Name: Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Scopri la microscopia elettronica a scansione serial block-face per analizzare la morfologia mitocondriale nel cervello di topo. Questa tecnica automatizzata consente la ricostruzione 3D delle strutture mitocondriali nelle malattie neurodegenerative.

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Ringraziamo Sidney Walker per averci fornito assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da una sovvenzione del National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) al Virginia Tech. Attenzione: le precauzioni estreme devono essere prese nel maneggiare e smaltire diversi componenti utilizzati in questo protocollo. Prima dell&#39;uso, la linee guida istituzionali e le pratiche di salute e sicurezza locale devono essere stabilite e seguite, in particolare per tetrossido di osmio, che è volatile ed estremamente velenoso, acetato di uranile, che è sia un metallo pesante e la fonte di radioattività, e nitrato di piombo, che è un veleno di metalli pesanti. Thiocarbohydrazide (TCH) può scomporre per la produzione di gas esplosivi e velenosi, se non correttamente gestito. Molte istituzioni avranno una funzione di base EM in cui questi reagenti sono regolarmente utilizzate e in grado di fornire assistenza. 1. Preparazione del tessuto cerebrale e SBFSEM Imaging <ol><li> Anestetizzare un giovane (~ 2 - 4 mesi di età) C57 topo nero (C57BL / 6J ceppo) con 4-5% isoflurane seguendo le linee guida istituzionali. Confermare anestesia monitorando la perdita di tono muscolare, la mancanza di movimenti volontari e le risposte agli stimoli avversi come un pizzico di coda. </li><li> Pin il mouse su un vassoio dissezione e fare un&#39;incisione sulla pelle lungo la linea mediana ventrale. Fare ulteriori incisioni nella pelle per esporre la gabbia toracica del mouse. Incidere la membrana, e con attenzione sezionare cavità toracica lungo la periferia per esporre il cuore pulsante e quindi fare un&#39;incisione sul atrio destro. </li><li> Utilizzando una cannula farfalla, cannulate il ventricolo sinistro. Profumato il mouse transcardially utilizzando 10 - 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,2, fino dissanguamento è confermato da un cambiamento di colore del fegato. Nota: Una modifica del colore del fegato è utilizzato come guida per determinare il grado di dissanguamento. Verificare che i cambiamenti di colore del fegato dal bruno rossastro al rosa pallido. </li><li> Profumato il mouse transcardially utilizzando 10 - 20 ml di 2% glutaraldeidi e il 4% paraformaldeide fatto in 0,10 M tampone cacodilato (pH 7,2), per risolvere rapidamente il tessuto cerebrale dall&#39;interno. Fixation viene monitorato osservando l&#39;irrigidimento coda. Nota: Preparare 0.10 M cacodilato tampone (pH 7,2) sciogliendo 2,14 g di cacodilato di sodio in 80 ml di acqua, aggiungere acido cloridrico per regolare il pH, e rendere il volume a 100 ml con acqua. </li><li> Dopo perfusione, decapitare il mouse, sezionare il cervello, seguito da fissaggio in 0,10 M tampone cacodilato di sodio (pH 7,2) contenente 2% di glutaraldeide e 4% paraformaldeide per 48 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo 48 hr rendere 400 micron sezioni coronali utilizzando un vibratome e poi sezionare accuratamente la regione di interesse nel cervello (per esempio, l&#39;ippocampo) al microscopio di dissezione 42. Rifilare con cura il tessuto e scattare una foto per preservare l&#39;orientamento. Nota: post metodi di lavorazione di colorazione dei tessuti in SBFSEM combina una varietà di metodi di colorazione di metalli pesanti inPer migliorare la risoluzione e sono basati sul metodo sviluppato in precedenza dal Deerinck et al 40. </li><li> Lavare i tessuti glutaraldeide-fisso per 3 volte, 5 minuti ciascuno in 0.1 M tampone cacodilato (pH 7,2). </li><li> Preparare la soluzione di acido tannico 0,1% sciogliendo acido tannico in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (pH 7,2). Agitare fino a scioglimento e filtrare 0,45 micron filtro se necessario. </li><li> Postfix i tessuti con cacodilato tamponata 0,1% di acido tannico incubando in 1 ml di reagente per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Nota: Il tempo di incubazione dipende dalla dimensione dei tessuti, ma 30 minuti funziona meglio per la maggior parte dei tessuti. </li><li> Lavare i tessuti 3 volte, 5 minuti ciascuno a tampone cacodilato (pH 7,2). </li><li> Sciogliere 0,3 g ferrocianuro di potassio e 0,86 g di sodio cacodilato in 10 ml di acqua distillata H 2 O (DH 2 O). Conservare la soluzione ferrocianuro di potassio sul ghiaccio. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere 10 ml di 4% tetrossido di osmio (OSO 4). </li><li> Macchiare i tessuti con il 2% ossoluzione MIUM-ferrocianuro per 90 min, sul ghiaccio. