Name: Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Scopri come visualizzare la mitosi in embrioni vivi di Danio rerio utilizzando proteine fluorescenti e microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo permette di monitorare la segregazione cromosomica e studiare difetti mitotici correlati a tumori e disordini dello sviluppo.

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Ringraziamo Kristen Kwan per i vettori pCS2-H2A.F/Z-EGFP e pCS2-mCherry-CAAX. Ringraziamo Chris Rodesch per averci insegnato l'imaging dal vivo nel pesce zebra. Ringraziamo Shawn Williams, Erik Malarkey e Brad Yoder per l'assistenza nell'imaging confocale presso UAB e l'High Resolution Imaging Facility presso UAB. La struttura di imaging ad alta risoluzione è supportata dall'UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) e dal Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. è supportato dal National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105) e da sovvenzioni pilota dell'American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) e dell'UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. è supportato dal Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. in vitro Trascrizione <ol><li> Linearizzare pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / o vettori pCS2-mCherry-CAAX per restrizione NotI enzima digerire 31. L&#39;utilizzo di un RNA nel kit di trascrizione in vitro, generare 5 &#39;prodotti mRNA ricoperti da ogni modello, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Purificare i mRNA innevate con un kit di purificazione. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire con RNasi-free H 2 O. </li><li> Determinare la concentrazione di RNA mediante assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. (OD 260 x diluizione x 40 mcg / ml). </li><li> Diluire l&#39;RNA a 100 ng / mL per ogni H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX con RNase-free 2 O. Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, la fluorescenza sarà diminuita o assente. campioni Brighter diminuirà le preoccupazioni sulla fototossicità e photobleaching. D&#39;altra parte, troppo RNA può essere tossico e / o causare effetti off bersaglio. Nota: Conservare il rimanentemRNA purificato in -80 ° C freezer. </li></ol> 2. Allevamento Zebrafish, Embrione Collection, e mRNA iniezione 36-38 <ol><li> Assemblare vasche di allevamento con una barriera per separare il serbatoio in due regioni e riempire ciascun serbatoio di allevamento con l&#39;acqua sistema di acquacoltura utilizzato nella struttura zebrafish. </li><li> Per evitare l&#39;allevamento prematura, posizionare due pesci maschio su un lato della barriera e due pesci femmina dall&#39;altro lato la notte prima di allevamento. </li><li> Il giorno successivo, scongelare la miscela mRNA precedentemente preparato sul ghiaccio. Sostituire l&#39;acqua in vasche di allevamento con acqua sistema di acquacoltura fresca e rimuovere le barriere. Subito dopo le barriere sono tirati, riscaldare uno stampo ad iniezione di 28,5 ° C e impostare l&#39;apparecchiatura per la microiniezione. Nota: Per informazioni su stampi ad iniezione, si rimanda al Gerlach 36. </li><li> Raccogliere uova ogni 10 - 15 minuti utilizzando un colino da tè e sciacquare le uova in un ambiente pulito 100 x 15 mm piastra di Petri con E3 Blu (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4, 10 -5% blu di metilene). E3 blu è usato per prevenire la crescita di funghi e garantire il corretto sviluppo delle larve. Per maggiori informazioni su l&#39;accoppiamento e la raccolta degli embrioni, fare riferimento a Gerlach 36 e 37 Porazinkski. </li><li> Incorporare una cella scena embrioni in uno stampo ad iniezione riscaldato ed iniettare l&#39;RNA nel tuorlo nella quantità desiderata di embrioni (Figura 1A). Conto per naturale morte embrionale ed embrioni non fecondate eseguendo iniezioni embrionali, il 15% in più rispetto