Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

L'obiettivo generale della tecnica di microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi è analizzare la morfologia, la struttura, la distribuzione, il volume e il numero mitocondriale in una regione definita del cervello del topo. Questo metodo può aiutare a rispondere a molte domande chiave in neurobiologia, come ad esempio se i cambiamenti nella struttura, nel numero e nella distribuzione dei mitocondri cerebrali contribuiscono in modo sostanziale ai disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che automatizza il processo di imaging delle sezioni seriali incorporando un ultramicrotomo personalizzato integrato nella camera del microscopio elettronico a scansione a basso vuoto.

Per iniziare l'esperimento, lavare i tessuti fissati con glutaraldeide precedentemente preparati tre volte per cinque minuti ciascuno in tampone di cacodilato molare da 0,1 molari. Post-fissare i fazzoletti con 1 millilitro di acido tannico tamponato con cacodilato allo 0,1% per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo il post-fissaggio, lavare i fazzoletti in tampone di cacodilato.

Sciogliere 0,3 grammi di ferrocianuro di potassio e 0,86 grammi di cacodilato di sodio in 10 millilitri di acqua distillata. Poco prima dell'uso, aggiungere 10 millilitri di tetrossido di osmio al 4% e colorare i tessuti con una soluzione di ferrocianuro di osmio al 2% per 90 minuti con ghiaccio. Dopo la colorazione, lavare il fazzoletto in acqua distillata.

Trattare i campioni con una soluzione di tiocarboidrazide all'1% o TCH preparata al momento per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare i campioni. Successivamente, colorare i tessuti con tetrossido di osmio acquoso al 2% per un'ora.

Dopo la colorazione, lavare i fazzoletti con acqua distillata. Incubare i campioni per una notte in acetato di uranile all'1% in acqua distillata a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare i fazzoletti in acqua distillata e incubarli con il colorante di aspartato di piombo di Welton in forno.

Ottenere le migliori colorazioni possibili dei tessuti è fondamentale per l'imaging, poiché una scarsa colorazione provoca un fenomeno di carica sul campione che rende difficile o impossibile l'imaging. Lavare il fazzoletto in acqua distillata. Disidratare i campioni attraverso una serie graduata di alcol utilizzando soluzioni refrigerate di etanolo per cinque minuti ciascuna, seguite da una disidratazione con etanolo al 100% tre volte per 10 minuti ciascuna.

Lavare i campioni due volte per 15 minuti ciascuno in ossido di propilene. Posizionare i fazzoletti in una miscela 1:1 di resina di inclusione e ossido di propilene, tappare la fiala e incubare i tessuti durante la notte. Stappare il flaconcino dopo due ore in modo che l'ossido di propilene evapori nel corso delle nove ore.

Trasferire i fazzoletti in resina di inclusione fresca al 100% in fiale pulite per due ore. Incorporare i campioni in resina da inclusione fresca in stampi piatti contenenti etichette di carta stampate e polimerizzarli in forno. Dopo un'ora, controllare il posizionamento e l'allineamento dei tessuti e regolare se necessario.

Taglia i campioni nell'area di interesse e montali su un perno di alluminio usando la super colla gelificante cianoacrilica. Quindi rivestire il campione con pasta d'argento colloidale attorno ai lati del blocco per fornire un percorso conduttivo al perno di alluminio. Esaminare i campioni di tessuto utilizzando un sistema di microscopio elettronico a scansione dotato di un tavolino ultramicrotomo in camera e di un rivelatore di elettroni retrodiffusi a basso kilovolt.

Immagine dei campioni con queste impostazioni. Iniziare l'analisi selezionando Immagine, Tipo, quindi 8 bit per convertire le immagini in formato TIFF a 8 bit dal 16 bit proprietario originale. Se la conversione automatica del contrasto e/o della luminosità durante questo passaggio non è ideale per le immagini, riaprire le immagini a 16 bit e premere Immagine, Regola, Luminosità/Contrasto.

Selezionare un intervallo che funzioni per tutte le immagini e premere Applica. Quindi eseguire la conversione. Se si verifica un movimento inaccettabile dell'immagine tra le sezioni, allineate le pile di immagini selezionando Plug-in, Registrazione e Allineamento pila lineare con SIFT e impostate l'allineamento per la modalità di sola traslazione anziché per il corpo rigido.

Ingrandisci le dimensioni della tela prima della registrazione selezionando Immagine, Regola, Dimensioni tela. In alternativa, riducete l'immagine a un'area di interesse selezionando l'area desiderata e ritagliandola. Se necessario, ridimensionare le immagini a una dimensione più piccola e gestibile utilizzando ImageJ, quindi selezionando Immagine e scala.

La microscopia confocale su colture neuronali a bassa densità ha mostrato che i mitocondri che risiedono nel soma neuronale formano una rete reticolare, mentre quelli che risiedono nei neuriti distali mostrano una morfologia discreta e allungata. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi, o tecnica SBFSEM, i mitocondri, i dendriti e le varici assonali sono stati chiaramente osservati nel cervello del topo. Le ricostruzioni di tre giorni dei mitocondri nei neuriti del tessuto cerebrale di topo hanno mostrato una differenza di dimensioni tra i mitocondri dendritici e assonali.

I dati estratti da un'immagine rappresentativa 2D SBFSEM hanno rivelato che il volume o la dimensione dei mitocondri che risiedono all'interno delle presinapsi neuronali era significativamente più piccolo di quelli che risiedono nella regione extrasinaptica. Le immagini acquisite dall'analisi SBFSEM forniscono una maggiore risoluzione per visualizzare le caratteristiche ultrastrutturali dei singoli mitocondri. È possibile classificare il compartimento cellulare dei mitocondri determinando la sua vicinanza a strutture facilmente identificabili come i mitocondri somatici non sinaptici e i mitocondri presinaptici.

Questa tecnica può essere eseguita in circa sette giorni, che includono tre giorni di colorazione, due giorni per l'indurimento della resina, un giorno di imaging per produrre una pila adatta a questa analisi e da due a quattro ore per la post-elaborazione dell'immagine in preparazione per l'analisi. Questa procedura può essere utilizzata anche in combinazione con altri metodi per l'imaging dei mitocondri, come l'imaging dal vivo con mitocondri geneticamente marcati, per rispondere a domande sul traffico mitocondriale e sulle dinamiche della loro fissione e fusione.