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O. </li><li> Preparare la soluzione (TCH) 1% thiocarbohydrazide sciogliendo 0,1 g TCH in 10 ml dH 2 O. Sciogliere a 60 ° C agitando ogni 10 minuti fino a completo scioglimento. Osservare le precauzioni di sicurezza durante la manipolazione TCH, in particolare fare attenzione ad evitare l&#39;uso di metalli, riscaldamento ad alta temperatura, o una soluzione che permette di asciugare. </li><li> Trattare i campioni con preparati al 1% TCH per 20 minuti a RT. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O. </li><li> Diluire 4% OsO 4-2% con dH 2 O, tessuti macchia con 2% acquosa tetrossido di osmio incubando per 1 ora. Lavare i tessuti per 3 volte, 5 minuti ciascuno con dH 2 O. </li><li> Incubare i campioni O / N in 1% acetato di uranile in DH 2 O a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione aspartato vantaggio di Walton (come descritto da Deerinck et al 40). <ol><li> Sciogliere 0,998 g L-aspartato in 250 ml di dH 2 Oe quindi aggiungere 10 N di idrossido di potassio (KOH) in modo goccia a goccia fino a pH 5,5. Dopo la regolazione del pH, aggiungere 0,066 g di nitrato di piombo in 10 ml di acido aspartico magazzino e si riscalda a 60 ° C per 30 min. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti in DH 2 O e incubare con macchia aspartato vantaggio di Walton per 30 minuti in un forno a 60 ° C. Lavare 3 volte, 5 minuti ciascuno in DH 2 O. </li><li> Disidratare campioni attraverso una serie graduata di alcol utilizzando soluzioni refrigerate di 20%, 50%, 75%, 85% e 95% di etanolo per 5 minuti ciascuno, seguito da 100% di etanolo per 3 volte, 10 minuti ciascuno. Nota: utilizzare 100% di etanolo dalla bottiglia appena aperta, come l&#39;etanolo aperto assorbe l&#39;acqua dall&#39;aria e causare l&#39;incorporamento di fallire. incubazioni più lunghe saranno necessari con campioni di tessuto di grandi dimensioni. </li><li> Lavare i campioni 2 volte, 15 min ciascuno in ossido di propilene. </li><li> Fai la resina plastica embedding utilizzando 25 ml di resina, 10,5 ml DDSA (Dodecenyl succinica), 15,5 ml NMA (Nadic metile anidride) e 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimetilamminometil fenolo). Mescolare la resina agitando. Spin e consentire alla resina di riposare fino a quando bolle determinazione. Nota: Questa è la ricetta durezza media standard. Altri tipi di microscopia elettronica (EM) resina plastica possono essere utilizzati, ma devono essere testati con un campione di controllo non essenziale in anticipo come non tutte le resine lavorano per SBFSEM. </li><li> Incubare i tessuti O / N a 50: 50 mix di incorporamento resina e propilene ossido, in una fiala che è ricoperto inizialmente, poi livellata dopo 2 ore in modo che l&#39;ossido di propilene evapora nel periodo di circa 8 - 10 ore. </li><li> Trasferire i tessuti al 100% di resina embedding fresco in fiale pulite per 2 ore. </li><li> campioni Incorpora in resina embedding fresca, in stampi piatti contenenti stampate etichette di carta, e li cura in forno a 60 ° C per 48 ore. Dopo circa 1 ora, controllare il posizionamento dei tessuti e l&#39;allineamento di nuovo, e regolare se necessario. </li><li> Tagliare i campioni per l&#39;area di interesse e montare su un perno in alluminio utilizzando Gelling cianoacrilato colla o una resina epossidica conduttiva, poi cappotto con argento colloidale pasta intorno ai lati del blocco per fornire un percorso conduttivo al perno di alluminio. </li><li> Esaminate campioni di tessuto utilizzando un sistema microscopio elettronico dotato di uno stadio ultramicrotomo in-camera e basso kV rivelatore retrodiffusi elettroni 32. Nota: Ottenere strumento- e il sito-formazione in microscopia elettronica a scansione (SEM) utilizzare e diventare un utente autorizzato. In alternativa, la collaborazione con una struttura di ricercatore o di base per piccoli progetti può essere possibile. formazione radiazioni può anche essere richiesto come SEM generano raggi x. </li><li> Per l&#39;immagine dei campioni, utilizzare le seguenti impostazioni: 2,25 kV, a 5 - 10 nm / pixel di risoluzione, con dimensioni del campo tra 80-250 micron in x, y (dimensioni possibile altro campo), e lo spessore fetta di 50 - 100 nm, con un totale di 250 - 600 fette in un 16 - periodo 20 hr. Nota: Le impostazioni variano notevolmente tra i diversi microscopi, indicampioni individuali, e risoluzione desiderata. Queste impostazioni dovrebbero produrre immagini che sono prontamente interpretabili per molti campioni. </li></ol> 2. Analizzando il set di dati di imaging Nota: l&#39;immagine del software J / Fiji viene utilizzato per analizzare l&#39;insieme di dati e si basa su il plugin TrakEM2. passi di preelaborazione possono essere eseguiti utilizzando una varietà di software, e può essere estesa o minore a seconda del livello di esperienza e le pile ottenuti. I principali trasformazioni che utilizzano il software open-source (ImageJ ver 1.50b, FIJI scaricare 1 ottobre 2015) sono descritte qui. <ol><li> Convertire le immagini in formato TIFF a 8 bit dalle immagini a 16 bit proprietarie originali aprendo nel software e selezionare le voci di menu Immagine → Tipo → 8 