Name: Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza In Situ Ibridazione (FISH) con sonde PNA in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri la tecnica FISH concisa per analizzare il numero e la lunghezza dei telomeri in Caenorhabditis elegans. Questo metodo permette di visualizzare e quantificare le sequenze ripetitive in meno di 24 ore.

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I ceppi di vermi mutanti sono stati gentilmente forniti dal Caenorhabditis Genetics Center. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI14C1277).

1. Sonde Etichettatura con digossigenina-dUTP mediante PCR <ol><li> Eseguire etichettatura PCR con 10x dNTP mix contenente digossigenina-dUTP come descritto in precedenza 13. </li><li> Purificare prodotto di PCR con la purificazione spin-colonna secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Se la sonda è più breve di 200 bp, rimuovere libera digossigenina-dUTP con cromatografia spin-colonna dalla miscela di reazione piuttosto che depurazione spin-colonna. </li></ol></li></ol> 2. Preparare diapositive polilisina rivestiti Nota: L&#39;intera procedura richiede circa 2 ore. La maggior parte dei passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente tranne per la fase di essiccazione. <ol><li> Pulizia delle diapositive <ol><li> Porre i vetrini in un contenitore di plastica e lavare rapidamente i vetrini con acqua distillata (DW). Rimuovere l&#39;acqua e riempire il contenitore con DW contenente detergente per vetri 1%. </li><li> Agitare i vetrini per 15 min a 50 rpm a temperatura ambiente (RT). Lavare le diapositive con DW 3volte per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini con il 70% di etanolo per 15 minuti con agitazione. Scartare 70% di etanolo e posizionare i vetrini su un blocco secca 65 ° C e asciugare per 15 min. </li></ol></li><li> Rivestimento polilisina di diapositive di vetro multi-well Nota: il rivestimento polilisina di vetro scorrevole è un passo importante, in quanto fornisce l&#39;adesione del campione durante la procedura di colorazione. Scarsamente scorrevole rivestito comporterà la perdita di campione. <ol><li> Diluire la soluzione polilisina magazzino al 0,01% (w / v) in acqua distillata. Aggiungere 20 ml di diluito 0,01% (w / v) polilisina ai pozzetti di un vetrino pulito. </li><li> Incubare il vetrino per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Porre i vetrini su un blocco di 65 ° C asciutto e asciugare per 1 ora. </li><li> Conservare le diapositive polilisina nella scatola senza polvere. </li></ol></li></ol> 3. Fissazione di Worms sul vetrino (figura 1) <ol><li> embrioni Preparazione per FISH Nota: i vermi Harvest prima di tutto tegli cibo batterica è consumato guardando i mezzi di crescita sotto il microscopio. La fame riduce la produzione di uova di vermi adulti e aumenta la schiusa delle uova. Metodi dettagliati sono descritti in 14,15. <ol><li> Crescere i vermi in 50 millimetri Petri-piatto secondo i metodi standard di 14. </li><li> Dopo tutto il cibo batterica è consumato, tagliare il supporto agar nel quartiere con la spatola. Sterilizzare la spatola prima del taglio per evitare contaminazioni. </li><li> Mettere tutto il pezzo di agar sul (NGM) piatto 100 millimetri terreni di crescita nematode. Girare il pezzo agar a testa in giù per i vermi per raggiungere il cibo batterica fresca. </li><li> Dopo 48-72 ore, raccogliere i vermi con tampone M9. Aggiungere 3 - 5 ml di tampone M9 sulla piastra NGM. Pipetta M9 tampone sulla superficie della NGM per lavare i vermi. </li><li> Raccogliere il liquido con i vermi e aggiungere in una provetta da 15 ml. Nota: Se c&#39;è detriti agar dopo il raccolto, centrifuga i vermi in una soluzione di saccarosio al 30%. Mentre i detriti sono pellettato, vermi galleggiano sula superficie. </li><li> Aggiungere tampone M9 per compensare il volume a 15 ml. Pellet i vermi mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min e rimuovere la maggior parte del buffer M9. Ripetere questa operazione altre 2 volte. Nota: se i vermi sono ancora a galla dopo la centrifugazione, impostare il livello