Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare un guscio di complessazione polielettrolitica. Un vettore in grado di intrappolare e regolare il rilascio di un'ampia gamma di fattori di crescita con un dominio di legame dell'eparina. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale ortopedica per l'intrappolamento efficiente e la consegna di fattori di crescita dedicati.

I principali vantaggi di questa tecnica è che non richiede l'uso frequente di sostanze organiche. Che è noto per influenzare le bioattività dei fattori di crescita. Sciogliere 200 milligrammi di alginato di sodio non irradiato o 400 milligrammi di alginato di sodio irradiato da otto megarad in 10 millilitri di acqua bidistillata.

E agitare per un'ora. Conservare la soluzione di alginato a quattro gradi Celsius per una notte. Filtrare la soluzione di alginato con un filtro sterile per siringa da 0,2 micron prima della fabbricazione delle microsfere di alginato.

Disinfettare il generatore elettrostatico BE e la pompa a siringa con etanolo al 70% e collocarli in una cabina di sicurezza biologica di classe due. Quindi posizionare una bacinella di vetro con un'ancoretta magnetica all'interno del generatore BE. Posizionare l'elettrodo del braccio del generatore BE a nove centimetri sopra la bacinella.

Collegare il cavo dell'elettrodo del generatore BE alla vite neuro due dell'elettrodo del braccio. E versare 80 millilitri di soluzione di cloruro di stronzio nella bacinella. Quindi, caricare cinque millilitri di soluzione di alginato filtrato da 0,2 micron nella siringa in un tubo di gomma.

Dopo aver collegato il tubo di gomma all'elettrodo del braccio, accendere la pompa a siringa a cinque millilitri all'ora. Per due minuti. Per espellere l'aria all'interno del tubo ed erogare la soluzione di alginato sulla punta dell'ugello.

Quindi, spegnere la pompa a siringa. Per iniziare la generazione di microsfere, impostare l'incapsulatore su 5,8 kilovolt. Segue la pompa a siringa a una portata di alginato di cinque millilitri all'ora.

Scartare le microsfere generate durante i primi due minuti poiché queste microsfere tendono ad essere di dimensioni e forme irregolari. Raccogliere le microsfere successive nella soluzione di cloruro di stronzio 0,2 molari. Spegnere la pompa a siringa seguita dall'incapsulatore.

Dopo aver pompato il volume prestabilito di soluzione di alginato. Ripetere l'operazione per i lotti successivi di fabbricazione di microsfere. Conservare le microsfere in 20 millilitri di soluzione di cloruro di stronzio molare 0,2 a quattro gradi Celsius durante la notte per completare la reticolazione e stabilizzare il gel.

Raccogliere 0,5 millilitri di microsfere di alginato con una pipetta di plastica. E posizionalo su un vetrino. Osserva le microsfere al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x.

Scatta 10 immagini delle microsfere con una fotocamera CCD per microscopio. Salva le immagini con una barra scala da 500 micron in formato TIFF con una risoluzione di 2048 x 1536. Utilizzando gli strumenti di lunghezza nell'immagine J, misurare la dimensione delle microsfere.

E la barra della scala. Quindi converti la lunghezza delle microsfere da pixel a micrometri. Fare clic sugli strumenti linea e tracciare una linea al centro della perlina di alginato.

Fare clic su Analizza nella barra dei menu e selezionare Misura. Apparirà una finestra pop-up. Ripetere questi passaggi per misurare tutte le perle di alginato all'interno dell'immagine.

Misura la barra della scala sull'immagine. Raccogliere le microsfere utilizzando il colino in nylon da 100 micron. E lavare le perline con acqua distillata doppia.

Usando una spatola, trasferire tutte le microsfere costituite da 0,1 millilitri di soluzione di alginato in una provetta da microcentrifuga da due millilitri e coprire con una garza per evitare che si secchi. Infine, sterilizzare le microsfere mediante scissione automatica utilizzando la modalità liquida o in conformità con le specifiche del produttore. Aggiungere 1,5 litri di acqua distillata nella camera per evitare che le perle si secchino.

All'interno della cappa BSL2, incubare le microsfere sterili con un millilitro di soluzione sterilizzata di protamina da due milligrammi per millilitro per un'ora a temperatura ambiente. Lavare due volte le microsfere rivestite di protamina con acqua distillata doppia. Quindi centrifugare, utilizzando una centrifuga da banco a 200 volte G per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, aspirare l'acqua con una siringa. Incubare microsfere rivestite di protamina con un millilitro di soluzione sterilizzata di eparina da 0,5 milligrammi per millilitro per 30 minuti. Questo crea un guscio di complessazione polielettrolitica con un'avida affinità per i fattori di crescita leganti l'eparina.

