Name: Femore finestra del modello Camera per In Vivo Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri l'imaging a lungo termine dei neutrofili nel midollo osseo murino utilizzando una camera finestra sul femore con microscopia multifotone. Questo metodo consente di tracciare le dinamiche cellulari in vivo per studi immunologici e oncologici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare la funzione avanzata microscopia ottica (www.aomf.ca) presso la University Health Network per l&#39;assistenza con la microscopia, e Mr. Jason Ellis dalla principessa Margaret Cancer Center Machine Shop per la fabbricazione del WC e la fase di imaging. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Iris Kulbatski per l&#39;editing manoscritto.

NOTA: Tutto il lavoro animale è stato realizzato sotto il protocollo # 2615 approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa University Health Network. 1. Preparazione chirurgica del mouse <ol><li> Prima dell&#39;intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e la camera di finestra (WC) in autoclave. Supplemento l&#39;acqua potabile con 50 mg / kg di peso corporeo di amoxicillina 2 giorni prima dell&#39;intervento. Iniettare il mouse con 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per via intraperitoneale 4 ore prima dell&#39;intervento. </li><li> Anestetizzare il mouse nudo atimici mediante iniezione intraperitoneale di soluzione salina 350-400 ml contenente 80 mg / kg di ketamina e 13 mg / kg xylazina (Nota: Questo è stato approvato dal comitato di assistenza istituzionale degli animali, e non abbiamo avuto alcuna esperienza con effetti negativi ). Verificare il corretto anestesia testando per riflessologia plantare. Continuare l&#39;osservazione per il modello di respirazione, il colore delle mucose e di riflesso del piede durante la procedura. </li><li> Eseguire la pr chirurgicaocedures sotto un armadio biosicurezza per mantenere condizioni di sterilità durante l&#39;intervento chirurgico. Posizionare il mouse su un rilievo di riscaldamento elettrico coperto con un telo chirurgico per mantenere la temperatura corporea durante l&#39;intervento chirurgico. Eseguire tutte le procedure chirurgiche con lo stereomicroscopio. </li><li> Applicare una pomata oculare per mantenere gli occhi umidi durante l&#39;intervento chirurgico. Ripetere se necessario durante la procedura chirurgica. Sterilizzare l&#39;area di funzionamento del mouse strofinando con 7,5% iodopovidone, il 70% di alcol isopropilico e 10% iodopovidone consecutivamente, e ripetere la procedura due volte. </li><li> Fare un 10 millimetri incisione cutanea longitudinale mediante bisturi con una lama (# 15), si avvicina il femore dalla parte laterale. Esporre il femore tra i muscoli flessori ed estensori per via smussa con pinze e pinze emostatiche per garantire la funzionalità muscolare. </li><li> Inserire la barra a forma di U sotto l&#39;osso, e installare il WC (Figura 1). Fissare la barra con la finestra con due dadi, e serrare i dadi perfunghi porcini. Riempire lo spazio tra l&#39;osso e il WC con cemento dentale. </li><li> Rettificare l&#39;osso corticale in una regione 6 x 2 mm 2 con un micro-trapano per ottenere l&#39;accesso ottico alla cavità midollare. Nota: Ispezionare attentamente assottigliamento della corticale ossea sotto il microscopio durante l&#39;esecuzione di questa procedura. Lasciare intatto, quasi trasparente strato periostale dell&#39;osso. </li><li> Posizionare il coprioggetti 8 millimetri sulla finestra, e fissare il coprioggetti con un anello elastico per tenerlo in posizione. </li><li> Regolare la muscolatura dei flessori ed estensori della schiena nelle loro posizioni originali, utilizzando una pinza per mantenere la loro funzione dopo l&#39;intervento chirurgico. Suturare il derma utilizzando 5-0 di sutura e un porta aghi. </li><li> Monitorare il mouse per il recupero, finché è cosciente ed è in grado di muoversi liberamente. Mettere l&#39;animale in una nuova gabbia quando recuperati. </li><li> Dopo il recupero, eseguire l&#39;acquisizione di immagini sull&#39;animale lo stesso giorno o nei giorni successivi (vedere la sezione 2). Monitorare il Physicondizioni cal del mouse quotidiana. Nota: monitorare le condizioni fisiche, come ad esempio sostenere il peso sull&#39;arto, incurvando, respirazione rapida e superficiale, posteriori gonfiore degli arti, automutilazione, cellulite e dermatite grave. </li><li> Dare iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per 3 giorni, e 1 mg / kg di peso corporeo di meloxicam per 5 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico per il trattamento del dolore post-operatorio e l&#39;infiammazione. Continuare a fornire l&#39;acqua amoxicillina-integrato per 5 giorni. </li><li> Al endpoint sperimentale, eutanasia dell&#39;animale da