo di gomma.Dopo aver collegato il tubo di gomma all'elettrodo dell'arto, accendere la pompa per siringa a cinque millilitri all'ora. Per due minuti. Per espellere l'aria all'interno del tubo e consegnare la soluzione di alginato alla punta del beccuccio.Quindi, spegnere la pompa per siringa. Per iniziare la generazione di microsfere, impostare l'incapsulatore a 5,8 kilovolt. Seguire con la pompa per siringa a una velocità di flusso di alginato di cinque millilitri all'ora.Scartare le microperle generate nei primi due minuti poiché tendono ad avere dimensioni e forma irregolari. Raccogliere le microperle successive nella soluzione di cloruro di stronzio 0,2 molare. Spegnere la pompa a siringa e successivamente l'encapsulatore.Dopo aver pompato il volume prestabilito di soluzione di alginato, ripetere l'operazione per i successivi lotti di fabbricazione dei microsferule. Conservare le microsferule in 20 millilitri di soluzione di cloruro di stronzio 0,2 M a quattro gradi Celsius durante la notte per completare il reticolaggio e stabilizzare il gel.Raccogliere 0,5 millilitri di microperle di alginato con una pipetta di plastica e posizionarle su un vetrino. Osservare le microperle al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x.Acquisire 10 immagini dei microsferette mediante una telecamera CCD al microscopio. Salvare le immagini in formato TIFF con una barra di scala di 500 micron a una risoluzione di 2048 per 1536. Utilizzando gli strumenti di misura della lunghezza in ImageJ, misurare le dimensioni delle microsferette.E la barra della scala. Quindi convertire la lunghezza del microbead da pixel a micrometri. Fare clic sugli strumenti linea e disegnare una linea attraverso il centro del bead di alginato.Fare clic su "Analizza" nella barra del menu e selezionare "Misura". Apparirà una finestra pop-up. Ripetere questi passaggi per misurare tutte le perle di alginato presenti nell'immagine.Misurare la barra della scala nell'immagine. Raccogliere i microsferette utilizzando il setaccio in nylon da 100 micron. E lavare le sferette con acqua doppio distillata.Utilizzando una spatola, trasferire tutte le microperle ottenute da 0,1 millilitri della soluzione di alginato in una provetta microcentrifuga da due millilitri e coprire con garza per prevenire l'essiccazione. Infine, sterilizzare le microperle mediante autoclavaggio in modalità liquida o seguendo le specifiche del produttore. Aggiungere 1,5 litri di acqua distillata nella camera per evitare che le perle si secchino.All'interno della cappa BSL2, incubare le microsfere sterili con un millilitro di soluzione sterile di protamina a due milligrammi per millilitro per un'ora a temperatura ambiente. Lavare due volte le microsfere ricoperte di protamina con acqua bidistillata. Successivamente, centrifugare utilizzando una centrifuga da banco a 200 ×g per tre minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, aspirare l'acqua utilizzando una siringa. Incubare le microsfere rivestite di protamina con un millilitro di soluzione di eparina sterilizzata 0,5 milligrammi per millilitro per 30 minuti. Questo crea un involucro di complessazione polielettrolitica con elevata affinità per i fattori di crescita legati all'eparina.Dopo l'incubazione, aspirare l'eparina utilizzando una siringa. Lavare via l'eparina non legata dai complessi polielettroliti eseguendo due lavaggi con acqua bidistillata. Caricare 13,3 microlitri di una soluzione di proteina morfogenetica ossea 2 o molecola simile a NELL-1 a 1,5 milligrammi per millilitro su 100 microgrammi del complesso polielettrolite.Incubare il complesso polielettrolitico a quattro gradi Celsius sotto agitazione a 30 giri al minuto per 10 ore. Successivamente, immergere le microsfere in un millilitro di soluzione salina fosfato tampone, o PBS, a 37 gradi Celsius con agitazione costante. Raccogliere un millilitro del soprannatante e sostituirlo con un millilitro di PBS dopo uno, tre, sei, 