Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la fedeltà della segregazione cromosomica durante la mitosi in un embrione di pesce zebra vivente, utilizzando cromatina marcata con fluorescenza e proteine della membrana cellulare che verranno acquisite mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della mitosi, come ad esempio in che modo i difetti mitotici portano a un difetto dello sviluppo o alla formazione di tumori in un organismo vertebrato vivente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che stiamo osservando la mitosi in un organismo vertebrato vivente, il che consente di raccogliere dati fisiologicamente rilevanti.

Dopo l'accoppiamento di zebrafish adulti e l'iniezione delle uova con RNA H2A.F/Z-EGFP e/o pCS2 mCherry-CAAX, circa due ore prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per identificare gli embrioni positivi per GFP. Trasferire gli embrioni che esprimono un'intensa fluorescenza verde in una nuova capsula di Petri di 100 per 15 millimetri contenente mezzo E3 blu.

Fare bollire una soluzione madre di agarosio a basso punto di fusione all'1% in E3 blu. Aliquotare tre millilitri di agarosio fuso in un tubo da coltura di 17 per 100 millimetri. Mantenere l'agarosio caldo ponendo il tubo da coltura in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Raccogliere tricaina 15 millimolare, embrioni selezionati, agarosio a basso punto di fusione, E3 blu e una piastra per colture con fondo in vetro da 35 millimetri, nonché un microscopio stereoscopico. Successivamente, con pinzette numero cinque, rimuovere con attenzione le corioni da tre embrioni e posizionare gli embrioni in un contenitore separato per l'anestesia. Poi, utilizzando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce di tricaina 15 millimolare nella piastra contenente gli embrioni e cinque millilitri di mezzo.

Aggiungere tre o quattro gocce di soluzione di tricaina 15 millimolare al tubo contenente agarosio fuso all'1%. Quando gli embrioni sono sufficientemente anestetizzati, utilizzando un Pipetman P200 con un centimetro della punta del pipettatore tagliato, trasferire gli embrioni anestetizzati nella piastra con fondo in coprivetrino. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione di tricaina E3 blu.

Aggiungere lentamente da cinque a dieci microlitri di soluzione di tricaina in agarosio a basso punto di fusione sugli embrioni, mantenendo ogni goccia separata, per assicurare che gli embrioni non si avvicinino tra loro. Quindi, utilizzando un ago da un'ora e mezza del calibro 21, orientare delicatamente gli embrioni nell'agarosio nella posizione desiderata, posizionando la regione di interesse il più vicino possibile alla lamella se si utilizza un microscopio invertito. A causa degli spostamenti che potrebbero verificarsi, potrebbe essere necessario tornare su ciascun embrione per assicurarsi che rimanga nella posizione richiesta.

Questa operazione potrebbe dover essere ripetuta più volte finché non si raggiunge la posizione ideale durante la solidificazione dell'agar. Dopo alcuni minuti, per verificare se la solidificazione è avvenuta, utilizzare un ago per rompere una piccola porzione di agarosio. Quando questa può essere staccata dalla goccia, aggiungere ulteriore agarosio a basso punto di fusione per formare una cupola sopra gli embrioni inclusi, coprendo l'intero coverslip.

Mentre l'agarosio si solidifica, preparare tre millilitri di mezzo E3 blu con cinque gocce di tricaina 15 millimolare, da posizionare sugli embrioni inclusi durante l'acquisizione delle immagini. Per eseguire l'acquisizione confocale 5D di embrioni di zebrafish vivi, aprire il software di acquisizione e impostare il microscopio su un obiettivo con ingrandimento 60X e apertura numerica 1,4. Applicare l'olio di immersione sull'obiettivo e posizionare la piastra colturale nel portavetrino sul tavolino del microscopio.

Utilizzando il controller degli assi, posizionare al centro l'embrione di interesse sopra la lente dell'obiettivo e sollevare la lente fino a farla incontrare con la piastra di coltura. Versare la soluzione di E3 blu e tricaina sugli embrioni incorporati nell'agar. Successivamente, fare clic sull'icona Eye Port per visualizzare gli embrioni attraverso l'oculare.

Disattivare la selezione della porta oculare e scegliere Visualizza, Controlli di acquisizione, Area di scansione A1, per aprire lo strumento Area di scansione A1. Selezionare il canale GFP, riavviare la scansione e focalizzare una regione di interesse vicina al coprioggetto. Arrestare la scansione, selezionare i canali GFP e mCherry e impostare l'opzione di mediazione della linea su normale.