del freno della centrifuga al Valore = 1. </li><li> Aspirare tampone M9. Aggiungere la soluzione sbiancante per i vermi. Per 0,5 ml di vermi, aggiungere 6,5 ml di DW, 2 ml di ipoclorito, 1 ml di 5 M KOH. </li><li> Incubare i vermi con dondolo a temperatura ambiente per 3 minuti a 50 giri al minuto. vermi Vortex per 15 secondi per tosare meccanicamente i vermi ed esporre le uova. </li><li> Osservare il tubo sotto un microscopio di dissezione durante il candeggio. Assicurarsi che i vermi sono tagliati a metà e le uova vengono rilasciati. Quando la maggior parte del corpo adulto è sciolto, aggiungere tampone M9 per compensare il volume a 15 ml. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare la maggior parte della M9 e aggiungere tampone M9 fresco per compensare il volume a 15 ml. fase di lavaggio ripetere 3 volte. Nota:Evitare di utilizzare quantità eccessiva di vermi, in quanto ostacolano il processo di sbiancamento. Mantenere il tempo di reazione complessivo inferiore a 8 minuti fino a quando il lavaggio. Over-sbiancato uova producono forti autofluorescenza. </li><li> Aggiungere tampone fosfato con polisorbato-20 (PBST) fino a 200 ml e 200 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per rendere il 2% PFA. Attenzione: Dal momento che PFA è cancerogeno, indossare indumenti protettivi, guanti e protezione per gli occhi prima di utilizzare PFA. </li><li> Aggiungere 40 ml di uova a 2% PFA sul pozzo di rivestito polilisina diapositiva. </li><li> Porre i vetrini in una camera umida e incubare per 15 minuti a RT. Chiudere la camera umida subito dopo le diapositive sono collocati all&#39;interno. Nota: Le uova si depositano sul fondo della slitta pur essendo fisso. </li></ol></li><li> Preparazione gonadi sezionati per i pesci <ol><li> vermi Harvest adulti coltivati ​​sul 50 mm Piastra NGM pipettando 1 ml di tampone M9. vermi Harvest prima di alimentare batterica è esaurito. </li><li> Lavare i vermi da qualsiasi batteri ingegnoh tampone M9, 2 volte. Nota: i batteri residui possono interferire con le gonadi sezionati si attacchino alle diapositive rivestito polilisina. </li><li> Pellet i vermi per centrifugazione a 300 x g. Rimuovere M9 e trasferire i vermi alla piastra NGM vuota micropipetta. </li><li> Aggiungere 30 ml di tampone M9 contenente 2 mM levamisolo su un pozzo di polilisina trattata diapositiva. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone M9 ad una provetta 1 ml. Utilizzare questo buffer per trasferire i vermi per bocca pipetta. </li><li> Riempire la punta della pipetta bocca con tampone M9 mettendo un capillare nel tubo 1 ml contenente il tampone M9. </li><li> Sotto il microscopio dissezione, inserire la punta della pipetta bocca di fronte alla testa di adulto verme e trascinare bocca pipetta in modo che la testa di vermi entra pipetta bocca. Una volta che la testa di vermi entra la punta, l&#39;intero corpo di verme sarà disegnato nella punta. </li><li> Trasferire i vermi alla diapositiva rivestito polilisina usando la bocca pipetta. </li><li> Usando un rasoio, taglio dif la testa o la punta della coda di vermi sul vetrino. Quando il worm viene tagliato, le gonadi uscirà fuori. Gonadi si attaccano alle diapositive. <ol><li> Preparare almeno 30 vermi in un pozzetto. Più pozzetti possono essere utilizzati per altri 30 vermi. </li></ol></li><li> Mettere il vetrino nella camera umida e aspirare via il buffer M9 con la bocca pipetta. </li><li> Fissare il campione aggiungendo 20 ml di 2% PFA a temperatura ambiente per 15 minuti in camera umida. </li></ol></li></ol> 4. Fissazione e permeabilizzazione <ol><li> Posizionare un blocco di alluminio in ghiaccio secco e riporla in un congelatore (-80 ° C). Conservare metanolo e acetone -20 ° C. </li><li> Dopo la fissazione PFA passo 3.1.15 o 3.2.11, rimuovere fissativo utilizzando micropipetta lasciando ~ 5 ml di fissativo. </li><li> Mettere un altro vetrino rivestito polilisina sulla diapositiva campione. Rimuovere il fissativo con tovagliolo di carta se la soluzione è eccessiva. Non spostare le diapositive una volta che sono attaccati insieme. </li><li> Congelare le