embrioni necessario per l&#39;esperimento. Per ulteriori dettagli su microiniezione di embrioni di zebrafish, si prega di fare riferimento a Gerlach 36 e 37 Porazinkski. NOTA: Per il primo utilizzo di mRNA, eseguire un&#39;analisi dose di curva per determinare la dose ottimale per la fluorescenza e la vitalità (definita come assenza di difetti di sviluppo lordi fino a 5 dpf) prima di eseguire l&#39;imaging 5D. 150 - 200 ng / mliniettate in embrioni è spesso la concentrazione ottimale, quindi è un buon punto di partenza per la concentrazione finale. </li><li> estrarre delicatamente gli embrioni iniettati dallo stampo utilizzando una versione modificata del &quot;vetro pipetta Pasteur 9. Per modificare la pipetta, sciogliere il finale utilizzando un becco Bunsen fino a formare una palla. </li><li> Mettere embrioni iniettati in un 100 x 15 mm piastra di Petri in E3 blu e la casa in un incubatore a 28.5 °. </li><li> Sei ore dopo l&#39;iniezione, rimuovere eventuali embrione è morto o non fecondate dai piatti e aggiungere pulita E3 blu. Casa gli embrioni a 28,5 ° C. </li></ol> 3. Preparazione e Embedding a Live embrioni di zebrafish per Imaging (Figura 1B) <ol><li> Due ore prima di imaging, lo screening degli embrioni iniettati per GFP utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza. Luogo luminoso embrioni che esprimono GFP-verdi in una nuova mm piatto 100 x 15 Petri con E3 blu. </li><li> Far bollire una soluzione stock di 1% a basso agarosio fusione con l&#39;aggiunta di 1 g di basso punto di fusione agarosio a 100 ml di E3 Blu. Dopo aver utilizzato il agarosio, coprire il pallone con un foglio di alluminio. La soluzione madre può essere utile per un massimo di un mese. </li><li> Aliquotare 3 ml di agar fuso in una provetta 17 x 100 mm. Mantenere la calda agarosio collocando la provetta in un bagno d&#39;acqua a 42 ° C fino al momento dell&#39;uso. Preparare una soluzione di 15 mm Tricaine in acqua deionizzata per anestetizzare gli embrioni di zebrafish 36. NOTA: Se l&#39;imaging in punti temporali precedenti è desiderato, la concentrazione di agar può essere diminuita a partire da 0,3% 39. </li><li> Portare il 15 MM Tricaine, gli embrioni a screening, bassa agarosio fusione, E3 Blu, e da 35 mm di vetro coprioggetto cultura fondo piatto per un microscopio ottico dissezione. Rimuovere con attenzione corion dell&#39;embrione con # 5 pinzette. Fare questo per tre embrioni. </li><li> Mettere gli embrioni dechorionated in un contenitore separato per essere anestetizzati. Il coperchio del piatto coprioggetto fondo viene spesso utilizzato per questo scopo. Usando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce (circa 150 ml)15 mM Tricaine al piatto 5 ml E3 blu (se utilizzando il coperchio del piatto inferiore coprioggetto) o fino embrioni sono stati sufficientemente anestetizzato. Inoltre, aggiungere 3-4 gocce (circa 150 - 200 microlitri) di 15 mM soluzione Tricaine al tubo agarosio fuso 1%. </li><li> Usando una pipetta P200 con 1 cm dalla punta della pipetta tagliare; trasferire gli embrioni anestetizzati al piatto coprioggetto fondo. Rimuovere qualsiasi eccesso E3 Blu: soluzione Tricaine. </li><li> Aggiungere lentamente 5 - 10 ml di agarosio a bassa fusione: soluzione Tricaine negli embrioni, mantenendo ogni goccia separato per garantire gli embrioni non accidentalmente deriva vicini l&#39;uno all&#39;altro. Attenzione: se l&#39;agarosio è troppo caldo, si danneggia l&#39;embrione. Una buona temperatura per mantenere l&#39;agar a è 42 ° C. </li><li> Utilizzando un 21 ago G 1 ½, orientare delicatamente l&#39;embrione nel agarosio nella posizione desiderata. Quando si utilizza un microscopio invertito per l&#39;imaging time-lapse, orientare la regione di interesse (ROI) più vicino possibile al vetrino come possibLe. Nota: Per scopi generali, la regione coda offre la facilità di orientamento e chiarezza a causa della relativamente sottile di tessuto (Figura 1A). Altri