CO 2 narcosi seguita da un metodo secondario (ad esempio, dislocazione cervicale). </li></ol> 2. Acquisizione Immagine Usando combinata multi-fotone e Microscopia confocale <ol><li> Prima di imaging, anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione salina 350-400 microlitri contenente 80 mg / kg ketamina e 13 mg / kg xylazina. In alternativa, utilizzare anestetico inalabile, quando disponibile.Applicare una pomata oculare. </li><li> Iniettare la miscela di coloranti intravascolari per l&#39;etichettatura vascolare (0,65 mg di 2 MDa fluoresceina (FITC) -dextran) e neutrofili (4 mg di Allophycocyanine (APC) anticorpo -Anti-Ly6G). </li><li> Utilizzare un montante combinato multi-photon e microscopio confocale equipaggiato con un laser multi-photon vanno da 705-980 nm per eccitazione a due fotoni, così come i laser di fotoni singoli che fornisce lunghezze d&#39;onda di eccitazione dal blu al rosso. </li><li> Impostare una fase di imaging su misura sul microscopio (Figura 1B). Fissare il mouse sul palco da serraggio le due estremità del WC con morsetti a coccodrillo. Nota: i componenti critici della fase sono: due morsetti a coccodrillo per tenere il WC, ed un elemento di riscaldamento per mantenere la temperatura fisiologica (37 ° C) del mouse durante l&#39;imaging. </li><li> Accendere il laser a due fotoni e il sistema confocale, e avviare il software di acquisizione delle immagini cliccando su &quot;Avvio del sistema&quot;. Una finestra con 4 schede (Locate,Acquisizione, elaborazione, e mantenere) si aprirà. </li><li> Impostare i canali di imaging. Fai clic su &quot;Smart Setup&quot; nella scheda di acquisizione e scegliere le tinte che saranno utilizzati per l&#39;imaging: FITC (488 nm di eccitazione, 493-588 nm di emissione) e APC (633 nm di eccitazione e di emissione 638-743 nm). Scegliere &quot;miglior segnale&quot; e fare clic su &quot;Applica&quot;. </li><li> Aggiungere la seconda immagine canale di acquisizione generazione armonica (SHG) manualmente. Accendere il laser a due fotoni sotto la finestra &quot;laser&quot; nella scheda di acquisizione. Sotto la finestra Canali, fare clic sul segno &quot;+&quot; per aggiungere una traccia. </li><li> Impostare la pista SHG. Modificare la lunghezza d&#39;onda di 840 nm sotto la finestra Canali utilizzando le frecce su e giù, e scegliere l&#39;intervallo di rilevamento di essere 415-425 nm sotto la finestra &quot;Percorso Light&quot; utilizzando la barra di scorrimento. </li><li> Clicca su &quot;Oculari online&quot; nella scheda Locate. Fare clic FITC sotto l&#39;impostazione del filtro per FITC per visualizzare la regione di interesse e regolare la messa a fuoco manualmente girando tsi concentrano manopola sul lato del microscopio. Quando si trova la regione di interesse, cliccare su &quot;Oculari Offline&quot; nella scheda Locate. </li><li> Fare clic sulla scheda di acquisizione. Selezionare FITC pista sotto la finestra dei canali e cliccare su &quot;Live&quot; per visualizzare in anteprima l&#39;immagine di FITC-destrano con l&#39;obiettivo 5X. Regolare la messa a fuoco, se necessario, e fare clic su &quot;Stop&quot; nella scheda di acquisizione per interrompere l&#39;anteprima. </li><li> girare manualmente a 20X obiettivo acqua spostando una ruota sopra le lenti. Visualizza l&#39;immagine ancora per FITC-destrano con l&#39;obiettivo 20X e regolare Maestro Gain e Pinhole sotto la finestra canali per ottenere ottimale del segnale e il contrasto. Ripetere l&#39;operazione per gli altri canali selezionando APC e SHG tracce sotto la finestra Canali. </li><li> Scegli i parametri di imaging. Clicca su &quot;Modalità di acquisizione&quot; per aprire la finestra. Impostare la dimensione del frame per essere 1.024 x 1.024 pixel, e una media di 4X per ottenere immagini di alta qualità. </li><li> Acquisire una fotografia 2D. Selezionare tutti i canali sotto Canali vincereDow e clicca su &quot;Snap&quot; nella scheda di acquisizione. Controllare la qualità dell&#39;immagine e modificare i parametri di imaging se necessario. </li><li> immagini time-lapse 2D acquisire. <ol><li> Controllare off &quot;Time Series&quot; nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Time Series. Digitare 0 sotto gli intervalli, e 40 per il numero totale di scansioni a prendere 40 immagini in modo continuo, senza intervallo di tempo. Nota: 40 scansioni genera circa 5 minuti lungo tempo serie con una velocità di scansione di 7,5 sec / telaio e le dimensioni dell&#39;immagine di 600 micron x 600 micron. Regolare l&#39;intervallo e il numero di scansioni seconda microscopio, impostazioni di acquisizione dell&#39;immagine e il frame rate della telecamera. Un intervallo di tempo fisso (&gt; 0 sec) può essere utilizzata per confrontare le immagini time-lapse acquisite in diversi momenti. Una durata time-lapse imaging più lungo può essere necessario in base alla velocità media attesa dei neutrofili (o altre cellule di interesse) nella condizione sperimentale. </li></ol></li><li> Acquisire immagini 3D.