10 e 14 giorni.Valutare l'efficienza di assorbimento e rilascio della molecola simile a NELL uno mediante il metodo del saggio proteico CBQCA, seguendo il protocollo del produttore. In alternativa, eseguire un ELISA. L'attività biologica della molecola simile a NELL uno rilasciata dal complesso polielettrolitico viene valutata misurandone la capacità di aumentare l'espressione della fosfatasi alcalina in cellule staminali del midollo osseo di coniglio.Sezionare 20.000 cellule staminali dal midollo osseo di coniglio per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Lasciarle crescere per un giorno con un millilitro di mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo osteogenico per sette giorni a 37 gradi Celsius.e 5% CO₂. Posizionare 300 microgrammi di complesso di polielettroliti e complesso di polielettroliti simile alla molecola NELL all'interno di inserti per colture cellulari per mantenere i complessi separati dalle cellule. Inserire l'inserto nella piastra a 24 pozzetti per evitare il lavaggio accidentale dei microgranuli di complesso di polielettroliti durante il cambio del mezzo osteogenico.Ogni tre giorni, aspirare un millilitro del mezzo osteogenico posizionando un ago all'esterno dell'inserzione e sostituirlo con un millilitro di mezzo osteogenico fresco. Dopo sette e 14 giorni di incubazione, determinare l'attività della fosfatasi alcalina mediante un kit per saggio di fosfatasi alcalina.Secondo il protocollo del produttore del kit. Inserire i complessi di polielettroliti nei pori di un'impalcatura bioreassorbibile di policaprolattone e fosfato tricalcico di grado medico. Utilizzando una spatola sterilizzata all'interno di una camera BSL2.Aggiungere una soluzione di 1,5 milligrammi o millilitri di proteina morfogenetica delle ossa due o di una molecola simile a NELL uno sullo scaffold impregnato di complesso polielettrolitico. Incubare tutta la notte a 4 gradi Celsius. Le microperle di alginato vengono esaminate al microscopio per monitorarne le dimensioni e la morfologia.Le microperle di alginato non irradiate sono sferiche, mentre quelle irradiate hanno una forma a lacrima. La distribuzione dimensionale è un fattore importante per l'assorbimento dei fattori di crescita. Una riduzione delle dimensioni aumenta il rapporto superficie-volume.Quando si misurano microsfere di alginato con il software ImageJ, una media di 100 microsfere fornisce una buona stima della distribuzione dimensionale per ciascun lotto di microsfere. Poiché l'assorbimento del fattore di crescita dipende da un'adeguata tecnica di rivestimento, lo spessore di ciascun strato viene osservato mediante microscopia confocale. Di seguito sono mostrate immagini ottenute con microscopia confocale a scansione laser di microsfere di alginato incubate con analoghi fluorescenti di protamina, eparina, molecola simile a NELL uno e proteina morfogenetica ossea due.L'attività della fosfatasi alcalina viene utilizzata per misurare la bioattività del fattore di crescita rilasciato. Un aumento di 2,2 volte dell'attività della fosfatasi alcalina è stato osservato dopo l'incubazione con il complesso polielettrolitico della molecola simile a NELL il giorno 14. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro cinque ore se effettuata correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le concentrazioni di alginato influenzano la stabilità dei microsfera. Per gli alginati irradiati, era necessario un quattro percento. Per i corrispettivi non irradiati, era necessario un due percento.Seguendo queste procedure, è possibile aumentare ulteriormente il caricamento del fattore di crescita mediante rivestimento multistrato. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale di esplorare il rilascio di fattori di crescita in altri modelli di malattia. Dopo aver visionato questo video, sarete in grado di fabbricare un complesso polielettrolitico con una distribuzione dimensionale ristretta.

