Isolamento e l'espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed espandere le cellule stromali staminali mesenchimali derivate dal tessuto placentare umano. Ciao, sono Mike Doran. Sono un group leader presso la Queensland University of Technology presso il Translational Research Institute di Brisbane, in Australia.

Ciao, mi chiamo Rebecca Pelekanos e sono una ricercatrice presso il Center for Clinical Research dell'Università del Queensland. Oggi dimostrerò la procedura di isolamento MSC. La placenta viene normalmente scartata dopo la nascita.

Poiché il tessuto pesa da cinque a 700 grammi, offre una fonte unica di cellule staminali mesenchimali allogeniche. In generale, le persone che sono nuove all'isolamento delle MSC placentari avranno difficoltà perché non hanno familiarità con l'anatomia della placenta e non hanno familiarità con come elaborare il tessuto e non hanno familiarità con quale tipo di cellule, materne o fetali, popoleranno la loro coltura finale di MSC. Per aiutare i ricercatori, discutiamo questi importanti dettagli in questo video.

Il primo passo in questa procedura è orientarsi con l'anatomia della placenta. Il secondo passo di questa procedura consiste nel sezionare manualmente 10 grammi di tessuto dalla decidua, dai villi coriali o dalla placca coriale, utilizzando le forbici. I primi due passaggi sono riassunti di nuovo schematicamente qui.

Nella terza fase, la decidua, i villi coriali o i tessuti della placca corionica vengono ulteriormente tritati in pezzi fini con le forbici. Nella fase quattro, le cellule vengono liberate dai piccoli pezzi di tessuto attraverso una digestione di una o due ore in dispasi e collagenasi I.In fase cinque, le cellule vengono separate dal tessuto fibroso lavandole attraverso un colino cellulare. Le cellule vengono quindi raccolte, risospese in terreno di coltura e messe in fiasche di coltura.

cellule stromali mesenchimali, MSC, saranno selezionate in base alla loro propensione all'aderenza plastica e alla capacità di sopravvivere e proliferare nel terreno di coltura cellulare. Infine, nella sezione dei risultati, l'MSC espanso può essere caratterizzato e memorizzato per l'uso in esperimenti futuri. La placenta è un organo temporaneo che consente lo scambio di sostanze nutritive e prodotti di scarto tra il feto e la madre durante la gravidanza.

La placenta può essere facilmente raccolta in modo asettico dopo il taglio cesareo e il parto sicuro del bambino. La placenta è prevalentemente composta da vasi sanguigni e membrane di derivazione fetale. Tuttavia, contiene anche alcune cellule materne.

La placenta è collegata all'utero sia da cellule deciduali materne di derivazione uterina che da trofoblasti invasori di derivazione fetale. Di solito non è possibile discernere a occhio nudo l'interfaccia precisa tra i tessuti materni e fetali. Tuttavia, il lato fetale della placenta è facilmente identificabile come il lato in cui si trova il cordone ombelicale.

Quando il bambino viene partorito, rimane solo un sottile strato di tessuto deciduale collegato alla placenta. Attraverso l'orientamento fisico della placenta, è possibile localizzare i tre tessuti che raccoglieremo oggi. Il primo tessuto che verrà raccolto è la decidua materna.

Il marcatore verde indica il tessuto deciduale che rimane sulla superficie dopo che la placenta è stata staccata dalla parete uterina. Il secondo tessuto che verrà raccolto dall'interno della placenta sono i villi coriali fetali. Ciò è indicato dai cerchi blu sui diagrammi.

Il terzo tessuto da prelevare sarà la placca corionica fetale. Questo tessuto è identificato dai marcatori rossi sui diagrammi. Ok, iniziamo.

Posizionare la placenta nell'armadio di sicurezza biologica. Apri le membrane fetali e orientati con le parti della placenta. Il lato fetale con l'inserzione del cordone ombelicale, la lave corioamniotica o sacco amniotico.

La superficie fetale della placenta presenta evidenti vasi sanguigni di grandi dimensioni nella placca coriale, con sovrastante la membrana amniotica, che, ancora una volta, è facilmente separabile meccanicamente. Il lato materno è opposto al lato fetale, con i cotiledoni o i lobi evidenti. Assicurarsi che la superficie materna sia rivolta verso l'alto.

Tagliare pezzi di 0,5 cm di spessore dal lato materno della placenta o della decidua. Durante le dissezioni, posizionare i pezzi di tessuto in una capsula di Petri contenente la soluzione salina bilanciata di Hank, o HBSS, per mantenere i tessuti umidi. Agitare i tessuti delle stoviglie con HBSS per rimuovere un po' di sangue.

Trasferire una quantità di tessuto sufficiente a riempire la provetta fino alla soglia di 10 millilitri di una provetta da 50 millilitri, circa 10 grammi. Si noti che in questa fase è possibile isolare più tessuto se sono necessarie più cellule alla fine della procedura. Assicurarsi che la superficie fetale sia rivolta verso l'alto.

Rimuovere meccanicamente la membrana amniotica dalla superficie fetale della placenta, lasciando intatta la placca coriale. Tagliare la placca corionica a strisce profonde circa mezzo centimetro nel tessuto dei villi sottostanti. Quindi, sezionare il tessuto dei villi coriali a circa un centimetro di profondità nella placenta da dove è stata rimossa la placca coriale.

