Neurodegenerazione in un modello animale di cronica amiloide-beta Oligomer infusione viene neutralizzata da anticorpi trattamento infuso con pompe osmotiche

L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è testare l'effetto delle terapie sulla tossicità dell'oligomero beta-amiloide in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malattia di Alzheimer, come la ricerca di nuove terapie mirate all'effetto neurotossico dell'oligomero di amiloide-beta in un modello animale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per studiare il meccanismo attraverso il quale l'oligomero beta amiloide induce effetti neurotossici in vivo.

E il nostro trattamento, come l'immunoterapia, può contrastare l'effetto dannoso sul cervello. A dimostrare la procedura sarà Chloe Provost, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare il processo di impianto della cannula, tagliare prima i cateteri PE50 a sei centimetri di lunghezza.

Quindi, riempire i cateteri con liquido cerebospinale artificiale. Sigillare entrambe le estremità dei cateteri con una macchina termosaldante. Aggiungere cemento dentale su entrambe le estremità.

Dopo aver anestetizzato i ratti secondo un metodo approvato, confermare l'anestesia controllando il movimento dopo un leggero pizzicamento delle dita. Quindi, iniettare all'animale anestetizzato un farmaco antinfiammatorio non steroideo. Dopo la rasatura della testa dell'animale con le tosatrici, disinfettare la pelle con una soluzione di clorexidina gluconato al 2% e alcol isopropilico al 2%.

Applicare un unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Ora, posiziona l'animale in una cornice stereotassica usando le barre auricolari. Fissare una cannula sul braccio di supporto della montatura stereotassica.

Dopo aver iniettato un agente anestetico locale e aver praticato un'incisione di tre centimetri con il bisturi sulla sommità della testa, installare quattro morsetti attorno all'incisione per lasciare il cranio libero. Quindi, usa una forbice a punta tonda per creare una tasca quadrata di due centimetri per due sotto la pelle tra le scapole dell'animale. Tornando alla testa, graffia il periostio del cranio con una lama.

Applicare una garza sul cranio se si verifica un'emorragia. Ora, per verificare che il cranio sia piatto e ben allineato sulla cornice stereotassica, controlla le coordinate dell'altezza a lambda e a bregma. Registra le coordinate di bregma che verranno utilizzate come punto di riferimento.

Dopo aver calcolato le coordinate per il corretto posizionamento bilaterale delle due cannule guida, praticare un foro di 0,5 millimetri nel cranio nel punto di impianto di entrambe le cannule. Perforare altri tre a circa cinque millimetri sopra e sotto quei punti per inserire le viti che stabilizzeranno la cannula durante l'applicazione del cemento dentale. Successivamente, tagliare un'estremità del catetere, precedentemente riempito con aCSF, con la forbice e inserirla nel braccio angolare della cannula.

Fissare la prima cannula con cemento dentale. È fondamentale evitare di mettere del cemento dentale intorno alla posizione della seconda cannula. Dopo aver lasciato asciugare il cemento dentale per due o tre minuti, rimuovere il braccio del supporto dalla prima cannula e posizionare la seconda cannula tagliata al suo interno.

Fissare la seconda cannula in posizione con cemento dentale. Quindi, metti la cannula fittizia su entrambe le cannule guida. Inserire l'estremità libera di entrambi i cateteri nella tasca precedentemente praticata tra le scapole dell'animale.

Rimuovere i morsetti, quindi cucire la pelle con una sutura a quattro ore. Aggiungere altro cemento intorno alla cannula. Rimuovi l'animale dal telaio stereotassico e mettilo su un cuscinetto termico in una gabbia pulita.

Monitorare costantemente l'animale fino a quando non riacquista una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Quindi, rimettilo nella stanza dell'alloggio per riprenderti dall'intervento chirurgico per 10 giorni sotto stretto monitoraggio. Un giorno prima dell'installazione, riempire le pompe osmotiche con l'anticorpo 6E10 o controllare l'anticorpo IgG1, secondo le istruzioni del produttore.

Immergere le pompe in acqua distillata sterile e mantenerle a 37 gradi Celsius durante la notte per attivare le pompe. Una volta che il ratto è stato anestetizzato con isoflurano al 3% e rasato tra le scapole, disinfettare la pelle con una soluzione di clorexidina gluconato al 2% e alcol isopropilico al 2%. Dopo aver praticato un'incisione di due centimetri con un bisturi tra le scapole, individuare i cateteri PE50 collegati alla cannula guida.