bit. <ol><li> Se la conversione automatica di contrasto / luminosità in questa fase non è l&#39;ideale per le immagini, può riaprire il immagini a 16 bit, e premere il tasto Immagine → Regola → Luminosità / Contrasto. Selezionare un intervallo che funziona per tutte le immagini, e premere Apply. Quindi eseguire cLA CONVERSIONE. Nota: Su alcuni SEM, questo passaggio potrebbe richiedere software produttore microscopio. </li><li> Se necessario, a causa di movimenti immagine inaccettabile tra fette (ad es. Alla deriva a causa di carica), registrazione / allineare le pile di immagini (voci di menu Plugin → Registrazione → lineare StackAlignmentWithSIFT). Nella maggior parte dei software di registrazione, impostare per la modalità &quot;traduzione-only&quot;, piuttosto che &quot;corpo rigido&quot;. Nota: Molti approcci e software possono lavorare: la registrazione SIFT plug-in di lavori per molte applicazioni e non vi è una versione stack virtuale. <ol><li> Se necessario, allargare le dimensioni della tela prima della registrazione (Immagine → Regola → dimensionesfondo) o ridurlo ad una zona di interesse (Immagine → Ritaglia). Nota: possono verificarsi un trascinamento o divaricazione, e cercando altri plugin o software può produrre risultati migliori. Opzioni manuali sono disponibili anche (ad es. ImageJ / FIJI, Plugin → Registrazione → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Se desirEd, immagini in scala ai più piccoli, dimensione più gestibile (ad es. 25%) utilizzando ImageJ (Immagine → Scala). </li></ol></li><li> Avviare il software, selezionare File → Importa → sequenza di immagini e quindi selezionare i file TIFF. </li><li> Lanciare il plugin selezionando File → Nuovo → TrakEM2 (vuoto). Due finestre si apriranno; uno gestisce il progetto e area_lists e l&#39;altro gestisce tracciato, e si riferisce a come la &#39;tela&#39;. </li><li> Caricare la risma immagine nel plug-in facendo un clic destro sul importazione tela. Selezionare l&#39;importazione e fare clic sulla pila di importazione. Nelle opzioni pop-up, selezionare la casella per gli stack virtuali. Nota: Anche se le pile di immagini sono già aperti nel software, devono essere aperti anche nel plugin. Il computer può eseguire più agevolmente se la casella di stack virtuale sia selezionata. </li><li> Dopo le mipmap vengono creati e lo stack è stato caricato, fare clic destro per denominare il progetto sotto la finestra del plugin. Fare clic destro su &#39;nuovo progetto&#39; nel modello column, e selezionare &#39;aggiungi nuovo bambino&#39; per quel progetto. clicca di nuovo a destra per selezionare &#39;area_list&#39;. </li><li> Impostare la scala asse Z del progetto d&#39;accordo con le impostazioni originali microscopio elettronico facendo clic destro su tela, quindi fare clic su Visualizza e selezionare la calibrazione. Inoltre, impostare la Z-scala selezionando tutti i livelli nella finestra del plugin, fare clic destro per selezionare scala Z e spessore. </li><li> Fare clic e trascinare il &#39;progetto&#39; e tutti i &quot;bambini&quot; nel progetto oggetti sezione per creare le &quot;liste di zona &#39;nella scheda&#39; spazio Z &#39;nell&#39;area di disegno. </li><li> Selezionare la &#39;lista zona&#39; e fare clic destro per selezionare e impostare un colore. Ora, utilizzare lo strumento pennello per tracciare oggetti come i mitocondri, nelle immagini al microscopio elettronico. Usare &#39;Shift + click&#39; di compilare un cerchio chiuso, &#39;Ctrl + scorrimento&#39; di zoom avanti e indietro, e &#39;Alt + click&#39; per trasformare il cursore pennello in una gomma da cancellare. </li><li> Selezionare due aree di ~ 10 - 15 micronda 10-15 micron in alto a sinistra e in basso a destra dell&#39;immagine e identificare tutti i mitocondri all&#39;interno di queste aree per consentire il campionamento imparziale dei mitocondri in ogni set di dati. </li><li> Sul &#39;tele&#39;, osservare e tracciare i mitocondri in tutte le sezioni. Nota: I mitocondri sono piuttosto buio / densi organelli che appaiono, di dimensioni simili di diametro e vagamente cilindrica. Il creste unica formata dalla membrana interna sono facilmente distinguibili all&#39;interno di questo organello. </li><li> Una volta terminato con l&#39;analisi, fare clic destro sul area_list nella scheda spazio Z, selezionare &#39;Mostra in 3D&#39;. Questo lancerà il plugin visualizzatore 3D per visualizzare una ricostruzione 3D dell&#39;immagine tracciata. <ol><li> Per eseguire misurazioni del volume mitocondriale, selezionare oggetto in visualizzatore 3D, fare clic sulla scheda &#39;Modifica&#39; e selezionare &#39;Proprietà oggetto&#39;. La stima del volume mitocondriale è elencata insieme a diverse altre misure. </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Emily K Benson è una dipendente retribuita di Renovo Neural Inc. e Grahame J Kidd ricopre il ruolo di direttore scientifico per 3DEM presso Renovo Neural Inc., che è un fornitore commerciale di servizi e analisi SEM seriali a blocchi.

