Femore finestra del modello Camera per
28 luglio 2016
Il protocollo descrive un nuovo modello di camera a finestra del femore murino che può essere utilizzato per tracciare il movimento delle cellule nel midollo osseo femorale in vivo. La microscopia a fluorescenza multifotone intravitale viene utilizzata per visualizzare tre componenti del midollo osseo femorale (vascolarizzazione, matrice di collagene e neutrofili) nel tempo.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi microscopica a lungo termine e il tracciamento dei neutrofili all'interno delle strutture vascolari del midollo osseo murino attraverso una camera a finestra cronica impiantata sulla superficie del femore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in immunologia e oncologia riguardo al ruolo dei monociti nella regolazione di un'infezione, della tumorigenesi e della metastatizzazione tumorale. I principali vantaggi di questa tecnica consistono nella possibilità di accedere microscopicamente in modo prolungato al midollo osseo femorale, un sito centrale dell'emopoiesi, e nel fornire informazioni dinamiche altrimenti difficili da ottenere con metodi convenzionali.
Sebbene questo metodo sia specifico per l'immagine dei neutrofili all'interno di una rete vascolare, può anche essere utilizzato per visualizzare altre popolazioni di cellule immunitarie di interesse. Il giorno dell'intervento chirurgico, verificare il livello appropriato di sedazione attraverso l'assenza di risposta a una leggera pressione sulle dita dei piedi di un topo nude atimico. Successivamente, posizionare il topo su un tappetino riscaldante elettrico, coperto con un campo operatorio, sotto un microscopio stereoscopico.
Successivamente, applicare un unguento sugli occhi dell'animale e sterilizzare l'area chirurgica con due passate consecutive di povidone-iodio al 7,5%, alcol isopropilico al 70% e povidone-iodio al 10%. Una volta preparato l'animale, utilizzare un bisturi con lama numero 15 per effettuare un'incisione cutanea longitudinale di 10 millimetri avvicinandosi al femore dal lato laterale. Poi, praticare una dissezione ottusa con pinze ed emostatici per esporre il femore tra i muscoli flessori ed estensori.
Quando il femore è visibile, inserire una barra a forma di U al di sotto dell'osso e installare la camera con finestra. Fissare la barra alla finestra utilizzando due dadi. Successivamente, serrare i dadi con una pinza.
Utilizzare la pinzetta per riportare la muscolatura dei flessori ed estensori alle loro posizioni originali. Riempire lo spazio tra l'osso e la camera della finestra con cemento dentale per fissare la camera della finestra in posizione. Successivamente, utilizzare un microtrapano per limare un'area di sei per due millimetri nell'osso corticale al fine di ottenere l'accesso ottico alla cavità midollare.
Una volta ottenuto uno strato periosteo dell'osso quasi trasparente, posizionare un vetrino da otto millimetri sulla finestra e utilizzare un anello di fissaggio per bloccare il vetrino in posizione. Successivamente, chiudere il derma con un punto di sutura 5-0 e una pinza per ago. Quindi, posizionare il topo in una nuova gabbia con lettiera pulita, monitorandolo fino a quando non si sarà completamente ripreso.
Per ottenere immagini combinate di microscopia a fotoni multipli e confocale attraverso la camera a vetro, iniettare innanzitutto le appropriate soluzioni fluorescenti per l'etichettatura dei neutrofili vascolari nel topo attraverso la vena della coda. Fissare i capi della camera a vetro con pinze a coccodrillo per ancorare il topo al supporto appositamente realizzato. Successivamente, posizionare il supporto di imaging sul microscopio combinato a fotoni multipli e confocale.
Quando il mouse è ben posizionato, accendere il laser a due fotoni e il sistema confocale, quindi fare clic su Avvia sistema per avviare il software di acquisizione delle immagini. Per configurare i canali di imaging, nella scheda Acquisizione, fare clic su Configurazione rapida e selezionare i laser per l'acquisizione. Scegliere Segnale migliore e fare clic su Applica.
Aggiungere manualmente il canale di acquisizione dell'immagine di generazione del secondo armonico attivando il laser a due fotoni nella finestra Laser e impostando le lunghezze d'onda di acquisizione appropriate per la generazione del secondo armonico. Nella scheda Locate, fare clic su Oculari online e individuare la regione di interesse attraverso il microscopio mediante ispezione visiva. Fare clic su Oculari offline e aprire la scheda Acquisizione.
Nella finestra Canali, selezionare la traccia FITC e fare clic su Live per visualizzare in anteprima l'immagine del FITC-Destrano con un obiettivo 5x. Regolare la messa a fuoco secondo necessità. Quindi, fare clic su Stop nella scheda Acquisizione per interrompere l'anteprima.