tessuti, come lo strato epiteliale che circonda le pieghe tuorlo e pinne, possono essere usati 28,29. Questi tessuti offrono grande chiarezza, tuttavia queste regioni sono spessi solo pochi strati di cellule. Ai fini di questo protocollo, è vantaggioso per un&#39;immagine regione coda di acquisire quante divisioni cellulari possibili. </li><li> Attendere qualche minuto per la solidificazione parziale del agar. Utilizzare l&#39;ago di spezzare un piccolo pezzo di agar per testare la sua solidificazione. Quando un pezzo di agar può essere tirato dalla goccia, procedere al passo successivo. </li><li> Coprire l&#39;intero vetrino con una bassa agar fusione formando una cupola sopra gli embrioni incorporati. Lasciare che l&#39;agar solidificare prima di spostare il piatto per l&#39;imaging confocale (Figura 1A). </li><li> Durante il processo di solidificazione agar (dura circa 10 minuti), preparare da 3 ml osoluzione f E3 blu con cinque gocce di (circa 250 ml) 15 mm Tricaine per essere posizionato sopra gli embrioni incorporati durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. 5D confocale Imaging Live embrioni di zebrafish 40,41 NOTA: Vedere Ariga 40 e O&#39;Brien 41 per i dettagli su come eseguire l&#39;imaging 5D utilizzando altri sistemi confocale. Per Z-intervallo, Z-stack, Z-profondità, intervallo di tempo, e definizioni 5D si veda la Figura 1C. <ol><li> Aprire il software di imaging e impostare il microscopio a 60X NA 1.4 lente dell&#39;obiettivo. Applicare l&#39;olio di immersione alla lente dell&#39;obiettivo e posizionare il piatto cultura nel supporto diapositive sul palco microscopio. Utilizzando il controllore assi, centrare l&#39;embrione di interesse al di sopra della lente dell&#39;obiettivo e portare la lente obiettivo verso l&#39;alto per incontrare il piatto cultura. </li><li> Fare clic sull&#39;icona oculare e passare al filtro GFP sul microscopio. Focus sul ROI. Concentrandosi sul tessuto più vicino al vetrino sarà offer i migliori risultati di imaging. </li><li> Rimuovere il blocco. Selezionare i canali GFP e mCherry (lunghezze d&#39;onda pre-impostati nel software) e impostare la linea opzione normale media. </li><li> Utilizzare &quot;Controlli View / acquisizione / A1 Area di scansione&quot; comando per aprire lo strumento A1 Area di scansione. </li><li> Avviare la scansione. Utilizzando l&#39;asse-controllore, posizionare l&#39;embrione in modo che l&#39;area di scansione viene riempito con la maggior quantità di zebrafish possibile. La potenza del laser non deve essere ottimale a questo punto. Abbassare la potenza del laser al fine di evitare inutili photobleaching. </li><li> Utilizzare i &quot;Controlli View / acquisizione / acquisizione ND&quot; comando per aprire il pannello di controllo acquisizione ND. </li><li> Avviare la scansione per impostare i parametri di Z-stack. Impostare il limite superiore Z-stack per cui le cellule non sono a fuoco e limite inferiore per cui le cellule non sono più visibili. Lasciare uno spazio 3 micron sopra il campione per la crescita e il movimento delle cellule, che può espandersi nel campo di ripresa. La Z-stack per i dati riportati in questo proprotocollo copriva una Z-profondità di 40 micron di coda dell&#39;embrione. </li><li> Impostare la dimensione del passo Z-intervallo di 2 micron. In media, una cella è 10 micron di diametro; quindi 2 micron produrrà cinque intervalli di dati di imaging da analizzare per ogni cella. NOTA: La profondità dell&#39;immagine che può essere acquisito dipende dall&#39;intervallo Z. risoluzione Z è sacrificato per ottenere profondità totale nella dimensione Z al fine di immagine come molte cellule in fase di mitosi possibile (grande Z-profondità). L&#39;inverso è vero, nel senso che, diminuendo la dimensione del passo, la risoluzione Z si guadagna, mentre la profondità Z viene sacrificato (piccolo Z-profondità). </li><li> Regolare la potenza del laser immagine, HV, e