Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare la fedeltà della segregazione cromosomica durante la mitosi in un embrione vivo di zebrafish utilizzando cromatina marcata con fluoro e proteine della membrana cellulare che verranno catturate utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della mitosi, come ad esempio in che modo i difetti mitotici provocano un difetto di sviluppo o la formazione di tumori in un organismo vertebrato vivo? Il vantaggio principale di questa tecnica è che stiamo osservando la mitosi in un organismo vertebrato vivo che consente di raccogliere dati fisiologicamente rilevanti.

Dopo aver allevato il pesce zebra adulto e aver iniettato uova con H2A. F/Z-EGFP e/o pCS2 mCherry-CAAX RNA, circa due ore prima dell'imaging, utilizzano un microscopio da dissezione fluorescente per identificare gli embrioni GFP-positivi. Trasferisci gli embrioni verde brillante che esprimono GFP in una nuova piastra di Petri da 100 x 15 millimetri con terreno blu E3

Far bollire una soluzione madre di agarosio a basso punto di fusione all'1% in blu E3. Aliquotare tre millilitri di agarosio fuso in una provetta di coltura di 17 x 100 millimetri. Mantieni l'agarosio caldo mettendo la provetta di coltura in un bagnomaria a 42 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Raccogli tricaina da 15 millimolari, embrioni sottoposti a screening, agarosio a basso punto di fusione, blu E3 e una piastra di coltura con fondo coprioggetto in vetro da 35 millimetri e un microscopio ottico da dissezione. Successivamente, con una pinzetta numero cinque, rimuovere con cura i corioni da tre embrioni e posizionare gli embrioni in un contenitore separato per essere anestetizzati. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce di tricaina da 15 millimolari nel piatto contenente gli embrioni e cinque millilitri di terreno.

Aggiungere tre o quattro gocce di soluzione di tricaina da 15 millimolari al tubo di agarosio fuso all'1%. Quando gli embrioni sono sufficientemente anestetizzati, utilizzando un Pipetman P200, con un centimetro della punta della pipetta tagliato, trasferire gli embrioni anestetizzati nel piatto con fondo coprioggetti. Rimuovere l'eccesso di soluzione di tricaina blu E3.

Aggiungere lentamente da cinque a 10 microlitri di soluzione di agarosio-tricaina a basso punto di fusione sugli embrioni, mantenendo ogni goccia separata, per garantire che gli embrioni non si avvicinino l'uno all'altro. Quindi, utilizzando un ago da uno e mezzo calibro 21, orientare delicatamente gli embrioni nell'agarosio nella posizione desiderata, orientando la regione di interesse il più vicino possibile al vetrino coprioggetti se si utilizza un microscopio invertito. A causa dello spostamento che può verificarsi, potrebbe essere necessario tornare a ciascun embrione per assicurarsi che rimangano nella posizione richiesta.

Potrebbe essere necessario farlo più volte, fino a quando non si raggiunge la posizione ideale quando l'agar si solidifica. Dopo qualche minuto, per verificare se è solidificato, utilizzare un ago per rompere un pezzetto di agarosio. Quando può essere staccato dalla goccia, utilizzare ulteriore agarosio a basso punto di fusione per formare una cupola sopra gli embrioni incorporati, coprendo l'intero vetrino coprioggetti.

Mentre l'agarosio si solidifica, preparare tre millilitri di terreno blu E3 con cinque gocce di tricaina da 15 millimolari, da posizionare sugli embrioni incorporati durante l'imaging. Per eseguire l'imaging confocale 5D di embrioni di zebrafish vivi, aprire il software di imaging e impostare il microscopio su una lente con apertura numerica 60X e 1,4. Applicare l'olio da immersione sulla lente e posizionare il piatto di coltura nel supporto per vetrini sul tavolino del microscopio.

Utilizzando il controller dell'asse, centrare l'embrione di interesse sopra la lente dell'obiettivo e sollevare la lente per incontrare il piatto di coltura. Versare la soluzione di blu E3 e tricaina sugli embrioni inclusi nell'agar. Quindi, fai clic sull'icona Eye Port per visualizzare gli embrioni attraverso l'oculare.

Disabilita la selezione Eye Port e scegli Visualizza, Controlli di acquisizione, Area di scansione A1 per aprire lo strumento Area di scansione A1. Selezionare il canale GFP, riavviare la scansione e concentrarsi su una regione di interesse vicina al vetrino coprioggetti. Interrompere la scansione, selezionare i canali GFP e mCherry e impostare l'opzione di media delle linee su normale.