La complessità del sistema nervoso rappresenta una sfida significativa per ricostruire grandi volumi di tessuto e l&#39;analisi della morfologia e distribuzione di organelli come mitocondri con adeguata risoluzione. Più celle tra neuroni, oligodendrociti e astrociti con numerosi processi estesi in tre dimensioni interagiscono all&#39;interno del tessuto cerebrale 43. Poiché i mitocondri risiede sia nel soma di cellule e processi lontane, morfologia mitocondriale è estremamente pleomorfica nel sistema nervoso ...

I mitocondri sono organelli dinamici che cambiano la loro forma e la posizione a seconda delle esigenze spunti e cellulari, in stretta interazione con citoscheletro cellulare, e in risposta ad eventi cellulari come correnti di calcio nei neuroni 1. I mitocondri interagiscono anche con altri organelli cellulari ad esempio reticolo endoplasmatico, che a sua volta regola la loro dinamica e metabolismo 2. Morfologia mitocondriale mostra eterogeneità in diversi tipi di cellule ad esempio. la forma del organello varia da tubolare costituita dai fogli, sacchi e ovali 3. E &#39;stato dimostrato che mitocondriali fusione e fissione proteine ​​del ciclo possono regolare la posizione, dimensione, forma e distribuzione dei mitocondri 4. Inoltre, cambiamenti di forma mitocondriale sono associati a neurodegenerazione, plasticità neuronale, atrofia muscolare, la segnalazione di calcio, specie reattive dell&#39;ossigeno generazione così come la durata della vita e la morte cellulare implicando thacellule T specifiche per la morfologia mitocondriale è fondamentale per il mantenimento della normale funzione cellulare 5-11. Una delle principali funzioni bioenergetico dei mitocondri è generare adenosina trifosfato (ATP) eseguendo una serie di reazioni metaboliche che coinvolgono ripartizione completa dei nutrienti (cioè glucosio, acidi grassi o amminoacidi) tramite il ciclo TCA e OXPHOS percorsi 12. Il cervello umano costituisce solo il 2% del peso corporeo tuttavia consuma ~ 20% del totale dell&#39;energia prodotta che lo rende estremamente energia esigente organo 13. È quindi sorprendente che la disfunzione mitocondriale nell&#39;uomo conduce a un gran numero di manifestazioni neurologiche 14-17. Le mutazioni genetiche nei componenti OXPHOS che compromettono porta ATP generazione di disturbi mitocondriali 17,18, che sono gruppo clinicamente eterogeneo di disordini con una prevalenza di ~ 1: 5.000 individui, e una delle cause più comune di mdisturbi etabolic nei bambini e negli adulti. Deficit di ATP mitocondriale di derivazione colpisce di più sistemi di organo con gli organi che richiedono alta energia, come cervello, cuore e muscoli scheletrici essendo prevalentemente colpite in questi pazienti 14,17,18. Negli ultimi anni, diversi studi hanno fornito evidenza di disfunzione mitocondriale in entrambi i disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerative 15-17,19,20. Dal momento che i mitocondri sono essenziali e fondamentali per lo sviluppo e la funzione del cervello, è imperativo sviluppare protocolli in grado di analizzare i cambiamenti nel cervello mitocondriale morfologia, la struttura, le dimensioni, il numero e la distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malati. Modelli murini con mitocondri mirati proteina fluorescente verde (GFP) sono stati prodotti di visualizzare i movimenti mitocondriali e la localizzazione nel cervello 21,22. Anche se questo è uno strumento estremamente utile per esaminare la motilità mitocondriale e distribuzione generale, ci sono alcuni inconvenienti che INCLUDe risoluzione limitata e sensibilità della microscopia a fluorescenza. Questi attributi rendono difficile rintracciare le relativamente piccole dimensioni mitocondri. Allo stesso modo, microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per visualizzare mitocondri sinaptica 23, ma questo metodo è molto tempo. La morfologia mitocondriale è noto per essere altamente dinamico come subiscono cicli di fissione e fusione continui, e nella maggior parte delle cellule mitocondri mantenere una rete altamente connessa 24-26. I neuroni sono altamente cellule con più dendriti e assoni estese, e mitocondri che formano una rete reticolare collegato nel corpo cellulare polarizzato può avere per separare come si fanno strada attraverso questi neuriti (Figura 