offset livelli. Per gli esperimenti hanno dimostrato in questo protocollo, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli fissati ai livelli corrispondenti, rispettivamente, per il canale GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Per il canale mCherry, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli, rispettivamente; 3 - 6, 120 - 140, e -3 a-8. Una volta impostati i parametri, spegnere la scansione per evitare l&#39;esposizione al laser inutili che possono causare fototossicità e photobleaching del campione. </li><li> Selezionare l&#39;icona media linea di 2x. &quot;No media&quot; produce un&#39;immagine sgranata mentre &quot;linea 4x media&quot; aumenta drasticamente il tempo di scansione. L&#39;uso della linea di 2x media fornisce la migliore qualità di immagine e il tempo più veloce di scansione. </li><li> Selezionare l&#39;intervallo di tempo e durata, necessarie per l&#39;esperimento. Per le divisioni wild-type, intervalli di tempo di due minuti per 2 ore è meglio per la determinazione della durata mitotico (utilizzato nelle figure 1, 2, 3A e 3B). Divisioni che attivano il checkpoint del fuso per più di 30 minuti sono più adatti per cinque intervalli minuti per quattro ore al fine di preservare la fluorescenza come mostrato nella Figura 3C. </li><li> Selezionare la casella &quot;Salva su file&quot; e il nome del file per salvare automaticamente il file come si è in fase di acquisizione. Doppio controllo tutte le parametri siano impostate correttamente e ha colpito &quot;start run&quot;. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione è stata completata, per visualizzare il file in un formato tridimensionale, cliccare sull&#39;icona soglia di volume. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;uso di questo metodo permette di dedurre ripartizione nucleare envelope, formazione di una piastra di metafase da allegati microtubuli cinetocoro, e la segregazione dei cromatidi fratelli per formare due nuove cellule in vivo e in un modo dipendente dal tempo. La capacità di osservare mitosi in zebrafish è vantaggioso su campioni fissati e sistemi di coltura cellulare perché le cellule vengono ripreso nella fisiologia naturale, il tessuto è trasparente che permette proteine ​​fluorescenti da utilizzare, s...

La mitosi è un essenziale processo cellulare fondamentale per la crescita, la differenziazione e la rigenerazione in un organismo vivente. Dopo accurata preparazione e la replicazione del DNA in interfase, la cella è innescato per dividere. La prima fase della mitosi, profase, viene avviata dall&#39;attivazione della ciclina B / Cdk1. Prophase è caratterizzata dalla condensazione del materiale cromatina in cromosomi. Nucleare ripartizione busta avviene al passaggio tra profase e prometafase. In prometafase, centrosomi, il centro di nucleazione per la formazione del fuso, cominciano a migrare verso poli opposti, estendendo microtubuli in cerca di attaccamento cinetocore. Al momento di attacco, le conversioni al fine di applicare il sistema dei microtubuli e forze di tensione orientano i cromosomi che formano una piastra di metafase 1. Se tutti i cromosomi sono collegati correttamente, il punto di controllo di assemblaggio del mandrino è soddisfatto, anelli cohesin tengono i cromatidi fratelli insieme sono spaccati, e microtubuli accorciare a tirare sorellacromatidi ai poli opposti durante anaphase 2,3. La fase finale, telofase, comporta l&#39;allungamento della cella e riforma della membrana nucleare attorno ai due nuovi nuclei. Citochinesi completa il processo di divisione separando citoplasma delle due nuove cellule figlie 4-6. L&#39;alterazione delle vie principali mitosi (cioè, posto di blocco di assemblaggio del mandrino, la duplicazione dei centrosomi, sorella cromatidi coesione, ecc.) Può provocare l&#39;arresto metafase, missegregation dei cromosomi, e instabilità genomica 7-10. In ultima analisi, difetti nei percorsi di