<ol><li> Controllare off &quot;Z-Stack&quot; nella scheda di acquisizione per aprire la finestra Z-Stack. Avviare il &quot;Live&quot; modalità di anteprima per FITC-destrano. Focus sulla parte superiore del campione e clicca &quot;Set First&quot;, e concentrarsi sull&#39;altra estremità del campione e clicca &quot;Set Ultimo&quot; nella finestra Z-stack. </li><li> Impostare l&#39;intervallo per essere di 10 micron sotto la finestra Z-stack. A seconda della prima e l&#39;ultima fetta ottica selezionato nel passaggio precedente, questo genererà 10-20 fette, con spessore ottico complessivo di 90-180 micron. Nota: L&#39;intervallo di z-stack dipende dalla dimensione del foro di spillo, che determina lo spessore della fetta ottica. Impostare l&#39;intervallo di essere inferiore allo spessore della fetta ottica. </li><li> Fare clic su &quot;Start Experiment&quot; nella scheda di acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini. </li></ol></li><li> immagini time-lapse in 3D acquisire. <ol><li> Controllare off &quot;Time Series&quot; e &quot;Z-stack&quot; nella scheda di acquisizione per aprire la serie storicae le finestre Z-stack. </li><li> Impostare le serie storiche e parametri di acquisizione Z-stack come descritto ai punti 2.14 e 2.15. Fare clic su &quot;Start Experiment&quot; nella scheda di acquisizione per iniziare a raccogliere le immagini. </li></ol></li><li> Monitorare il mouse durante l&#39;imaging per assicurarsi che sia stabile e privo di sensi. Se il mouse è instabile e / o cosciente durante l&#39;imaging, rimuovere il mouse dal palco, iniettare ulteriore 100-150 ml di soluzione di anestetico per via intraperitoneale, e continuare l&#39;imaging. Nota: segni di instabilità includono respirazione veloce e il movimento del mouse, che può essere visto come spostamento artefatti in immagini acquisite. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, prendere il mouse fuori dal palco e restituirlo alla gabbia. Utilizzare una lampada riscaldante per mantenerlo caldo, e controllare il mouse fino a quando non è cosciente. </li></ol> 3. Immagine analisi e quantificazione <ol><li> Utilizzare immagine software di analisi per analizzare i dati 3D e di serie temporali. Aprire il software eaggiungere immagini trascinandole nella schermata aperta, che si chiama vista &quot;Arena&quot;. Fare doppio clic su un file di immagine per aprirlo; l&#39;immagine verrà aperta in vista &quot;Surpass&quot;. </li><li> Creare un&#39;immagine 2D / 3D. <ol><li> Dalla barra &quot;Altro&quot; che si trova nell&#39;angolo in alto a destra, fare clic su &quot;Modifica / Mostra regolazione Display&quot; per aprire la finestra &quot;Regolazione Display&quot;. Ottimizzare la visualizzazione di fluorescenza regolando le soglie per ogni canale, e scattare un&#39;istantanea per salvare l&#39;immagine. </li></ol></li><li> Generare tracce degli oggetti utilizzando immagini time-lapse. <ol><li> Aprire l&#39;immagine da analizzare in vista &quot;Surpass&quot;. Fare clic sull&#39;icona con l&#39;immagine di puntini arancioni, che si trova sotto l&#39;icona &quot;Surpass&quot;. Si aprirà una nuova finestra &quot;Spot&quot;. </li><li> Controllare off &quot;Spot Track (nel tempo)&quot; e fare clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Selezionare il canale che contiene gli oggetti da tracciare sotto &quot;Channel Source&quot;, e impostare il diamet oggetto stimatoer under &quot;Diametro XY stimato&quot; digitando un numero. Clicca sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Nota: per il monitoraggio dei neutrofili, selezionare il canale che contiene APC fluorescenza per neutrofili e impostare il diametro dell&#39;oggetto da 12 micron in base alle dimensioni noto di neutrofili. </li><li> Nella finestra, trovare e selezionare il filtro &quot;Qualità&quot; facendo clic sulla freccia verso il basso. Osservare i punti definiti dal software e regolare manualmente la soglia per includere o escludere macchie. Una volta che la soglia è definita, cliccare sulla freccia blu per andare al passo &quot;Tracking&quot;. </li><li> Secondo l&#39;algoritmo, trovare e selezionare &quot;Motion Algoritmo Autoregressive&quot; cliccando sulla freccia verso il basso. Digitare 10 micron per &quot;Max Distance&quot; e 3 per &quot;Max Gap Size&quot; trovato sotto Parametri. Controllare off &quot;Riempire lacune con tutti gli oggetti rilevati&quot; per iniziare a monitorare, e fare clic sulla freccia blu per andare al passaggio successivo. Nota: &quot;algoritmo di movimento Autoregressive&quot; è utilizzato fo oggetti che hanno diretto il movimento, dal momento che genera le tracce in base alla