Femore finestra del modello Camera per In Vivo Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire l'imaging microscopico a lungo termine e il tracciamento dei neutrofili nelle strutture vascolari all'interno del midollo osseo murino attraverso una camera finestra cronica impiantata sopra l'osso femorale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in immunologia e oncologia sul ruolo dei monociti nella regolazione di un'infezione, della tumorigenesi e delle metastasi tumorali. I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente l'accesso microscopico a lungo termine al midollo osseo del femore, un sito centrale dell'emopoiesi, e fornisce informazioni dinamiche altrimenti difficili da ottenere con i metodi convenzionali.

Sebbene questo metodo sia specifico per l'imaging dei neutrofili all'interno di una rete vascolare, può essere utilizzato anche per visualizzare altre popolazioni di cellule immunitarie di interesse. Il giorno dell'intervento, confermare il livello appropriato di sedazione in caso di mancata risposta a un pizzico di punta di un topo nudo atimico. Quindi, posizionare il mouse su un termoforo elettrico, coperto con un telo chirurgico, sotto uno stereomicroscopio.

Successivamente, applicare l'unguento sugli occhi dell'animale e sterilizzare l'area chirurgica con due salviette sequenziali con il 7,5% di iodio povidone, il 70% di alcol isopropilico e il 10% di iodio povidone. Quando l'animale è stato preparato, utilizzare un bisturi con una lama numero 15 per praticare un'incisione cutanea longitudinale di 10 millimetri che si avvicina al femore dal lato laterale. Quindi, sezionare con pinze ed emostatici per esporre il femore tra i muscoli flessori e gli estensori.

Quando il femore può essere osservato, inserire una barra a forma di U sotto l'osso e installare la camera della finestra. Utilizzando due dadi, fissare la barra alla finestra. Quindi, serrare i dadi con una pinza.

Usa la pinza per riadattare la muscolatura dei flessori e degli estensori nelle loro posizioni originali. Riempi lo spazio tra l'osso e la camera della finestra con cemento dentale per fissare la camera della finestra in posizione. Quindi, utilizzare un micro trapano per macinare un'area di sei per due millimetri nell'osso corticale per ottenere l'accesso ottico alla cavità del midollo.

Quando è stato ottenuto uno strato periostale quasi trasparente dell'osso, posizionare un vetro di copertura da otto millimetri sulla finestra e utilizzare un anello elastico per fissare il vetro di copertura in posizione. Ora, chiudi il derma con una sutura 5-0 e un porta aghi. Quindi, metti il topo in una nuova gabbia con lettiera pulita, monitorandolo fino a quando non si sarà completamente ripreso.

Per ottenere immagini combinate di microscopia multifotonica e confocale attraverso la camera finestra, iniettare innanzitutto le soluzioni di marcatura dei neutrofili con vascolarizzazione fluorescente appropriate nel topo per vena caudale. Fissa le estremità della camera della finestra con clip a coccodrillo per fissare il mouse al palco su misura. Quindi, posizionare il tavolino di imaging sul microscopio multifotone e confocale combinato.

Quando il mouse è fissato, accendere il laser a due fotoni e il sistema confocale e fare clic su Avvia sistema per avviare il software di acquisizione delle immagini. Per impostare i canali di imaging, nella scheda Acquisizione, fare clic su Smart Setup e selezionare i laser per l'imaging. Scegli Miglior segnale e fai clic su Applica.

Aggiungere manualmente il canale di acquisizione dell'immagine di generazione della seconda armonica attivando il laser a due fotoni nella finestra Laser e impostando le lunghezze d'onda di acquisizione appropriate per la generazione della seconda armonica. Nella scheda Localizza, fare clic su Oculari online e individuare la regione di interesse attraverso il microscopio mediante ispezione visiva. Fare clic su Oculars offline e aprire la scheda Acquisizione.

Nella finestra Canali, selezionare la traccia FITC e fare clic su Live per visualizzare l'anteprima dell'immagine FITC-Dextran con un obiettivo 5x. Regolare la messa a fuoco secondo necessità. Quindi, fai clic su Interrompi nella scheda Acquisizione per interrompere l'anteprima.

Ora, seleziona manualmente l'obiettivo dell'acqua 20x e visualizza nuovamente l'immagine FITC-Dextrano, regolando il guadagno master e il foro stenopeico nella finestra Canali per ottenere il miglior segnale e contrasto. Una volta ottenuta un'immagine ottimale per tutti e tre i canali, selezionare tutti i canali nella finestra Canali e fare clic su Aggancia nella scheda Acquisizione per acquisire un'istantanea 2D. Successivamente, per acquisire un'immagine time-lapse 2D, selezionare la serie temporale per aprire la finestra Serie temporale e immettere zero per gli intervalli e 40 per il numero totale di scansioni per ottenere 40 immagini in modo continuo senza intervallo di tempo.

Per analizzare le immagini, aprire il software di analisi delle immagini appropriato e aprire un file immagine. Per generare tracce di oggetti utilizzando le immagini time-lapse, nella vista Surpass, apri l'immagine da analizzare e fai clic sull'icona con un'immagine di punti arancioni per aprire la nuova finestra Spot. Dopo aver impostato i parametri di tracciamento, fare clic sulla casella Riempi gli spazi vuoti con tutti gli oggetti rilevati per avviare il tracciamento.

E fai clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Sotto il Tipo di filtro, seleziona il filtro Durata traccia e fai clic sulla freccia verde per terminare il tracciamento. Quindi, controlla le tracce generate, tornando al passaggio precedente se necessario.

Per misurare il movimento cellulare, definito dalle tracce Oggetto nelle immagini time-lapse, nella finestra Modifica tracce, selezionare la casella Tracce e selezionare una traccia che corrisponda al movimento della cella di interesse. La traccia selezionata verrà evidenziata in giallo nell'immagine della serie temporale. Infine, nella scheda Statistiche, fare clic sull'icona con l'immagine di un grafico per aprire la finestra Statistiche.

Quindi, in Selezione, fare clic sulla freccia giù per generare la media della velocità della traccia. La vascolarizzazione all'interno del midollo osseo può essere visualizzata da coloranti intravascolari, come il FITC-destrano. Poiché il contrasto dipende dall'iniezione del colorante, l'immagine acquisita rappresenta il sistema vascolare funzionale in cui c'è un flusso sanguigno sufficiente.

Queste immagini della stessa area del midollo osseo in diversi punti temporali dimostrano la presenza di neutrofili sia nello spazio intravascolare che in quello extravascolare per un periodo di diversi giorni. L'imaging di questo osso corticale, composto principalmente da fibre di collagene, è stato eseguito mediante generazione di seconda armonica, illustrando ulteriormente l'infiltrazione del tessuto vascolare da parte dei neutrofili. Questi neutrofili sono stati tracciati nella nicchia vascolare del midollo osseo senza un intervallo di tempo aggiuntivo tra ogni scansione, consentendo il monitoraggio accurato del loro movimento.

La velocità delle tracce generate dal software di analisi delle immagini può quindi essere misurata per analizzare la velocità di ciascuna cella. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'utilizzo di cellule marcatore ex vivo o topi reporter transgenici, possono essere utilizzati per valutare altri processi biologici in situ, come l'influenza delle cellule immunitarie sulla progressione del tumore e sulle metastasi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come installare la camera della finestra sull'osso femorale murino per tracciare i neutrofili attraverso la nicchia vascolare del midollo osseo e le strutture di collagene.