controllo mitosi possono causare disturbi dello sviluppo e il cancro, che richiede la visualizzazione della mitosi e dei suoi difetti di un live, vertebrato, organismo pluricellulare 10-16. embrioni di zebrafish servire come un grande organismo modello per l&#39;imaging dal vivo grazie al tessuto trasparente, la facilità di microiniezione e rapido sviluppo. Utilizzando zebrafish, l&#39;obiettivo generale di questo manoscritto è quello didescrivere un metodo di 5D vivo (dimensioni X, Y, Z, tempo e lunghezza d&#39;onda) di imaging di mitosi 17 (Figura 1C). L&#39;uso di zebrafish mutante difettoso in diversi percorsi mitotici dimostrare la conseguenza di tali difetti. Per questo protocollo, Aurora B ESCO2 mutanti sono stati scelti per illustrare questi difetti. Aurora B è una chinasi che fa parte del complesso cromosoma passeggeri (CPC) coinvolte nella formazione del fuso e l&#39;attaccamento microtubuli. E &#39;anche necessario per la formazione di scissione solco nel cytokinesis 18,19. In zebrafish, la carenza di Aurora B porta a difetti di induzione solco, citocinesi, e la segregazione cromosoma 20. ESCO2, d&#39;altra parte, è un acetiltransferasi che è essenziale per sorella cromatidi coesione 21,22. Si acetila cohesin sulla parte SMC3 dell&#39;anello stabilizzando così cohesin per garantire una corretta segregazione cromosomica al passaggio metafase-anafase 23. Perdita di ESCO2 in zebrafish porta a chmissegregation romosome, prematura sorella separazione cromatidi, instabilità genomica, e p53-dipendente apoptosi e indipendenti 24,25. Grazie alla disponibilità, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante (di seguito denominato aurB m / m ed ESCO2 m / m, rispettivamente) verrà utilizzato per illustrare questa tecnica 25-27. Accoppiamento microscopia confocale con macchinari cellule fluorescenti-tag ha permesso ai ricercatori di visualizzare cromatina e della membrana cellulare dinamiche durante la mitosi 25,28,29. istoni fluorescenti-tag sono stati storicamente utilizzati per la visualizzazione della cromatina. Gli istoni sono proteine ​​nucleari composti da quattro diverse coppie (H2A, H2B, H3, H4 e) che sono responsabili della struttura nucleosomi che compone i cromosomi 30. Mentre H2B è probabilmente il più usato per istone proteine ​​fluorescenti amouse e colture cellulari, l&#39;uso di istone 2A, Famiglia Z (H2A.F / Z) ha dimostrato bene per l&#39;uso in zebrafish 31,32. Concanavalina A e caseina chinasi 1-gamma per esempio, localizzare alla membrana cellulare e sono stati precedentemente dimostrato efficace nel visualizzare membrana cellulare in ricci e drosophila 33,34. Altri studi hanno dimostrato che la proteina fluorescente-tag CAAX etichette la membrana cellulare e ha avuto successo in zebrafish 31. CAAX è un motivo che è riconosciuto da enzimi di modificazione post-traduzionali quali farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modifiche di questi enzimi causano proteine ​​di diventare associata alla membrana, etichettatura così la membrana cellulare 35. A causa del precedente uso di zebrafish, questo protocollo ha scelto di utilizzare H2A.F / Z e CAAX di etichettare cromatina e la membrana cellulare. L&#39;applicazione di questo metodo permetterà al ricercatore di monitorare mitosi a livello di cella singola osservare singolo cromosomadinamiche, come monitorare e allo stesso tempo più divisioni cellulari che possono influire differenziazione dei tessuti e lo sviluppo. Questo articolo si concentrerà su l&#39;imaging le dinamiche di segregazione dei cromosomi durante la mitosi a livello singola cella. All&#39;interno di questo manoscritto, la capacità di osservare diverse divisioni mitotiche, calcolare il tempo di divisione, e decifrare i fenotipi mitotiche verrà illustrato e discusso. Utilizzando questi parametri, fisiologicamente dati rilevanti possono essere raccolti e applicati a diversi stati di malattia affetti da difetti mitotico.