posizione prevista dal movimento precedente. &quot;Max Distance&quot; e &quot;Max Gap Size&quot; può essere regolata a seconda della dimensione prevista e velocità dell&#39;oggetto essere monitorati, nonché la durata complessiva dell&#39;immagine time-lapse. </li><li> In Tipo di filtro, selezionare il filtro &quot;Durata&quot;. Fare clic sulla freccia verde per completare il monitoraggio, e controllare le tracce che sono stati generati. Torna al passaggio precedente, se necessario, per ordinare manualmente le tracce. </li></ol></li><li> Se le derive di immagini time-lapse generati, corretti per la deriva traslazionale. <ol><li> Fare clic sull&#39;icona con l&#39;immagine di una matita. Si tratta di una scheda di editing che si apre &quot;Modifica Tracce&quot; finestra. Esaminare l&#39;immagine time-lapse e trovare un posto di riferimento che non dovrebbe essere in movimento per tutte le immagini. </li><li> Nell&#39;angolo in alto a sinistra dello schermo, trovare finestra &quot;Pointer&quot; e spuntare &quot;Select&quot; per attivare la cursor per la selezione di un posto. Fare clic sul posto di riferimento. </li><li> Fai clic su &quot;Drift corretta&quot; nella finestra &quot;Modifica Tracce&quot;. Controllare off &quot;traslazionale Drift&quot;. Il software genera automaticamente la serie corretta di immagini. </li></ol></li><li> Misurare il movimento cellulare definito dalle tracce degli oggetti nelle immagini time-lapse. <ol><li> Sotto la finestra &quot;Edit Tracks&quot;, spuntare &quot;Tracce&quot; e selezionare una traccia che rappresenta il movimento di una cellula. La traccia selezionata verrà evidenziata in giallo l&#39;immagine di serie temporali in. </li><li> Fare clic sull&#39;icona con l&#39;immagine di un grafico per aprire la finestra (scheda Statistiche) &quot;Statistiche&quot;. </li><li> Sotto &quot;Selezione&quot;, selezionare &quot;Track Media&quot; facendo clic sulla freccia verso il basso per generare la velocità pista significa per la traccia selezionata. Scegli diverse tracce e ripetere la procedura per misurare la velocità pista significa per tutte le cellule di interesse. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and the control of immunity.</a> Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li>
<li>Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils: friend or foe?</a> Carcinogenesis. , (2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2+TAN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN.</a> Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).</li>
<li>Coffelt, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-producing+%5Bggr%5D%5Bdgr%5D+T+cells+and+neutrophils+conspire+to+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Imaging windows for long-term intravital imaging.</a> IntraVital. 3 (2), e29917(2014).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. (96), e52476(2015).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Progenitor+Cell+Rolling+in+Bone+Marrow+Microvessels%3A+Parallel+Contributions+by+Endothelial+Selectins+and+Vascular+Cell+Adhesion+Molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+4-Dimensional+Tracking+of+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Adult+Mouse+Calvarial+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow.</a> J. Vis. Exp. (91), e51683(2014).</li>
<li>Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+reveals+structural+and+functional+heterogeneity+in+different+bone+marrow+compartments%3A+functional+implications+on+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells.</a> Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Balan, M., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+for+ectopic%2C+chronic%2C+intravital+multiphoton+imaging+of+bone+marrow+vasculature+and+architecture+in+split+femurs%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs.</a> IntraVital. 4 (2), e1066949(2015).</li>
<li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window--a+new+approach+to+microcirculation+of+living+bone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ.</a> J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).</li>
<li>Xu, N., Lei, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Neutrophil+Intraluminal+Crawling%2C+Transendothelial+Migration+and+Chemotaxis+in+Tissue+by+Intravital+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (55), e3296(2011).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Bucher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Ly6G+antibodies+determine+macrophage+phagocytosis+of+neutrophils+and+alter+the+retrieval+of+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice.</a> J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li>
<li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL%2F6J+Mouse+Femur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