1). Questo rende i mitocondri cerebrali estremamente vari per forma e dimensioni. Ad esempio, utilizzando la microscopia elettronica a scansione blocco faccia seriale (SBFSEM) tecnica, abbiamo precedentemente osservato che la differenza di volume o dimensioni mitochondr extrasinapticaia ai mitocondri presenti nei terminali nervosi può essere fino a sedici piega 27. Ci sono diversi approcci per l&#39;esecuzione di analisi del volume 28, che comprende una sezione di serie TEM 29, nastro automatizzata raccolta ultramicrotomo SEM 30, concentrati Ion Beam SEM 31, e SBFSEM 32. L&#39;analisi SBFSEM presenta vantaggi in quanto ha la risoluzione di fornire dati quantitativi sulla morfologica forma, dimensioni, distribuzione e numero di organelli come mitocondri nelle zone fino a 1 mm dal cervello. L&#39;operazione tecnica è anche il meno impegnativo, con l&#39;acquisizione dei dati e l&#39;analisi alla portata di molti laboratori biologici che non hanno precedenti esperienze EM. L&#39;avvento degli strumenti commerciali per la generazione di immagini di sezione simile seriali ha reso 3D analisi ultrastrutturale dei tessuti una tecnica di routine, che consente inoltre un&#39;analisi volumetrica imparziale in modo rapido e ripetibile 28 </sup&gt;. Il SBFSEM è stata descritta ed utilizzata nel campo della neurobiologia nel 2004 32, basato su un&#39;idea introdotta da Leighton nel 1981 33. Diversi studi da allora hanno stabilito questa tecnica come strumento di analisi ricostruzione dei circuiti neuronali 34. Inoltre, per molti progetti di dimensioni ridotte, che fornisce analisi di ricostruzione per identificare organelli cellulari 27,35-39. Poiché, le immagini acquisite vengono derivati ​​da bassa tensione elettroni retrodiffusione, nuovi protocolli di colorazione che combinano diverse tecniche note colorazione metalli pesanti sono stati sviluppati per aumentare la risoluzione 40. In questo lavoro, mettiamo a disposizione un protocollo per l&#39;utilizzo di immagini di microscopia elettronica 3D e l&#39;analisi volumetrica dei mitocondri cerebrali in base a metodi che sono stati usati in precedenza da noi e altri 38,39,41. I metodi di tessuti post-processing utilizzati erano come precedentemente descritto da Deerinck et al40.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J topi Jackson</td><td>laboratorio</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone, nome commerciale Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di dissezione</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Canula a farfalla</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filtro (0,45 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di sezionamento a vibratomo</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratomo 3000</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Acido tannico</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 4% Soluzione</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbobidrazide</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-aspartico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di piombo</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 KIT DI INCLUSIONE</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Contiene resina 812&nbsp;, DDSA, NMA e DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldeide 25% EM Grade</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per inclusione</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Perno per campioni di alluminio</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Argento colloidale Rasoio liquido</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super colla (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>I negozi di ferramenta / artigianato portano questo articolo</td></tr><tr><td>Epossidico conduttivo</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo a camera per SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Può essere progettato per altri SEM</td></tr><tr><td>Microscopio di rifilatura per la preparazione dei perni</td><td>Gatan Inc.</td><td>fornito come parte del sistema</td><td></td>3View</tr><tr><td>Rivelatore di elettroni retrodiffusi a basso kV</td><td>Gatan Inc.</td>Pacchetto di elaborazione <td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fiji&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