<table><tbody><tr><td>Vettori pCS2</td><td>Regalo di K. Kwan</td><td></td><td>Per il plasmide di interesse</td></tr><tr><td>Enzima di restrizione NotI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>Per la restrizione digest del plasmide</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Per la trascrizione in vitro</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Per la purificazione dell'mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm piastre di Petri</td><td>Fisher</td><td>Scientific FB0875712</td><td>Per l'alloggiamento di embrioni stampo</td></tr><tr><td>per microiniezione</td><td>fatto in casa</td><td></td><td>Per contenere embrioni durante la microiniezione</td></tr><tr><td>Agarosio II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>Per l'inclusione di embrioni</td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Per l'anestetizzazione di embrioni</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolto in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolto in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolto in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolta in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Metilene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>Per l'acqua dell'embrione (E3 Blue), disciolta in UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 mm provetta di coltura</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>Per agar fuso</td></tr><tr><td>35 mm di vetro vetrino coprioggetto fondo piatto di coltura&nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>N. 0, vetro da 20 mm, per l'inclusione di embrioni</td></tr><tr><td>#5 pinzette</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>Per la dechorionizzazione di embrioni</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge</td><td>ago Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Per il posizionamento di embrioni in agar</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>Per lo screening e l'inclusione di embrioni, qualsiasi cannocchiale da dissezione andrà bene</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>Per l'imaging time-lapse</td></tr><tr><td>Software confocale</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>Per l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini</td></tr></tbody></table>

osservando divisione mitotica e dynamics in un embrione vivo zebrafish

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

La mitosi è fondamentale per la crescita e la differenziazione organismal. Il processo è altamente dinamico e richiede ordinato eventi per realizzare una corretta condensazione della cromatina, l&#39;attaccamento ai microtubuli cinetocoro, segregazione dei cromosomi, e citocinesi in un piccolo lasso di tempo. Errori nel delicato processo può portare a malattie umane, tra cui difetti di nascita e il cancro. Gli approcci tradizionali che indagano stati di malattia mitotico umani spesso si basano su sistemi di coltura cellulare, che non hanno la naturale fisiologia e contesto di sviluppo / tessuto-specifica vantaggiosa quando si studia la malattia umana. Questo protocollo supera molti ostacoli, fornendo un modo per visualizzare, ad alta risoluzione, la dinamica dei cromosomi in un sistema di vertebrati, il pesce zebra. Questo protocollo saranno i dettagli di un approccio che può essere usato per ottenere immagini dinamiche di cellule in divisione, che comprendono: la trascrizione in vitro, allevamento zebrafish / raccolta, embrione embedding, e time-lapse imaging. Ottimizzazione e modifications di questo protocollo sono anche esplorati. Utilizzando H2A.F / Z-EGFP (etichette cromatina) e mCherry-CAAX (etichette cella a membrana) embrioni mRNA-iniettato, mitosi in AB wild-type, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante viene visualizzato. Ad alta risoluzione delle immagini dal vivo in zebrafish permette di osservare più mitosi per quantificare statisticamente difetti mitotici e tempi di progressione mitotico. Inoltre, si osservano osservazione di aspetti qualitativi che definiscono i processi impropri mitosi (ad esempio, difetti congressione, missegregation di cromosomi, ecc) e gli esiti cromosomiche improprio (ad esempio, aneuploidia, poliploidia, micronuclei, etc.). Questo test può essere applicato alla osservazione di tessuti differenziazione / sviluppo ed è suscettibile all&#39;uso di zebrafish mutante e agenti farmacologici. Visualizzazione di come difetti di mitosi portare a disturbi del cancro e di sviluppo sarà notevolmentemigliorare la comprensione della patogenesi della malattia.

La figura 2 mostra la capacità di osservare molte divisioni cellulari che utilizzano un ampio panorama di un campo di tipo selvaggio coda zebrafish AB. Oltre sette cellule mitotiche vengono esposte in un arco di tempo 14 min (Film 1). Entro il corso di due ore, più di 40 eventi mitotico sono stati catturati. In media, 50 cellule in divisione sono stati osservati nel 30 AB e divisione delle cellule in AUR B m / m embrioni <str...