In tempo reale, imaging seriale dei processi cellulari dinamici nel midollo osseo fornisce informazioni che altrimenti difficile da ottenere con tecniche convenzionali quali l&#39;istologia e emocromo totale. Il modello di WC femore qui descritto fornisce opportunità uniche per indagare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo nel corso del tempo. Sebbene un modello femore WC è stato riportato in precedenza, il design innovativo fornisce un più grande campo di ripresa di vista e piccole dimensioni comple...

Il midollo osseo è un importante organo coinvolto nella emopoiesi e regolazione immunitaria. Si compone di un componente ematopoietiche contenente cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e una componente stromale che contiene cellule progenitrici ematopoietiche non che danno origine a cellule mesenchimali 1. Due terzi di attività ematopoietiche è dedicato alla generazione di cellule mieloidi 2. In particolare, un gran numero di neutrofili sono prodotte nel midollo osseo, con 1-2 x 10 11 cellule generate al giorno in un normale umano adulto 2. I neutrofili sono la prima linea di difesa contro le infezioni microbiche e sono per lo più riservati nel midollo osseo fino lo stress innesca la loro mobilitazione per integrare i neutrofili periferici 1,3. Oltre ai loro effetti anti-microbici, studi recenti suggeriscono un ruolo importante dei neutrofili in biologia del cancro, avendo entrambi pro e fenotipi anti-cancerogeni a seconda della crescita trasformandofattore beta (TGF-β) di segnalazione nel 4,5 microambiente tumorale. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che i neutrofili che si accumulano nei tumori primari esercitano effetti pro-cancerogeni e metastatici sopprimendo la funzione citotossica delle cellule T 6,7, mentre i neutrofili in circolazione esercitano un citotossico, effetto anti-metastatico 8. Come tale, ricerca di cellule ematopoietiche del midollo osseo, in particolare neutrofili, è fondamentale per chiarire il loro ruolo nella regolazione immunitaria e tumore. Istopatologia e un conteggio completo del sangue periferico sono abitualmente utilizzati per valutare le alterazioni cellulari e strutturali nel midollo osseo 9. Tuttavia, questi metodi forniscono solo informazioni statiche di diverse popolazioni cellulari o tissutali microstrutture. Longitudinale imaging in vivo può essere utilizzato in combinazione con i metodi standard per valutare le dinamiche di molteplici componenti cellulari, vascolari e stromali e cellula-cinterazioni ell in modo longitudinale. Microscopia intravitale (IVM), definito come l&#39;imaging di animali vivi con risoluzione microscopica 10, è particolarmente utile per valutare i processi cellulari dinamici nel tempo nello stesso campione, riducendo il numero di animali sperimentali richiesto. IVM è spesso combinato con una camera di finestra cronicamente trapiantato (WC) per accedere al organo di interesse per l&#39;imaging su una durata di settimane o mesi. modelli WC cranici e dorsale-plica hanno la più lunga storia di utilizzo che risale alla metà degli anni 1990. Più recentemente, altri modelli WC organo-specifiche, quali quelle del pad grasso mammario e vari organi addominali sono stati sviluppati 11. L&#39;approccio tipico per l&#39;imaging del midollo osseo in vivo ha l&#39;esposizione occupa principalmente della calvaria di topi, dove l&#39;osso assottigliata permette la visualizzazione diretta di singole cellule con un intervento chirurgico minimo 12-14. Tuttavia, il midollo osseo cranica May Be distinto da quello di altre ossa, come l&#39;osso lungo, come dimostrato da un numero inferiore di HSPCs e cellule ipossiche in calvaria, che indica ridotta manutenzione e lo sviluppo HSPCs 15. Pertanto, approcci alternativi per la valutazione componenti cellulari nel lungo osso sono stati indagati. Questi includono l&#39;esposizione diretta del midollo osseo femorale 16 e il trapianto ectopica di femore scissione dorsale plica WC 17. Tuttavia, il primo è un procedimento terminale che non consente il monitoraggio delle alterazioni cellulari, strutturali e funzionali su periodi di tempo più lunghi, e il secondo probabilmente disturba la normale funzione del midollo osseo a causa del trapianto di femore, a un sito ectopica all&#39;interno del WC dorsali plica. Un altro metodo che permette l&#39;imaging seriale ortotopico di midollo osseo femorale nel tempo è l&#39;uso di un WC nell&#39;osso femorale. Un rapporto precedente ha dimostrato l&#39;imaging a lungo termine della microcircolazione nel midollo osseo femorale utilizzando unafemore WC nei topi 18. Inoltre, gli autori hanno dimostrato visualizzazione delle cellule tumorali nel femore, indicando la sua utilità nel monitoraggio midollo osseo metastasi. Tuttavia, questo motivo WC era limitata dalla sua grande dimensione (1,2 cm di diametro) e relativamente piccola area di esposizione (4 mm di diametro), che era adatto solo per grandi topi (26-34 g, 3-6 mesi di età) rendendo così la approccio pratico per l&#39;uso di routine. Pertanto, un nuovo bagno con un ingombro più piccolo e più grande area di esposizione interna creata per lo scopo di questo studio. L&#39;obiettivo di questo studio era quello di fornire un metodo per l&#39;imaging vari tipi di cellule nel midollo osseo femorale. Il modello di WC femore è stato sviluppato in-house ed è stato utilizzato per visualizzare e monitorare neutrofili all&#39;interno della rete vascolare 3D. Utilizzando questo modello, IVM del midollo osseo può essere eseguito serialmente oltre 40 giorni. Questo approccio può essere applicato ad una varietà di campi per chiarire i processi di ematopoiesi, regolazione immunitaria unlo sviluppo del tumore ND.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F topi nudi atimici</td><td>Taconic</td><td>Ncr nudo</td><td>di 8-10 settimane, femmina</td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo elettrico</td><td>Marca Life</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi (gel lacrimale)</td><td>Novartis</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7,5% betadina</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% alcool isopropilico</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadina</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla curve</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico Baby-Mixter</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per</td> la <td>scienza fine Strumenti per la scienza</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Graefe extra fini</td><td>Strumenti per la scienza 11151-10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emostatici per zanzare Halsted</td><td>Strumenti per la scienza 13008-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-trapano</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Micro-foratura</td><td>Frese Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Camera della finestra del femore</td><td>PMCC officina meccanica</td><td>design personalizzato</td><td>9,1 mm- 8,5 mm- 7,5 mm (diametro esterno o interno), 2,16 mm (raggio di due fori), 13,9 mm (distanza tra due fori), 0,7 mm (spessore)</td></tr> <tr><td>Barra a forma di U</td><td>PMCC design</td><td></td> <td>personalizzato dell'officina meccanica PMCC13,8 mm (lunghezza), 1,6 mm (larghezza), 3,7 mm (altezza)</td></tr><tr><td>Vetro di copertura (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Anello di sicurezza (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>Dadi (esagono in acciaio inossidabile)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Sutura (5-0 Monosof nero)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicillina (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Stadio di imaging</td><td>PMCC officina meccanica</td><td>design personalizzato</td><td>15,9 cm (lunghezza), 11 cm (larghezza), 0,9 cm (altezza)</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Software di analisi delle immagini descritto nella Sezione 3 del Protocollo&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Software per l'acquisizione di immagini descritto nella Sezione 2 del Protocollo.</td></tr></tbody></table>