Posizionare i fazzoletti in HBSS e misurare circa 10 millilitri di tessuto come è stato fatto in precedenza. Trasferire i pezzi di tessuto, con un trasferimento minimo di liquido, in una capsula di Petri da 10 centimetri e tagliarli in pezzi sottili di circa un millilitro cubo, con le forbici. Trasferire nuovamente il tessuto macinato nella provetta da 50 mil.

Ripetere l'operazione per tutti i campioni di tessuto rimanenti. Aggiungere il terreno di digestione appena preparato in almeno un rapporto di uno a uno con il fazzoletto. Capovolgere il tubo più volte per mescolare.

Incubare i tessuti nella provetta con il terreno di digestione per una o due ore, a 37 gradi in un'incubatrice agitante. Quando la soluzione di digestione tissutale ha assunto un aspetto torbido e i vasi sanguigni bianchi erano evidenti nella soluzione, aggiungere 15 millilitri di HBSS per diluire gli enzimi nel mezzo di digestione. Centrifugare brevemente i campioni solo a impulsi fino a quando la centrifuga raggiunge i 340 g per cinque secondi, quindi fermarsi.

Ciò costringerà i detriti di grandi dimensioni a raccogliersi sul fondo del tubo. Riportare i campioni nella cabina di sicurezza biologica. Metti un colino in una nuova provetta da 50 millilitri.

Pipettare il surnatante contenente le cellule mononucleate nel colino, catturando l'eluato nella nuova provetta. Lascia i detriti di tessuto placentare nel primo tubo. Aggiungere 15 millilitri di HBSS ai detriti placentari, agitare energicamente per recuperare più cellule e centrifugare il campione a impulsi.

Anche in questo caso, pipettare il surnatante nella provetta con il filtro cellulare nella provetta di raccolta. Versare il surnatante nel filtro cellulare può essere più adatto, a seconda della consistenza del campione. Lavare il filtro cellulare con 5 millilitri di HBSS.

Gettare la provetta contenente i detriti di tessuto placentare. Centrifugare il campione di surnatante per cinque minuti a 340 g per pellettare le cellule. I globuli rossi sono visibili come uno strato sul fondo del pellet e le cellule mononucleate, comprese le MSC, sono lo strato più leggero sopra i globuli rossi.

Riportare i campioni nella cabina di sicurezza biologica. Decantare accuratamente il surnatante e gettarlo. Muovere più volte il tubo con un dito per rimuovere il pellet della cella e risospendere il pellet della cella in 35 millilitri di terreno MSC.

Trasferire la sospensione cellulare in un pallone T175 per 10 mil di tessuto e la coltura in un incubatore a 37 gradi con il 5% di CO2. Dopo l'isolamento, cambiare i terreni di coltura dopo 48 ore. Nutrire le colture una volta alla settimana fino a quando non diventano confluenti.

Le colture devono essere confluenti entro circa 14 giorni. Infine, espandere e crioconservare le cellule, analizzare le caratteristiche delle MSC e utilizzarle negli esperimenti. Dopo 48 ore di coltura, le MSC si saranno attaccate al tessuto di coltura plastica, mentre le popolazioni ematopoietiche e altre cellule non lo faranno.

A questo punto, il terreno viene sostituito con 35 millilitri di terreno di coltura fresco. L'aspetto del surnatante della coltura può variare sostanzialmente tra i donatori di placenta. L'esempio uno e due dimostrano questa variazione.

Questi due isolamenti sono stati eseguiti contemporaneamente, ma da due placente diverse. Una volta lavate, le colture sono prive di globuli rossi e detriti tissutali, come mostrato nell'esempio tre, e i risultati di espansione successivi sono generalmente coerenti. Dopo il cambio del terreno di 48 ore, solo poche celle sono attaccate al pallone.

Sette giorni dopo l'isolamento, le colonie fibroblastiche di MSC sono visibili, sebbene siano presenti anche cellule non MSC, come cellule rotonde o debolmente attaccate. 13 giorni dopo l'isolamento, le colonie fibroblastiche di MSC sono grandi e spesso il monostrato di MSC è sufficientemente confluente e pronto per il passaggio. Dal passaggio in poi, il monostrato di MSC sviluppa una caratteristica morfologia a vortice alla confluenza.

Le MSC placentari mostrano un classico profilo di marcatori MSC mediante analisi di citometria a flusso. Le cellule sono positive per CD73, CD105 e CD90 e negative per i marcatori ematopoietici di CD45, CD34 e HLA-DR. Le MSC placentari generalmente vanno incontro a una robusta differenziazione osteogenica ma a una scarsa differenziazione adipogenica.

Molte pubblicazioni presumono che le cellule isolate dal corion fetale producano MSC fetale dopo la coltura. Tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza, tutte le colture derivate dal corion fetale che utilizzano questo protocollo si arricchiscono rapidamente per le MSC materne, come ci si aspetterebbe per le colture di MSC deciduali materne. I dati qui riportati quantificano la composizione delle cellule fetali e materne delle colture di MSC placentari isolate da tessuti deciduali, virili coriali e placche coriali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea abbastanza precisa di come isolare e coltivare le MSC derivate dal tessuto placentare. Ci auguriamo che questi metodi siano utili nella ricerca e nelle applicazioni cliniche che potrebbero utilizzare le MSC di derivazione placentare.