analisi di brain mitocondri utilizzando serial block-face scanning electron microscopy



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Il cervello umano è un alto organo consumare energia che si basa principalmente su glucosio come fonte di combustibile. Il glucosio è catabolizzata dai mitocondri cerebrali tramite percorsi glicolisi, acido tri-carbossilico (TCA) ciclo e fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per produrre energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). Perdite di valore di produzione di ATP mitocondriale provoca disturbi mitocondriali, che presentano clinicamente con sintomi neurologici e miopatici prominenti. Difetti mitocondriali sono presenti in disturbi dello sviluppo neurologico (ad esempio disturbo dello spettro autistico) e disturbi neurodegenerativi anche (ad esempio, sclerosi laterale amiotrofica, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson). Quindi, vi è un crescente interesse nel campo per l&#39;esecuzione di analisi 3D mitocondriale morfologia, struttura e distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malattia. La morfologia mitocondriale cervello è estremamente variegato, con alcuni mitocondri specialmente quelliregione sinaptica essendo nell&#39;intervallo &lt;200 nm di diametro, che è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica tradizionale. Esprimendo una proteina mitocondrialmente mirati verde fluorescente (GFP) nel cervello migliora in modo significativo la rilevazione organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, non supera i vincoli sulla sensibilità di rilevazione dei mitocondri relativamente piccole dimensioni senza sovra- saturazione delle immagini di grandi dimensioni mitocondri. Mentre microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per caratterizzare i mitocondri alla sinapsi neuronali, questa tecnica è notevole spreco di tempo soprattutto quando si confrontano campioni multipli. La tecnica di blocco faccia microscopia elettronica a scansione seriale (SBFSEM) comporta un processo automatizzato di sezionamento, blocchi di imaging di acquisizione dei tessuti e dei dati. Qui, forniamo un protocollo per eseguire SBFSEM di una regione definita da roditore cervello per ricostruire rapidamente e visualizzare la morfologia mitocondriale. questa tecnologianique potrebbe anche essere utilizzato per fornire informazioni accurate sul numero mitocondriale, volume, dimensione e distribuzione in una regione del cervello definito. Dal momento che la risoluzione dell&#39;immagine ottenuta è elevata (in genere sotto i 10 nm) possono essere rilevati anche gli eventuali difetti morfologici mitocondriali lordi.

Abbiamo dimostrato che il cervello morfologia e le dimensioni dei mitocondri è eterogeneo in diversi sotto-comparti neuronali. Microscopia confocale a bassa densità colture neuronali trasdotte con lentivirus che esprimono la proteina fluorescente verde mitocondri mirati ha dimostrato che i mitocondri che risiedono nel soma neuronale formano una rete reticolare, mentre quelli che risiedono in neuriti distali esibiscono una discreta morfologia allungata (Figura 1 AB). Util...

La visualizzazione e l'analisi mitocondriale dal tessuto cerebrale dei mammiferi è un compito impegnativo. Qui, descriviamo come l'analisi di ricostruzione tridimensionale (3D) dalla microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBFSEM) possa essere utilizzata per ottenere informazioni sull'analisi morfologica e volumetrica di questo organello critico generatore di energia.