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la fedeltà della segregazione cromosomica durante la mitosi in un embrione di pesce zebra vivente, utilizzando cromatina marcata con fluorescenza e proteine della membrana cellulare che verranno acquisite mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della mitosi, come ad esempio in che modo i difetti mitotici portano a un difetto dello sviluppo o alla formazione di tumori in un organismo vertebrato vivente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che stiamo osservando la mitosi in un organismo vertebrato vivente, il che consente di raccogliere dati fisiologicamente rilevanti.Dopo l'accoppiamento di zebrafish adulti e l'iniezione delle uova con RNA H2A.F/Z-EGFP e/o pCS2 mCherry-CAAX, circa due ore prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per identificare gli embrioni positivi per GFP. Trasferire gli embrioni che esprimono un'intensa fluorescenza verde in una nuova capsula di Petri di 100 per 15 millimetri contenente mezzo E3 blu.Fare bollire una soluzione madre di agarosio a basso punto di fusione all'1% in E3 blu. Aliquotare tre millilitri di agarosio fuso in un tubo da coltura di 17 per 100 millimetri. Mantenere l'agarosio caldo ponendo il tubo da coltura in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius fino al momento dell'uso.Raccogliere tricaina 15 millimolare, embrioni selezionati, agarosio a basso punto di fusione, E3 blu e una piastra per colture con fondo in vetro da 35 millimetri, nonché un microscopio stereoscopico. Successivamente, con pinzette numero cinque, rimuovere con attenzione le corioni da tre embrioni e posizionare gli embrioni in un contenitore separato per l'anestesia. Poi, utilizzando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce di tricaina 15 millimolare nella piastra contenente gli embrioni e cinque millilitri di mezzo.Aggiungere tre o quattro gocce di soluzione di tricaina 15 millimolare al tubo contenente agarosio fuso all'1%. Quando gli embrioni sono sufficientemente anestetizzati, utilizzando un Pipetman P200 con un centimetro della punta del pipettatore tagliato, trasferire gli embrioni anestetizzati nella piastra con fondo in coprivetrino. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione di tricaina E3 blu.Aggiungere lentamente da cinque a dieci microlitri di soluzione di tricaina in agarosio a basso punto di fusione sugli embrioni, mantenendo ogni goccia separata, per assicurare che gli embrioni non si avvicinino tra loro. Quindi, utilizzando un ago da un'ora e mezza del calibro 21, orientare delicatamente gli embrioni nell'agarosio nella posizione desiderata, posizionando la regione di interesse il più vicino possibile alla lamella se si utilizza un microscopio invertito. A causa degli spostamenti che potrebbero verificarsi, potrebbe essere necessario tornare su ciascun embrione per assicurarsi che rimanga nella posizione richiesta.Questa operazione potrebbe dover essere ripetuta più volte finché non si raggiunge la posizione ideale durante la solidificazione dell'agar. Dopo alcuni minuti, per verificare se la solidificazione è avvenuta, utilizzare un ago per rompere una piccola porzione di agarosio. Quando questa può essere staccata dalla goccia, aggiungere ulteriore agarosio a basso punto di fusione per formare una cupola sopra gli embrioni inclusi, coprendo l'intero coverslip.Mentre l'agarosio si solidifica, preparare tre millilitri di mezzo E3 blu con cinque gocce di tricaina 15 millimolare, da posizionare sugli embrioni inclusi durante l'acquisizione delle immagini. Per eseguire l'acquisizione confocale 5D di embrioni di zebrafish vivi, aprire il software di acquisizione e impostare il microscopio su un obiettivo con ingrandimento 60X e apertura numerica 1,4. Applicare l'olio di immersione sull'obiettivo e posizionare la piastra colturale nel portavetrino sul tavolino del microscopio.Utilizzando il controller degli assi, posizionare al centro l'embrione di interesse sopra la lente dell'obiettivo e sollevare la lente fino a farla incontrare con la piastra di coltura. Versare la soluzione di E3 blu e tricaina sugli embrioni incorporati nell'agar. Successivamente, fare clic sull'icona Eye Port per visualizzare gli embrioni attraverso l'oculare.Disattivare la selezione della porta oculare e scegliere Visualizza, Controlli di acquisizione, Area di scansione A1, per aprire lo strumento Area di scansione A1. Selezionare il canale GFP, riavviare la scansione e focalizzare una regione di interesse vicina al coprioggetto. Arrestare la scansione, selezionare i canali GFP e mCherry e impostare l'opzione di mediazione della linea su normale.Ora, selezionare Visualizza, Controlli di acquisizione, Acquisizione ND, per aprire