Ora, selezionare manualmente l'obiettivo ad immersione in acqua 20x e visualizzare nuovamente l'immagine di FITC-Dextran, regolando il Guadagno principale e il Pinhole nella finestra Canali per ottenere il miglior segnale e contrasto possibile. Quando si è ottenuta un'immagine ottimale per tutti e tre i canali, selezionare tutti i canali nella finestra Canali e fare clic su Acquisisci nella scheda Acquisizione per ottenere un'istantanea 2D. Successivamente, per acquisire un'immagine 2D in time-lapse, selezionare la Serie Temporale per aprire la finestra Serie Temporale ed inserire zero per gli intervalli e 40 per il numero totale di scansioni, in modo da ottenere 40 immagini in sequenza continua senza intervallo di tempo.
Per analizzare le immagini, aprire il software appropriato per l'analisi delle immagini e aprire un file immagine. Per generare le tracce degli oggetti utilizzando le immagini a intervalli di tempo, nella vista Surpass, aprire l'immagine da analizzare e fare clic sull'icona con un'immagine di punti arancioni per aprire la nuova finestra Spots. Dopo aver impostato i parametri di tracciamento, selezionare la casella Compila i gap con tutti gli oggetti rilevati per avviare il tracciamento.
E fare clic sulla freccia blu per passare al passaggio successivo. Sotto Tipo di filtro, selezionare il filtro Durata traccia e fare clic sulla freccia verde per completare il tracciamento. Quindi, verificare le tracce generate, tornando al passaggio precedente se necessario.
Per misurare il movimento cellulare, definito dalle tracce dell'oggetto nelle immagini a intervalli di tempo, nella finestra Modifica tracce, selezionare la casella Tracce e quindi una traccia corrispondente al movimento della cellula di interesse. La traccia selezionata verrà evidenziata in giallo nell'immagine della serie temporale. Infine, nella scheda Statistiche, fare clic sull'icona con l'immagine di un grafico per aprire la finestra delle Statistiche.
Quindi, sotto Selezione, fare clic sulla freccia verso il basso per generare la Velocità Media della Traccia. La vascolarizzazione all'interno del midollo osseo può essere visualizzata mediante coloranti intravascolari, come il FITC-Destrano. Poiché il contrasto dipende dall'iniezione del colorante, l'immagine acquisita rappresenta la vascolarizzazione funzionale in cui è presente un flusso ematico sufficiente.
Queste immagini della stessa area del midollo osseo in diversi punti temporali dimostrano la presenza di neutrofili sia negli spazi intravascolari che extravascolari nel corso di diversi giorni. L'acquisizione di immagini di questo osso corticale, composto principalmente da fibre di collagene, è stata eseguita mediante generazione di armonica secondaria, illustrando ulteriormente l'infiltrazione del tessuto vascolare da parte dei neutrofili. Questi neutrofili sono stati tracciati nella nicchia vascolare del midollo osseo senza alcun intervallo di tempo aggiuntivo tra una scansione e l'altra, consentendo un monitoraggio accurato del loro movimento.
La velocità delle tracce generate dal software di analisi delle immagini può quindi essere misurata per analizzare la velocità di ogni cellula. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'uso di cellule marcate ex vivo o di topi transgenici con reporter, possono essere impiegati per valutare altri processi biologici in situ, come l'influenza delle cellule immunitarie sulla progressione tumorale e sulla metastasi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come installare una finestra di osservazione sull'osso femorale di un topo per seguire i neutrofili attraverso il nicchio vascolare del midollo osseo e le strutture di collagene.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un nuovo modello murino di camera con finestra nel femore per il tracciamento del movimento dei neutrofili nel midollo osseo femorale in vivo. Utilizzando la microscopia fluorescente intravitale a multiphotoni, i ricercatori possono acquisire immagini della vascolarizzazione, della matrice di collagene e dei neutrofili nel tempo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Ematologia
- Ricerca sul Midollo Osseo
Sfondo
- Il midollo osseo femorale è un sito fondamentale per l'emopoiesi.
- Comprendere il comportamento dei neutrofili è essenziale per ottenere informazioni sulle dinamiche delle infezioni e dei tumori.
- I metodi convenzionali di imaging potrebbero non fornire le informazioni dinamiche necessarie.
- Questa tecnica consente un accesso a lungo termine per osservare le interazioni cellulari.
Scopo dello studio
- Eseguire un'immagine a lungo termine dei neutrofili nel midollo osseo murino.
- Studiare il ruolo delle cellule immunitarie nell'infezione e nella progressione tumorale.