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Nelle sezioni seguenti, si delineano le procedure per la preparazione di microsfere di alginato per l'uso in applicazioni biomediche. Specificatamente illustrano una tecnica per creare multistrato alginato microsfere per il duplice scopo di incapsulamento delle cellule e proteine ​​come potenziale trattamento di diabete di tipo 1.

Generazione di microsfere di alginato per applicazioni biomediche

Noi descriviamo un metodo per realizzare immobilizzazione efficiente di BMP-2 sulle superfici. Il nostro approccio si basa sulla formazione di un monostrato auto-assemblato per realizzare il legame di BMP-2 attraverso i suoi residui amminici liberi covalente. Questo metodo è un utile strumento per studiare la segnalazione alla membrana cellulare.

Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio

Questo protocollo combina elettrofilatura e microsfere per sviluppare scaffold di ingegneria tissutale per dirigere i neuroni. Il fattore di crescita nervoso è stato incapsulato all'interno di microsfere di PLGA e elettrofilato in scaffold fibrosi di acido ialuronico (HA).  La bioattività della proteina è stata testata seminando gli scaffold con i gangli della radice dorsale del pulcino primario e coltivandoli per 4-6 giorni.

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

Viene presentato un processo generico passo-passo per creare un modello simile a un osso con micro-canali ingegnerizzati. Le elevate capacità di assorbimento e ritenzione del modello sono dimostrate dall'azione capillare tramite microcanali.

Modelli Distinctive capillare azione da micro-canali in osso, come può migliorare reclutamento di cellule per il Restauro di grande Bony difetto

Gli scaffold per l'ingegneria tissutale devono ricapitolare il complesso microambiente biochimico e biofisico della nicchia cellulare. Qui, mostriamo l'uso di fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica come piattaforma per creare scaffold polimerici compositi e multicomponente con rilascio biochimico sostenuto.

Ponteggi composto di fibre di interfacce polielettrolita per rilascio controllato di Biomolecole temporalmente

Questo video dimostra un protocollo per arricchire le cellule epiteliali timiche (TEC) con gradiente di densità per l'isolamento FACS. Mostra anche l'uso di peptidi EAK16-II/EAKIIH6 per promuovere la formazione di aggregati TEC. I microambienti dell'idrogel EAK16-II/EAKIIH6 forniscono la configurazione 3D necessaria per mantenere la sopravvivenza e la funzione dei TEC.

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare formazione del vaso sanguigno in vivo e in tempo reale in 3D impalcature da microscopia multifotonica. Angiogenesi in impalcature geneticamente è stato studiato in un modello di difetto critico calvarial murino dell'osso. Più nuovi vasi sanguigni sono stati rilevati nel gruppo di trattamento rispetto ai controlli.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

Biomateriali drogati con Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) sono stati utilizzati come una nuova strategia terapeutica per guarire fratture ossee non sindacale. Per superare gli effetti collaterali derivanti da un'incontrollabile rilascio del fattore, vi proponiamo una nuova strategia per sito-direttamente immobilizzare il fattore, creando così materiali con migliorate capacità osteogeniche.

Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

Un modello in vitro della nicchia vascolare del midollo osseo viene stabilito seminando cellule mesenchimali ed endoteliali su idrogel PEG 3D prefabbricati. Le reti endoteliali, i componenti della ECM e l'attività ALP delle nicchie variano a seconda del fattore di crescita utilizzato. La piattaforma può essere utilizzata per modelli avanzati di cancro.

Semplice creazione di una nicchia vascolarizzata del midollo osseo osteogenico utilizzando idrogel prefabbricati di poli(glicole etilenico) (PEG) in una micropiastra di imaging

La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l'impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.

Formazione ossea integrata attraverso l'ossificazione endocondrale in vivo utilizzando cellule staminali mesenchimali

Questo protocollo dettaglia la sintesi, l'incapsulamento dell'emoglobina e la PEGilazione superficiale di nanoparticelle gerarchicamente porose di UiO-66 progettate per la somministrazione di ossigeno. La procedura combina l'ingegneria dei difetti con la coniugazione biortogonale promossa dalla deformazione per generare portatori altamente permeabili e fisiologicamente stabili, adatti alle applicazioni biomediche.

Sintesi, incapsulamento dell'emoglobina e PEGilazione biortogonale in nanoparticelle gerarchicamente porose di UiO-66 per applicazioni di somministrazione di ossigeno

Scopri come fabbricare complessi polielettrolitici con eparina e protamina per il rilascio controllato di fattori di crescita osteogenici. Questo metodo riduce significativamente il dosaggio di BMP-2 nelle applicazioni di fusione spinale.

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

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