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

L'obiettivo generale della tecnica di microscopia elettronica a scansione con sezioni seriali ottenute mediante microtomo integrato è analizzare la morfologia, la struttura, la distribuzione, il volume e il numero di mitocondri in una regione definita del cervello del topo. Questo metodo può contribuire a rispondere a numerose domande fondamentali in neurobiologia, come ad esempio se i cambiamenti nella struttura, nel numero e nella distribuzione dei mitocondri cerebrali contribuiscano in modo significativo alle patologie neurodegenerative e ai disturbi dello sviluppo neurologico. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nell'automatizzare il processo di acquisizione delle immagini di sezioni seriali, integrando un microtomo personalizzato all'interno della camera del microscopio elettronico a scansione a basso vuoto.Per iniziare l'esperimento, lavare i tessuti fissati con glutaraldeide precedentemente preparati tre volte per cinque minuti ciascuna in tampone cacodilato 0,1 molare. Postfissare i tessuti con 1 millilitro di acido tannico tamponato con cacodilato allo 0,1% per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la postfissazione, lavare i tessuti in tampone cacodilato.Sciogliere 0,3 grammi di ferrocianuro di potassio e 0,86 grammi di cacodilato di sodio in 10 millilitri di acqua distillata. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 10 millilitri di tetrossido di osmio al 4% e colorare i tessuti con soluzione al 2% di ferrocianuro di osmio per 90 minuti sul ghiaccio. Dopo la colorazione, lavare il tessuto con acqua distillata.Trattare i campioni con una soluzione di tiocarboidrazide (TCH) al 1% appena preparata per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i campioni. Quindi, colorare i tessuti con osmio tetroxido acquoso al 2% per un'ora.Dopo la colorazione, lavare i tessuti con acqua distillata. Incubare i campioni tutta la notte in acetato di uranile al 1% in acqua distillata a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, risciacquare i tessuti con acqua distillata e incubarli con la colorazione di aspartato di piombo di Welton in un forno.ottenere le colorazioni tissutali migliori possibili è fondamentale per l'acquisizione di immagini, poiché una scarsa colorazione provoca un fenomeno di carica sul campione che rende difficile o impossibile l'analisi microscopica. Lavare il tessuto con acqua distillata. Disidratare i campioni attraverso una serie progressiva di alcol utilizzando soluzioni di etanolo refrigerate per cinque minuti ciascuna, seguite da tre cicli di disidratazione con etanolo al 100% per 10 minuti ciascuno.Lavare i campioni due volte per 15 minuti ciascuna in ossido di propilene. Collocare i tessuti in una miscela 1:1 di resina inclusa e ossido di propilene, chiudere il flacone e incubare i tessuti tutta la notte. Riaprire il flacone dopo due ore in modo che l'ossido di propilene evapori nel periodo di nove ore.Trasferire i tessuti in resina di inclusione fresca al 100% in vial puliti per due ore. Includere i campioni in resina di inclusione fresca in stampi piani contenenti etichette di carta stampate e polimerizzarli in forno. Dopo un'ora, verificare la posizione e l'allineamento del tessuto e correggere se necessario.Tagliare i campioni nella zona di interesse e montarli su un perno in alluminio utilizzando una colla cianoacrilica gelificante. Quindi ricoprire il campione con una pasta di argento colloidale lungo i lati del blocco, in modo da creare un percorso conduttivo verso il perno in alluminio. Esaminare i campioni di tessuto mediante un microscopio elettronico a scansione dotato di una piattaforma ultramicrotomica all'interno della camera e di un rilevatore di elettroni retrodiffusi a basso kilovoltaggio.Acquisire i campioni con queste impostazioni. Iniziare l'analisi selezionando Immagine, Tipo, quindi 8-bit per convertire le immagini in formato TIFF a 8 bit partendo dal formato proprietario originale a 16 bit. Se la conversione automatica del contrasto e/o della luminosità durante questo passaggio non è ottimale per le immagini, riaprire le immagini a 16 bit e premere Immagine, Regola, Luminosità/Contrasto.Selezionare un intervallo valido per tutte le immagini e premere Applica. Quindi eseguire la conversione. Se si è verificato un movimento inaccettabile dell'immagine tra le sezioni, allineare gli stack di immagini selezionando Plugin, Registrazione e Allineamento Lineare degli Stack con SIFT, impostando l'allineamento in modalità solo traslazione anziché corpo rigido.Ampliare le dimensioni della tela prima della registrazione selezionando Immagine, Regola, Dimensioni tela. In alternativa, ridurre l'immagine a un'area di interesse selezionando la regione desiderata e quindi ritagliandola. Se necessario, ridimensionare le immagini a una dimensione più piccola e gestibile utilizzando ImageJ, quindi selezionare Immagine e Ridimensiona.La microscopia confocale su colture neuronali a bassa densità ha mostrato che le mitocondrie presenti nel soma neuronale formano una rete reticolare, mentre quelle localizzate nei neuriti distali presentano una morfologia allungata e distinta. Mediante la tecnica di microscopia elettronica a scansione con sezione seriale del blocco, o SBFSEM, le mitocondrie, le dendriti e le varicosità assonali sono state chiaramente osservate nel cervello del mouse. Ricostruzioni tridimensionali delle mitocondrie nei neuriti del tessuto cerebrale del mouse, ottenute in tre giorni, hanno evidenziato una differenza di dimensione tra le mitocondrie dendritiche e assonali.I dati estratti da un'immagine rappresentativa a 2-D ottenuta mediante SBFSEM hanno rivelato che il volume o le dimensioni dei mitocondri presenti all'interno delle presinapsi neuronali erano significativamente inferiori rispetto a quelli localizzati nella regione extrasinaptica. Le immagini acquisite mediante analisi SBFSEM offrono una risoluzione maggiore, utile per visualizzare le caratteristiche ultrastrutturali dei singoli mitocondri. È possibile classificare il compartimento cellulare dei mitocondri determinandone la vicinanza a strutture facilmente identificabili, come i mitocondri somatici non sinaptici e i mitocondri presinaptici.Questa tecnica può essere eseguita in circa sette giorni, inclusi tre giorni di colorazione, due giorni per la polimerizzazione della resina, un giorno di acquisizione immagini per produrre uno stack adatto a questa analisi e circa due o quattro ore di post-elaborazione delle immagini in preparazione all'analisi. Questa procedura può inoltre essere utilizzata in combinazione con altri metodi di imaging dei mitocondri, come l'acquisizione in tempo reale con mitocondri marcati geneticamente, per rispondere a domande riguardanti il traffico mitocondriale e la dinamica della loro fissione e fusione.