Dopo l'incubazione, aspirare l'epraria utilizzando una siringa. E lavare via l'eparina non legata dai complessi polielettrolitici lavando due volte con acqua distillata doppia. Caricare 13,3 microlitri di proteina morfogenetica ossea 2 o molecola 1 simile a 13,3 microlitri per millilitro su 100 microgrammi del complesso polielettrolitico.

Incubare il complesso polielettrolitico a quattro gradi Celsius sotto i 30 giri/min, agitando per 10 ore. Successivamente, immergere le microsfere in un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, a 37 gradi Celsius con agitazione costante. Raccogliere un millilitro di surnatante e sostituirlo con un millilitro di PBS dopo uno, tre, sei, 10 e 14 giorni.

Valutare l'efficienza di assorbimento e rilascio della molecola simile a NELL utilizzando il metodo del saggio delle proteine CBQCA secondo il protocollo del produttore. In alternativa, eseguire l'elisa. La bioattività della molecola NELL simile a quella rilasciata dal complesso polielettrolitico viene valutata misurando la sua capacità di aumentare l'espressione della fosfatasi alcalina nelle cellule staminali del midollo osseo di coniglio.

Seminare 20.000 cellule staminali di midollo osseo di coniglio per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. E lasciali crescere per un giorno con un millilitro di terreno modificato dell'aquila di dulbecco più il 10% di siero fetale bovino a 37 gradi Celsius e il 5% di CO2. Dopo 24 ore, sostituire il terreno con un millilitro di un terreno osteogenico per sette giorni a 37 gradi Celsius.

e 5% di CO2. Posizionare 300 microgrammi di complesso polielettrolitico e complesso polielettrolitico NELL come una molecola all'interno degli inserti di coltura cellulare per mantenere i complessi separati dalle cellule. Posizionare l'inserto nella piastra a 24 pozzetti per evitare il dilavamento delle microsfere del complesso polielettrolitico durante il cambio del mezzo osteogenico.

Una volta ogni tre giorni, aspirare un millilitro di terreno osteogenico posizionando un ago all'esterno dell'inserto. E sostituire con un millilitro di terreno osteogenico fresco. Dopo sette e 14 giorni di incubazione, determinare l'attività della fosfatasi alcalina con un kit per il dosaggio della fosfatasi alcalina.

In conformità con il protocollo del produttore del kit. Impacchettare i complessi polielettrolitici nei pori di un'impalcatura bioriassorbibile di policaprolattone tricalcio fosfato di grado medico. Utilizzando una spatola sterilizzata all'interno di una camera BSL2.

Aggiungere una soluzione di 1,5 milligrammi o millilitri di proteina morfogenetica ossea due o molecola simile a NELL uno sull'impalcatura impacchettata con complesso polielettrolitico. E incubare per una notte a 4 gradi Celsius. Le microsfere di alginato vengono ispezionate al microscopio per monitorarne le dimensioni e la morfologia.

Le microsfere di alginato non irradiate sono sferiche e la controparte irradiata è a forma di lacrima. La distribuzione dimensionale è un fattore importante per l'assorbimento del fattore di crescita. E la riduzione delle dimensioni aumenta il rapporto superficie/area.

Quando si misurano microsfere di alginato con il software di immagine J, una media di 100 microsfere fornisce una buona stima della distribuzione dimensionale in ogni corrispondenza di microsfere. Poiché l'assorbimento del fattore di crescita dipende da una corretta tecnica di rivestimento, lo spessore dello strato di ciascun rivestimento viene osservato mediante microsopia confocale. Qui vengono mostrate immagini di microsfere di alginato incubate con analoghi fluorescenti di protamina, eparina, molecola NELL like e proteina morfogenetica ossea due.

L'attività della fosfatasi alcalina viene utilizzata per misurare la bioattività del fattore di crescita rilasciato. Un aumento di 2,2 volte dell'attività della fosfatasi alcalina è stato osservato dopo l'incubazione con la molecola NELL like del complesso polielettrolitico NELL il giorno 14. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro cinque ore se eseguita correttamente.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che le concentrazioni di alginato influenzano la stabilità delle microsfere. Per gli alginati irradiati, avevamo bisogno del quattro per cento. Per le controparti non irradiate, abbiamo richiesto una percentuale a due vie.

Seguendo queste procedure, possiamo aumentare ulteriormente il carico del fattore di crescita mediante rivestimento multistrato. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale di esplorare la somministrazione di fattori di crescita in altri modelli di malattia. Dopo aver visto questo video, sei in grado di fabbricare un complesso polielettrolitico con una distribuzione dimensionale stretta.