Ora, selezionare Visualizza, Controlli di acquisizione, Acquisizione ND, per aprire lo strumento di acquisizione ND A1. Iniziare la scansione. Quindi, utilizzando il controllo degli assi, posizionare gli embrioni in modo che l'area di scansione sia riempita il più possibile con il pesce zebra.

Impostare il limite superiore dello stack Z nel punto in cui le cellule sono fuori fuoco, prevedendo uno spazio aggiuntivo di tre micrometri sopra il campione, per consentire la crescita e il movimento cellulare. Successivamente, impostare il limite inferiore nel punto in cui le cellule non sono più visibili e impostare l'intervallo del passo Z a due micrometri. Per gli esperimenti qui dimostrati, regolare rispettivamente la potenza del laser di acquisizione, l'HV o il guadagno e i livelli di offset come indicato di seguito.

Dopo aver impostato i parametri, spegnere la scansione per evitare un'esposizione eccessiva al laser che potrebbe causare fototossicità e fotodegradazione del campione. Selezionare ora l'icona della media su 2 linee, che garantisce la migliore qualità dell'immagine e il tempo di scansione più rapido. Selezionare l'intervallo di tempo e la durata necessari per l'esperimento.

Per le divisioni cellulari di tipo selvatico, intervalli di due minuti per una durata di due ore sono adeguati per determinare la durata della mitosi. Le divisioni che attivano il checkpoint dell'assemblaggio del fuso per più di trenta minuti sono più adatte a intervalli di quattro-cinque minuti per quattro ore, al fine di preservare la fluorescenza, come dimostrato qui. Per salvare automaticamente il file durante l'acquisizione, selezionare la casella Salva su file e assegnare un nome al file.

Infine, verificare nuovamente che tutti i parametri siano impostati correttamente e fare clic su Esegui ora. Al termine dell'acquisizione, per visualizzare il file in formato tridimensionale, fare clic sull'icona Soglia del volume. Questa figura dimostra la capacità di osservare numerose divisioni cellulari utilizzando un ampio campo visivo della coda di un pesce zebra di tipo selvaggio AB.

Le divisioni cellulari sono indicate da asterischi. Il filmato corrispondente è mostrato qui. In media, sono state osservate 50 cellule in divisione in AB e 30 cellule in divisione nel mutante aurora B.

Per tenere conto del numero ridotto di cellule in mitosi acquisite nell'embrione mutante per aurora B, è stato calcolato il rapporto tra il numero di cellule in mitosi e il numero totale di cellule acquisite, suggerendo che non vi è un numero inferiore di cellule che entrano in mitosi negli embrioni mutanti per aurora B, bensì un numero minore di cellule totali acquisite. Per quantificare la durata della mitosi, il numero di intervalli temporali corrispondenti a una divisione cellulare viene moltiplicato per l'intervallo di tempo tra ciascuno Z-stack. Come mostrato in questo grafico, il tempo medio di divisione nel tipo selvatico AB è di 25 minuti, contro i 58 minuti del mutante aurora B.

Come osservato negli embrioni di tipo selvatico, ciascuna fase mitotica può essere distinta. Tuttavia, negli embrioni mutanti per aurora B si osservano difetti mitotici, tra cui arresto mitotico e citocinesi fallita, che portano alla formazione di una cellula binucleata e alla successiva generazione di micronuclei, fenomeni che supportano il tempo di divisione aumentato misurato in questo mutante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora, dalla selezione degli embrioni all'impostazione dei parametri del microscopio confocale.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante tenere presente il contesto dell'esperimento in corso, in relazione alla regione di interesse, alla durata temporale, all'intervallo temporale e alla profondità Z. Questo aiuterà a massimizzare l'efficienza e a prevenire il fotoblecamento e la fototossicità. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la preparazione di strisci cromosomici, per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla causa dei difetti mitotici osservati, oppure si può utilizzare un trattamento farmacologico per determinare gli effetti sul progresso mitotico, sulla durata o sul destino cellulare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia per esplorare la mitosi nel contesto della biologia dello sviluppo e della biologia del cancro utilizzando il pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare embrioni di pesce zebra, acquisire immagini in tempo reale della mitosi e analizzarne la frequenza, la durata e il destino cellulare. Non dimenticare che lavorare con laser ad alta potenza e luce fluorescente può essere dannoso per gli occhi, e precauzioni, come evitare il contatto diretto degli occhi con i laser, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.