femore finestra del modello camera per<em&gt; in vivo</em&gt; monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Il midollo osseo è un organo complesso che contiene varie cellule ematopoietiche e non ematopoietiche. Queste cellule sono coinvolte in molti processi biologici, tra cui l'emopoiesi, la regolazione immunitaria e la regolazione dei tumori. I metodi comunemente usati per comprendere le azioni cellulari nel midollo osseo, come l'istologia e l'emocromo, forniscono informazioni statiche piuttosto che catturare l'azione dinamica di più componenti cellulari in vivo. Per integrare i metodi standard, è stato sviluppato un modello basato su camera a finestra (WC) per consentire l'imaging seriale in vivo di cellule e strutture nel midollo osseo murino. Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'installazione del WC nel femore, al fine di facilitare l'accesso ottico a lungo termine al midollo osseo femorale. In particolare, per dimostrare la sua utilità sperimentale, questo approccio WC è stato utilizzato per visualizzare e tracciare i neutrofili all'interno della rete vascolare del femore, fornendo così un nuovo metodo per visualizzare e quantificare il traffico e la regolazione delle cellule immunitarie nel midollo osseo. Questo metodo può essere applicato per studiare vari processi biologici nel midollo osseo murino, come l'emopoiesi, il trapianto di cellule staminali e le risposte immunitarie in condizioni patologiche, incluso il cancro.

