Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

L'obiettivo generale di questo saggio è determinare gli effetti di trattamenti di interesse sull'adesione cellulare in condizioni di stress di taglio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione delle cellule immunitarie, ad esempio quali fattori mediino l'attivazione delle integrine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che coppie di molecole di adesione singole, come le integrine, possono essere studiate in un sistema di flusso facilmente riproducibile.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attivazione di LFA1, può essere applicato anche allo studio di altre integrine. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché l'allestimento tecnico deve essere eseguito con precisione. Per raccogliere le cellule CHO-ICAM, trattare la coltura con tripsina EDTA 0,5% per un minuto a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Quando le cellule iniziano a staccarsi, neutralizzare la tripsina con quattro millilitri di mezzo fresco e contare il numero di cellule dissociate. Diluire le cellule fino a una concentrazione di 0,75 volte 10 alla quinta cellule per camera e centrifugare. Successivamente, risospendere il pellet in 30 microlitri per camera di flusso, in mezzo di coltura completo CHO-ICAM, e seminare lentamente aliquote di 30 microlitri di cellule per ogni serbatoio della camera di flusso.

Lasciare sedimentare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per cinque minuti. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura completo in entrambi i serbatoi di ogni camera e reinserire la piastra nell'incubatore per una coltura notturna. Dopo aver raccolto le cellule T, contare e diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di due per 10 alla sesta cellule per camera.

Quindi centrifugare le cellule e risospendere il pellet in un millilitro di PBS, integrato con 1% di glucosio per due volte dieci alla sesta cellule T. Successivamente, etichettare le cellule T in una diluizione 1:1000 di CFSE protetta dalla luce per otto minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 240 microlitri di mezzo RPMI senza siero per ogni camera.

Quindi dividere le cellule in un tubo da 1,5 millilitro per ogni camera e conservare i tubi in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius fino al caricamento. Prima dell'acquisizione delle immagini, riscaldare la camera per imaging in tempo reale del microscopio a 37 gradi Celsius e riempire una bottiglia di vetro da 500 millilitri con acqua. Praticare due fori nel coperchio, etichettati come in ingresso e uscita, e far passare attraverso il foro di ingresso il tubo di collegamento della siringa, e attraverso il foro di uscita il tubo di collegamento del serbatoio di ingresso.

Utilizzare una siringa da 60 millilitri per lavare il tubo di ingresso con 60 millilitri di acqua, seguiti da 60 millilitri di mezzo privo di siero a 37 gradi Celsius, al fine di rimuovere qualsiasi aria dal sistema. Una volta che il tubo è stato preparato, trasferire l'intero sistema di ingresso nella camera di imaging in tempo reale del microscopio per mantenere il sistema a 37 gradi Celsius. Far uscire il tubo e la siringa dalla camera e inserire la siringa nella pompa per siringa.

Successivamente, praticare un foro nel coperchio di una bottiglia da 250 millilitri da utilizzare come contenitore di raccolta dei rifiuti in uscita e far passare il tubo di uscita attraverso il foro nella bottiglia. Quindi fissare in modo lento il coperchio della bottiglia di raccolta e posizionare l'intero sistema di uscita nella camera per imaging in tempo reale. Ora posizionare la lamella della camera di flusso sul palchetto del microscopio e utilizzare l'obiettivo 20X per impostare il piano focale sul monostrato di CHO ICAM.

Quindi, a partire dal controllo non stimolato, scartare tre volumi di 70 microlitri dal serbatoio di uscita della prima camera e aggiungere tre volumi di 70 microlitri di linfociti T etichettati con CFCS al serbatoio di ingresso. Mentre i linfociti T si spostano dall'ingresso all'uscita, acquisire immagini di cinque campi casuali di linfociti T positivi al CFSE in ciascuna camera per ottenere il conteggio cellulare prima del flusso. Successivamente, collegare contemporaneamente le tubazioni di ingresso e uscita ai serbatoi della camera a flusso, avendo cura di non introdurre bolle d'aria, e avviare il flusso con uno stress di taglio di 0,3 millilitri al minuto, continuando nel frattempo a visualizzare i linfociti T colorati con CFSC.

Non appena si osserva il movimento delle cellule T, avviare un cronometro di cinque minuti, interrompendo il flusso alla fine del periodo. Successivamente, acquisire le immagini di cinque campi di cellule positive per CFSE in ciascuna camera, selezionando i campi in modo casuale per ottenere il conteggio cellulare post-flusso. Per la stimolazione con PMA, stimolare un tubo di cellule T con PMA per utilizzarlo come controllo positivo immediatamente prima di caricare le cellule T nella seconda camera di flusso per l'acquisizione delle immagini, come appena dimostrato.

Per la stimolazione con SDF-1 alpha, rimuovere innanzitutto tre aliquote da 70 microlitri di mezzo dal serbatoio di uscita della terza camera, quindi aggiungere 70 microlitri di SDF-1 alpha nel serbatoio di ingresso. Dopo cinque minuti, scartare tre aliquote da 70 microlitri dal serbatoio di uscita e aggiungere il tubo rimanente di linfociti T per l'acquisizione delle immagini, come appena illustrato. In queste immagini rappresentative, si osserva un numero simile di linfociti T prima del flusso in condizioni diverse di stimolazione.

Dopo cinque minuti di stress da taglio continuo, il numero di linfociti T aderenti aumenta nelle condizioni di stimolazione con PMA e SDF-1 alfa, mentre rimangono aderiti pochi linfociti T non stimolati. In effetti, l'attivazione dei linfociti T indotta da SDF-1 alfa, ad esempio, provoca un aumento di quasi due volte dell'adesione dei linfociti T rispetto alle cellule di controllo non stimolate. Inoltre, calcolando la percentuale di adesione dei linfociti T primari umani CD3 positivi in presenza o assenza di SDF-1 alfa, si osserva che il 15% dei linfociti T non stimolati aderisce in condizioni di stress da taglio, rispetto al 50% dei linfociti T nelle condizioni di attivazione con SDF-1 alfa.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere ragionevolmente estesa fino a sei camere sperimentali in un singolo saggio. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di lavorare esclusivamente con lo strato monoconfluente di ICAM. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come l'analisi della forma cellulare, possono essere eseguiti sulle immagini acquisite per rispondere a ulteriori domande.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare l'adesione cellulare in condizioni di stress di taglio. Grazie per aver guardato questo video e buona fortuna con i tuoi esperimenti.