A questo punto, scegliere Visualizza, Controlli acquisizione, Acquisizione ND per aprire lo strumento di acquisizione ND A1. Iniziare la scansione. Quindi, utilizzando il controller dell'asse, posizionare gli embrioni in modo che l'area di scansione sia riempita con la maggior parte possibile del pesce zebra.

Impostare il limite superiore Z-stack nel punto in cui le cellule sono fuori fuoco, consentendo tre micrometri in più di spazio sopra il campione, per la crescita e il movimento cellulare. Quindi, impostare il limite inferiore in cui le celle non sono più visibili e impostare la dimensione del passo dell'intervallo Z su due micrometri. Per gli esperimenti qui dimostrati, regolare rispettivamente la potenza del laser di imaging, l'HV o il guadagno e i livelli di offset, come elencato di seguito.

Una volta impostati i parametri, spegnere la scansione per evitare un'esposizione laser non necessaria che potrebbe causare fototossicità e fotosbiancamento del campione. Ora, seleziona l'icona della media della linea 2X, che offre la migliore qualità dell'immagine e il tempo di scansione più veloce. Seleziona l'intervallo di tempo appropriato e la durata necessaria per l'esperimento.

Per le divisioni cellulari wild-type, intervalli di tempo di due minuti per una durata di due ore sono adeguati per determinare la durata mitotica. Le divisioni che attivano il punto di controllo dell'assemblaggio del mandrino per più di trenta minuti sono più adatte a intervalli di quattro-cinque minuti per quattro ore, al fine di preservare la farina, come dimostrato qui. Per salvare automaticamente il file durante l'acquisizione, selezionare la casella Salva su file e assegnare un nome al file.

Infine, ricontrolla che tutti i parametri siano impostati correttamente e premi Esegui ora. Al termine dell'acquisizione, per visualizzare il file in formato tridimensionale, fare clic sull'icona Soglia volume. Questa figura dimostra la capacità di osservare molte divisioni cellulari utilizzando un ampio campo visivo di una coda di pesce zebra AB wild-type.

Le divisioni cellulari sono indicate da asterischi. Qui viene mostrato il filmato corrispondente. In media, sono state osservate 50 cellule in divisione in AB e 30 cellule in divisione nel mutante dell'aurora B.

Per tenere conto del ridotto numero di cellule mitotiche visualizzate nell'embrione mutante dell'aurora B, è stato calcolato il rapporto tra le cellule mitotiche e il numero di cellule visualizzate, suggerendo che non c'è un numero inferiore di cellule che attraversano la mitosi negli embrioni mutanti dell'aurora B, ma, piuttosto, un numero inferiore di cellule totali che vengono visualizzate. Per quantificare la durata mitotica, il numero di intervalli di tempo che occupano una divisione cellulare viene moltiplicato per l'intervallo di tempo tra ogni Z-stack. Come rivelato in questo grafico, il tempo medio di divisione AB wild-type è di 25 minuti e 58 minuti per il mutante aurora B.

Come si vede negli embrioni wild-type, ogni fase mitotica può essere distinta. Tuttavia, nell'embrione mutante dell'aurora B si osservano difetti mitotici, che includono l'arresto mitotico e la citochinesi archiviata, con conseguente cellula binucleata, e la successiva formazione di micronuclei, che supportano l'aumento del tempo di divisione misurato in questo mutante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora, dallo screening degli embrioni all'impostazione dei parametri del microscopio confocale.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare il contesto dell'esperimento in questione, in quanto riguarda l'area di interesse, la durata, l'intervallo di tempo e la profondità Z. Ciò contribuirà a massimizzare l'efficienza, oltre a prevenire il fotosbiancamento e la fototossicità. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la diffusione dei cromosomi, per rispondere a ulteriori domande sulla causa dei difetti mitotici osservati o sull'uso di un trattamento farmacologico per determinare gli effetti sulla progressione mitotica, sulla durata o sul destino cellulare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia per esplorare la mitosi nel contesto della biologia dello sviluppo e del cancro utilizzando il pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare embrioni di zebrafish, acquisire immagini dal vivo della mitosi e analizzare la frequenza, la durata e il destino cellulare mitotico. Non dimenticare che lavorare con laser ad alta potenza e luce fluorescente può essere dannoso per gli occhi e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come evitare il contatto visivo diretto con i laser.