Murine midollo osseo femorale si accede con successo utilizzando il WC per consentire la visualizzazione individuale neutrofili e reti vascolari. La Figura 1 mostra lo strumento WC e descrive la procedura chirurgica, che comporta l&#39;esposizione dell&#39;osso femorale e assottigliamento dell&#39;osso corticale per ottenere l&#39;accesso ottico all&#39;interno ossea. La chirurgia è ben tollerato nei topi; sono stati valutati per reazioni fisiche avverse, come gonfiore d...

Il protocollo descrive un nuovo modello di camera a finestra del femore murino che può essere utilizzato per tracciare il movimento delle cellule nel midollo osseo femorale in vivo. La microscopia a fluorescenza multifotone intravitale viene utilizzata per visualizzare tre componenti del midollo osseo femorale (vascolarizzazione, matrice di collagene e neutrofili) nel tempo.

Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi microscopica a lungo termine e il tracciamento dei neutrofili all'interno delle strutture vascolari del midollo osseo murino attraverso una camera a finestra cronica impiantata sulla superficie del femore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in immunologia e oncologia riguardo al ruolo dei monociti nella regolazione di un'infezione, della tumorigenesi e della metastatizzazione tumorale. I principali vantaggi di questa tecnica consistono nella possibilità di accedere microscopicamente in modo prolungato al midollo osseo femorale, un sito centrale dell'emopoiesi, e nel fornire informazioni dinamiche altrimenti difficili da ottenere con metodi convenzionali.Sebbene questo metodo sia specifico per l'immagine dei neutrofili all'interno di una rete vascolare, può anche essere utilizzato per visualizzare altre popolazioni di cellule immunitarie di interesse. Il giorno dell'intervento chirurgico, verificare il livello appropriato di sedazione attraverso l'assenza di risposta a una leggera pressione sulle dita dei piedi di un topo nude atimico. Successivamente, posizionare il topo su un tappetino riscaldante elettrico, coperto con un campo operatorio, sotto un microscopio stereoscopico.Successivamente, applicare un unguento sugli occhi dell'animale e sterilizzare l'area chirurgica con due passate consecutive di povidone-iodio al 7,5%, alcol isopropilico al 70% e povidone-iodio al 10%. Una volta preparato l'animale, utilizzare un bisturi con lama numero 15 per effettuare un'incisione cutanea longitudinale di 10 millimetri avvicinandosi al femore dal lato laterale. Poi, praticare una dissezione ottusa con pinze ed emostatici per esporre il femore tra i muscoli flessori ed estensori.Quando il femore è visibile, inserire una barra a forma di U al di sotto dell'osso e installare la camera con finestra. Fissare la barra alla finestra utilizzando due dadi. Successivamente, serrare i dadi con una pinza.Utilizzare la pinzetta per riportare la muscolatura dei flessori ed estensori alle loro posizioni originali. Riempire lo spazio tra l'osso e la camera della finestra con cemento dentale per fissare la camera della finestra in posizione. Successivamente, utilizzare un microtrapano per limare un'area di sei per due millimetri nell'osso corticale al fine di ottenere l'accesso ottico alla cavità midollare.Una volta ottenuto uno strato periosteo dell'osso quasi trasparente, posizionare un vetrino da otto millimetri sulla finestra e utilizzare un anello di fissaggio per bloccare il vetrino in posizione. Successivamente, chiudere il derma con un punto di sutura 5-0 e una pinza per ago. Quindi, posizionare il topo in una nuova gabbia con lettiera pulita, monitorandolo fino a quando non si sarà completamente ripreso.Per ottenere immagini combinate di microscopia a fotoni multipli e confocale attraverso la camera a vetro, iniettare innanzitutto le appropriate soluzioni fluorescenti per l'etichettatura dei neutrofili vascolari nel topo attraverso la vena della coda. Fissare i capi della camera a vetro con pinze a coccodrillo per ancorare il topo al supporto appositamente realizzato. Successivamente, posizionare il supporto di imaging sul microscopio combinato a fotoni multipli e confocale.Quando il mouse è ben posizionato, accendere il laser a due fotoni e il sistema confocale, quindi fare clic su Avvia sistema per avviare il software di acquisizione delle immagini. Per configurare i canali di imaging, nella scheda Acquisizione, fare clic su Configurazione rapida e selezionare i laser per l'acquisizione. Scegliere Segnale migliore e fare clic su Applica.Aggiungere manualmente il canale di acquisizione dell'immagine di generazione del secondo armonico attivando il laser a due fotoni nella finestra Laser e impostando le lunghezze d'onda di acquisizione appropriate per la generazione del secondo armonico. Nella scheda Locate, fare clic su Oculari online e individuare la regione di interesse attraverso il microscopio mediante ispezione visiva. Fare clic su Oculari offline e aprire la scheda Acquisizione.Nella finestra Canali, selezionare la traccia FITC e fare clic su Live per visualizzare in anteprima l'immagine del FITC-Destrano con un obiettivo 5x. Regolare la messa a fuoco secondo necessità. Quindi, fare clic su Stop nella scheda Acquisizione per interrompere l'anteprima.Ora, selezionare manualmente l'obiettivo ad immersione in acqua 20x e visualizzare nuovamente l'immagine di FITC-Dextran, regolando il Guadagno principale e il Pinhole nella finestra Canali per ottenere il miglior segnale e contrasto possibile. Quando si è ottenuta un'immagine ottimale per tutti e tre i canali, selezionare tutti i canali nella finestra Canali e fare clic su Acquisisci nella scheda Acquisizione per ottenere un'istantanea 2D. Successivamente, per acquisire un'immagine 2D in time-lapse, selezionare la Serie Temporale per aprire la finestra Serie Temporale ed inserire zero per gli intervalli e 40 per il numero totale di scansioni, in modo da ottenere 40 immagini in sequenza continua senza intervallo di tempo.Per analizzare le immagini, aprire il software appropriato per l'analisi delle immagini e aprire un file immagine. Per generare le tracce degli oggetti utilizzando le immagini a intervalli di tempo, nella vista Surpass, aprire l'immagine da analizzare e fare clic sull'icona con un'immagine di punti arancioni per aprire la nuova finestra Spots. Dopo aver impostato i parametri di tracciamento, selezionare la casella Compila i gap con tutti gli oggetti rilevati per avviare il tracciamento.E fare clic sulla freccia blu per passare al passaggio successivo. Sotto Tipo di filtro, selezionare il filtro Durata traccia e fare clic sulla freccia verde per completare il tracciamento. Quindi, verificare le tracce generate, tornando al passaggio precedente se necessario.Per misurare il movimento cellulare, definito dalle tracce dell'oggetto nelle immagini a intervalli di tempo, nella finestra Modifica tracce, selezionare la casella Tracce e quindi una traccia corrispondente al movimento della cellula di interesse. La traccia selezionata verrà evidenziata in giallo nell'immagine della serie temporale. Infine, nella scheda Statistiche, fare clic sull'icona con l'immagine di un grafico per aprire la finestra delle Statistiche.Quindi, sotto Selezione, fare clic sulla freccia verso il basso per generare la Velocità Media della Traccia. La vascolarizzazione all'interno del midollo osseo può essere visualizzata mediante coloranti intravascolari, come il FITC-Destrano. Poiché il contrasto dipende dall'iniezione del colorante, l'immagine acquisita rappresenta la vascolarizzazione funzionale in cui è presente un flusso ematico sufficiente.Queste immagini della stessa area del midollo osseo in diversi punti temporali dimostrano la presenza di neutrofili sia negli spazi intravascolari che extravascolari nel corso di diversi giorni. L'acquisizione di immagini di questo osso corticale, composto principalmente da fibre di collagene, &egrave; stata eseguita mediante generazione di armonica secondaria, illustrando ulteriormente l'infiltrazione del tessuto vascolare da parte dei neutrofili. Questi neutrofili sono stati tracciati nella nicchia vascolare del midollo osseo senza alcun intervallo di tempo aggiuntivo tra una scansione e l'altra, consentendo un monitoraggio accurato del loro movimento.La velocità delle tracce generate dal software di analisi delle immagini può quindi essere misurata per analizzare la velocità di ogni cellula. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'uso di cellule marcate ex vivo o di topi transgenici con reporter, possono essere impiegati per valutare altri processi biologici in situ, come l'influenza delle cellule immunitarie sulla progressione tumorale e sulla metastasi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come installare una finestra di osservazione sull'osso femorale di un topo per seguire i neutrofili attraverso il nicchio vascolare del midollo osseo e le strutture di collagene.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento seriale del midollo osseo femorale (BM) senza richiedere il sacrificio di topi. Questa procedura facilita gli studi longitudinali della composizione del midollo osseo dei topi nel tempo e fornisce un accesso seriale alle cellule all'interno del midollo osseo per studi ex vivo e di trapianto.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Viene presentato un metodo per creare e vivere immagini diverse nicchie di midollo osseo umanizzato nei topi. Sulla base della nicchia di supporto creata da cellule mesenchimali umane, l'aggiunta di cellule endoteliali umane induce la formazione di vasi umani, mentre l'aggiunta di rhBMP-2 induce la formazione di tessuto osseo chimerico maturo umano-mouse.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.

Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

Descriviamo qui il metodo per l'imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell'osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

La microscopia intravitale consente lo studio di processi biologici dinamici come la rigenerazione dei tessuti e lo sviluppo del tumore. Il midollo osseo calvariale, un tessuto altamente dinamico, offre informazioni sull'emopoiesi e sulla funzione vascolare. L'utilizzo di un impianto di fissazione della testa biocompatibile stampato in 3D consente l'imaging longitudinale ripetitivo, migliorando la nostra comprensione delle dinamiche dei tessuti e del microambiente tumorale.

Imaging longitudinale intravitale della dinamica vascolare nel midollo osseo calvariale

Il modello di lesione del midollo osseo murino è uno strumento utile per studiare l'osteogenesi postnatale attraverso l'ossificazione intramembranosa. Questo protocollo chirurgico semplificato descrive la procedura di ablazione del midollo osseo per la valutazione a valle della formazione di nuovo osso e delle risposte cellulari dopo la lesione.

Metodologia migliorata per lo studio dell'osteogenesi postnatale tramite ossificazione intramembranosa in un modello di lesione del midollo osseo murino

Scopri l'imaging a lungo termine dei neutrofili nel midollo osseo murino utilizzando una camera finestra sul femore con microscopia multifotone. Questo metodo consente di tracciare le dinamiche cellulari in vivo per studi immunologici e oncologici.

Femore finestra del modello Camera per

Esplora altri video