- Fornire un metodo per la visualizzazione delle popolazioni di cellule immunitarie in vivo.
Metodi Utilizzati
- Impianto di una finestra cronica sopra l'osso femorale.
- Microscopia a fluorescenza intravitale a fotoni multipli per l'acquisizione di immagini.
- Monitoraggio del movimento dei neutrofili all'interno delle strutture vascolari.
- Utilizzo di topi athymic nude per la procedura.
Risultati principali
- Immagini a lungo termine di neutrofili nel midollo osseo femorale.
- Monitoraggio dinamico delle interazioni cellulari all'interno della rete vascolare.
- Informazioni sul comportamento delle cellule immunitarie in risposta a diversi stimoli.
- Applicazioni potenziali nello studio della tumorigenesi e della metastasi.
Conclusioni
- Il modello della camera con finestra sul femore è efficace per l'immagine in vivo dei neutrofili.
- Questo metodo migliora la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie nel midollo osseo.
- Apre nuove prospettive per la ricerca in immunologia e oncologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente l’imaging intravitale longitudinale della dinamica dei neutrofili nel midollo osseo femorale di topo, colmando una lacuna fondamentale nella visualizzazione del traffico e della regolazione delle cellule immunitarie in vivo. Fornendo un monitoraggio quantitativo in tempo reale del movimento cellulare all’interno della nicchia vascolare, il metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli in immunologia e oncologia. L’approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici, collegando il comportamento delle cellule immunitarie a processi patofisiologici come tumorigenesi e metastasi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi mediati dai neutrofili nell'ematopoiesi, nella regolazione immunitaria e nella modulazione del microambiente tumorale.
- Valore operativo: Fornisce un'immagine funzionale dei vasi sanguigni mediante l'uso di coloranti intravascolari, permettendo di correlare il traffico cellulare con lo stato di perfusione.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio associato ai bersagli quantificando l'infiltrazione e il movimento delle cellule immunitarie in risposta a stimoli fisiopatologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative come la velocità di movimento e la distribuzione spaziale dei neutrofili per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Stabilisce una piattaforma riproducibile di imaging intravitale per il monitoraggio immunitario longitudinale.
- Scalabilità: Compatibile con microscopia multifotonica e confocale per analisi temporali ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella la dinamica delle cellule immunitarie in condizioni patologiche, inclusi il cancro, consentendo la valutazione preclinica di interventi immunomodulanti.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del target nella fase di scoperta alla valutazione dell'efficacia preclinica attraverso letture fenotipiche costanti.
- Mitigazione del rischio: Riduce l'incertezza biologica nell'ottimizzazione del capofila visualizzando il comportamento delle cellule immunitarie in situ.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello della camera con finestra femorale si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la caratterizzazione del fenotipo immunitario dopo l'interazione con la molecola bersaglio e prima degli studi sull'efficacia nei modelli di malattia.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sulla funzione dei neutrofili nelle nicchie del midollo osseo mediante osservazione intravitale diretta.
- Screening: Fornisce output di imaging standardizzati e quantitativi sulla cinetica delle cellule immunitarie per supportare la validazione dei saggi.
- Analisi: Offre metriche basate sul tracciamento, come velocità e durata, per un confronto oggettivo tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione preclinica modellando il traffico delle cellule immunitarie in contesti rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Costituisce una capacità di imaging intravitale riutilizzabile nei programmi di ricerca in immunologia, oncologia e ematopoiesi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nella funzione delle cellule immunitarie.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure chirurgiche standardizzate, parametri di imaging e flussi di analisi uniformi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo una visualizzazione precoce dei meccanismi mediati dal sistema immunitario che influenzano la progressione tumorale.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione dei candidati immunomodulatori in base al rischio, sulla base degli effetti osservati sull'ambiente microscopico del midollo osseo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle procedure chirurgiche su modelli murini, nella microscopia intravitale e nell'analisi delle immagini per il tracciamento cellulare.
- È dipendente da sistemi di microscopia confocale a multiphotone, reagenti per la marcatura fluorescente e materiali per la stabilizzazione istologica.
- Necessita di un allineamento trasversale tra i team di cura degli animali, di imaging e di analisi dei dati per garantire coerenza longitudinale.
- L'adattamento ad altri tipi di cellule immunitarie o modelli di malattia potrebbe richiedere la validazione della specificità della marcatura e dei rapporti segnale-rumore.
- I limiti pratici includono il tempo di recupero post-chirurgico e il potenziale effetto fototossico durante sessioni di imaging prolungate, come indicato nel protocollo.