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Questo protocollo descrive come il tessuto cerebrale resina incorporati possono essere preparati e ripreso nelle tre dimensioni del fascio di ioni focalizzato, microscopio elettronico a scansione.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

Fonte: Mukherjee, K., et. al. Analisi dei mitocondri cerebrali utilizzando la microscopia elettronica a scansione seriale a scansione a blocchi. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la preparazione,  imaging e analisi del tessuto cerebrale di topo utilizzando un microscopio elettronico a scansione seriale a blocchi (SBFSEM) per visualizzare l'ultrastruttura mitocondriale, consentendo una mappatura precisa della loro morfologia e distribuzione spaziale nei compartimenti neuronali assonali e...

 Imaging dei mitocondri neuronali utilizzando un microscopio elettronico a scansione seriale a scansione a blocchi

In questo protocollo, dimostriamo l'applicazione della tomografia elettronica di serie-sezione per delucidare la struttura mitocondriale nel muscolo di Drosophila voli indiretti.

3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione

Qui presentiamo un protocollo per combinare in modo efficiente la faccia a blocchi seriali e la microscopia elettronica a scansione del fascio ionico focalizzato per indirizzare un'area di interesse. Ciò consente una ricerca efficiente, in tre dimensioni e l'individuazione di eventi rari in un ampio campo visivo.

Studi mirati utilizzando la faccia a blocchi seriali e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Questo protocollo delinea un metodo di routine per l'utilizzo della microscopia elettronica seriale a scansione block-face (SBF-SEM), una potente tecnica di imaging 3D. L'applicazione di successo di SBF-SEM dipende da corrette tecniche di fissazione e colorazione dei tessuti, nonché da un'attenta considerazione delle impostazioni di imaging. Questo protocollo contiene considerazioni pratiche per l'intero processo.

Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico

La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l'immagine e l'analisi delle spine dendritiche nell'ippocampo murino.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.

Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

Questo protocollo descrive come ricostruire le creste mitocondriali per ottenere immagini 3D con elevata precisione, alta risoluzione e throughput elevato.

Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare i cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione longitudinale mediante imaging del muscolo scheletrico vivo utilizzando la microscopia confocale per la scansione della rete mitocondriale.

Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale

Qui descriviamo il localizzatore di eventi mitocondriali (MEL), un plugin di ImageJ utile per quantificare i cambiamenti tridimensionali nell'attività di fissione e fusione mitocondriale nel tempo. Descriviamo anche una pipeline di elaborazione delle immagini utile per la pulizia delle micrografie prima dell'analisi in ImageJ.

Comprensione dei cambiamenti nella morfologia mitocondriale attraverso micrografie a fluorescenza dinamiche e tridimensionali

Scopri la microscopia elettronica a scansione serial block-face per analizzare la morfologia mitocondriale nel cervello di topo. Questa tecnica automatizzata consente la ricostruzione 3D delle strutture mitocondriali nelle malattie neurodegenerative.

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

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