Quindi, tagliare le estremità dei cateteri PE50 contenenti cemento dentale con un bisturi. Collegare le pompe osmotiche ai cateteri PE50 e aggiungere un po' di cemento dentale alla giunzione della pompa e del catetere per garantire il collegamento. Infine, cucire saldamente la pelle con quattro punti di sutura.

Rimetti l'animale nella sua gabbia su un cuscinetto termico caldo e monitoralo mentre si risveglia dall'anestesia con isoflurano. Dopo aver preparato la soluzione di oligomero di amiloide-beta come precedentemente riportato, lasciare che la soluzione si aggreghi dinamicamente e spontaneamente per un'ora a temperatura ambiente prima dell'infusione. Quindi, riempi ogni siringa con cinque microlitri di acqua distillata sterile.

Quindi, tagliare due cateteri PE50 a circa 60 centimetri di lunghezza con un bisturi. Utilizzare due siringhe da un millilitro dotate di aghi calibro 21 per riempire entrambi i cateteri con acqua distillata sterile. Mentre le siringhe da un millilitro rimangono in posizione a un'estremità di ciascun catetere, collegare le estremità libere alle siringhe di Hamilton.

Rimuovere le siringhe da un millilitro e verificare che non vi siano bolle d'aria nei cateteri. Inserire la cannula interna all'estremità dei cateteri PE50. Utilizzare le siringhe Hamilton per riempire ogni cannula interna fino a un microlitro, quindi creare una bolla d'aria tirando indietro il pistone fino al segno di due microlitri.

A questo punto, miscelare la soluzione di oligomero beta-amiloide pipettando su e giù utilizzando un puntale di minima aderenza. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione. Quindi, riempire entrambe le cannule interne con 1,5 microlitri di soluzione di oligomero beta amiloide tirando indietro i pistoni a 3,5 microlitri.

Quindi, segnare le linee prima e dopo la bolla d'aria in entrambi i cateteri. Questo serve come punto di controllo dell'infusione in corso. Metti il topo sveglio in una presa per coccole e immobilizza la sua testa.

Rimuovere la cannula cieca dalle due cannule guida, quindi inserire la cannula interna precedentemente preparata nella cannula guida. Verificare che siano completamente inseriti e ben fissati alla base della cannula guida. Ora, libera il topo dalla presa delle coccole e rimettilo nella sua gabbia per limitare lo stress da manipolazione.

Accendere la pompa di infusione e iniettare un microlitro di soluzione di oligomero beta-amiloide a una velocità di 0,1 microlitri al minuto. Durante l'infusione, verificare che il pistone della siringa si muova da 3,5 microlitri a 2,5 micorliter e che le bolle d'aria in entrambi i cateteri PE50 si muovano continuamente. Controllare il ratto per assicurarsi che i cateteri non si attorciglino insieme.

Lasciare la cannula interna in posizione per altri cinque minuti dopo l'infusione per consentire una diffusione efficiente della soluzione di oligomero beta-amiloide. Dopo l'infusione, riportare il ratto nella presa di coccole e rimuovere la cannula interna e la cannula guida con tappo per prevenire il reflusso della soluzione iniettata. Posizionare una cannula fittizia che si fermi appena prima del braccio angolare della cannula guida.

Infine, riporta l'animale nella sua gabbia. I risultati qui presentati mostrano la deposizione di oligomeri di amiloide-beta nel giro dentato vicino al sito di infusione e la morte cellulare associata a questo accumulo. Il livello di oligomeri di amiloide-beta è stato sostanzialmente ridotto dal trattamento con anticorpi 6E10, come rivelato dall'immuno-colorazione con anticorpi anti-A-beta.

Una marcata neurodegenerazione è stata osservata vicino al sito di iniezione di A-beta-O ed è stata attenuata dal trattamento con anticorpi 6E10, come dimostrato dalla colorazione con Cresyl violet. Una volta padroneggiata, l'impianto di cannula può essere eseguito in 30 minuti se eseguito correttamente. L'installazione della pompa osmotica richiederà circa 10 minuti e l'iniezione di amiloide-beta circa 15 minuti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare di mettere del cemento dentale attorno alla posizione della seconda cannula quando si inserisce la prima cannula. Inoltre, attendi che l'animale si calmi prima di inserire la cannula interna nella cannula guida. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impiantare cannule e pompe osmotiche per infondere oligomeri di amiloide-beta e testare i trattamenti per la malattia di Alzheimer come l'immunoterapia.