lo strumento di acquisizione ND A1. Iniziare la scansione. Quindi, utilizzando il controllo degli assi, posizionare gli embrioni in modo che l'area di scansione sia riempita il più possibile con il pesce zebra.Impostare il limite superiore dello stack Z nel punto in cui le cellule sono fuori fuoco, prevedendo uno spazio aggiuntivo di tre micrometri sopra il campione, per consentire la crescita e il movimento cellulare. Successivamente, impostare il limite inferiore nel punto in cui le cellule non sono più visibili e impostare l'intervallo del passo Z a due micrometri. Per gli esperimenti qui dimostrati, regolare rispettivamente la potenza del laser di acquisizione, l'HV o il guadagno e i livelli di offset come indicato di seguito.Dopo aver impostato i parametri, spegnere la scansione per evitare un'esposizione eccessiva al laser che potrebbe causare fototossicità e fotodegradazione del campione. Selezionare ora l'icona della media su 2 linee, che garantisce la migliore qualità dell'immagine e il tempo di scansione più rapido. Selezionare l'intervallo di tempo e la durata necessari per l'esperimento.Per le divisioni cellulari di tipo selvatico, intervalli di due minuti per una durata di due ore sono adeguati per determinare la durata della mitosi. Le divisioni che attivano il checkpoint dell'assemblaggio del fuso per più di trenta minuti sono più adatte a intervalli di quattro-cinque minuti per quattro ore, al fine di preservare la fluorescenza, come dimostrato qui. Per salvare automaticamente il file durante l'acquisizione, selezionare la casella Salva su file e assegnare un nome al file.Infine, verificare nuovamente che tutti i parametri siano impostati correttamente e fare clic su Esegui ora. Al termine dell'acquisizione, per visualizzare il file in formato tridimensionale, fare clic sull'icona Soglia del volume. Questa figura dimostra la capacità di osservare numerose divisioni cellulari utilizzando un ampio campo visivo della coda di un pesce zebra di tipo selvaggio AB.Le divisioni cellulari sono indicate da asterischi. Il filmato corrispondente è mostrato qui. In media, sono state osservate 50 cellule in divisione in AB e 30 cellule in divisione nel mutante aurora B.Per tenere conto del numero ridotto di cellule in mitosi acquisite nell'embrione mutante per aurora B, è stato calcolato il rapporto tra il numero di cellule in mitosi e il numero totale di cellule acquisite, suggerendo che non vi è un numero inferiore di cellule che entrano in mitosi negli embrioni mutanti per aurora B, bensì un numero minore di cellule totali acquisite. Per quantificare la durata della mitosi, il numero di intervalli temporali corrispondenti a una divisione cellulare viene moltiplicato per l'intervallo di tempo tra ciascuno Z-stack. Come mostrato in questo grafico, il tempo medio di divisione nel tipo selvatico AB è di 25 minuti, contro i 58 minuti del mutante aurora B.Come osservato negli embrioni di tipo selvatico, ciascuna fase mitotica può essere distinta. Tuttavia, negli embrioni mutanti per aurora B si osservano difetti mitotici, tra cui arresto mitotico e citocinesi fallita, che portano alla formazione di una cellula binucleata e alla successiva generazione di micronuclei, fenomeni che supportano il tempo di divisione aumentato misurato in questo mutante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora, dalla selezione degli embrioni all'impostazione dei parametri del microscopio confocale.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante tenere presente il contesto dell'esperimento in corso, in relazione alla regione di interesse, alla durata temporale, all'intervallo temporale e alla profondità Z. Questo aiuterà a massimizzare l'efficienza e a prevenire il fotoblecamento e la fototossicità. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la preparazione di strisci cromosomici, per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla causa dei difetti mitotici osservati, oppure si può utilizzare un trattamento farmacologico per determinare gli effetti sul progresso mitotico, sulla durata o sul destino cellulare.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia per esplorare la mitosi nel contesto della biologia dello sviluppo e della biologia del cancro utilizzando il pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare embrioni di pesce zebra, acquisire immagini in tempo reale della mitosi e analizzarne la frequenza, la durata e il destino cellulare. Non dimenticare che lavorare con laser ad alta potenza e luce fluorescente può essere dannoso per gli occhi, e precauzioni, come evitare il contatto diretto degli occhi con i laser, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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