diapositivesul blocco di alluminio per almeno 15 min. Nota: I campioni possono essere conservati per almeno 2 - 3 giorni. </li><li> Mentre le diapositive vengono congelati, mettere i vasi contenenti metanolo freddo e acetone su ghiaccio. </li><li> Prendere le diapositive fuori e torcere loro di congelare-crack del campione. Eliminare la slitta superiore. immergere immediatamente il vetrino in metanolo ghiacciato per 5 min. </li><li> Trasferire i vetrini in acetone ghiacciata per 5 min. </li><li> Lavare i vetrini 3 volte con PBST per 5 minuti per rimuovere fissativo residuo. Procedere alla fase successiva o conservare le diapositive in 100% di etanolo a 4 ° C. Nota: I campioni possono essere conservati per almeno 2 - 3 giorni. </li></ol> 5. L&#39;ibridazione di cellule fissate <ol><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di RNasi (PBST contenente 10 ug / ml RNasi A). Incubare il vetrino nella camera umida a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare il vetrino due volte in soluzione salina 2x e citrato di sodio polisorbato-20 (2x SSCT) per 15 minuti ciascuno. </li><li> Aggiungere 20ml di soluzione di ibridazione e di mettere la camera umida nel 37 ° C incubatore. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione di ibridazione pipettando. </li><li> Prima di rimuovere soluzione di ibridazione, di preparare la sonda. Se la sonda è DNA a doppia elica, denaturare le sonde mediante riscaldamento a 95 ° C per 5 min su un blocco secca. Dopo il riscaldamento, raffreddare la sonda brevemente ghiaccio. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di ibridazione contenente sonde al campione. Per sonda PNA, concentrazione uso con un rapporto di 1: 2.000 e per sonda dig-marcato, la concentrazione uso con un rapporto di 1: 200. Coprire il campione con vetro di copertura. </li><li> Mettere un tovagliolo di carta imbevuto di acqua sul blocco di calore (80 ° C). Mettere un coperchio di plastica sul blocco di calore per preservare l&#39;umidità e la temperatura. </li><li> Dopo che la temperatura del blocco termico è stabilizzata (a 80 ° C), collocare il vetrino campione sul tovagliolo di carta riscaldato e coprire con il coperchio di plastica. Denaturare il campione per 3 min. </li><li> IncUbate i vetrini in camera umida notte a 37 ° C. </li></ol> 6. Lava ed immunofluorescenza <ol><li> Riscaldare la soluzione di lavaggio di ibridazione (2x SSC, il 50% formammide) a 37 ° C. </li><li> Lavare il campione in PBST due volte a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere il vetro di copertura. </li><li> Lavare il campione in soluzione di lavaggio ibridazione a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare il vetrino del campione in PBST 3 volte a temperatura ambiente. Nota: eseguire tutti i passaggi successivi nella camera umida a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di blocco e incubare per 1 ora a RT nella camera umida. </li><li> Rimuovere soluzione bloccante e aggiungere FITC coniugato soluzione di anticorpo anti-digossigenina (1: 200) per 3 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li></ol> 7. Montaggio e di osservazione <ol><li> Lavare il vetrino campione con PBST 2 volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di montaggio con DAPI. Mettere delicatamente il vetro di copertura e premere. Rimuovere la soluzione in eccessocon un tovagliolo di carta. </li><li> Per evitare l&#39;evaporazione della soluzione di montaggio, sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto. </li><li> Osservare al microscopio confocale. Esclusione di embrioni con fondo elevato. Focus su un campo con 4 - 20 nuclei. </li><li> Prendere le immagini in base alle istruzioni del produttore con lente obiettivo 100X. Nota: Excite campione con 405 nm laser per DAPI, con 555 nm laser per Cy3, con 488 nm laser per FITC. </li></ol> 8. Quantificazione dei telomeri Signal Nota: quantificazione è stata effettuata come descritto in precedenza 16. Tutte le immagini che devono essere confrontate vengono presi con stessa impostazione compreso il tempo di esposizione e la sorgente luminosa. <ol><li> Esportare l&#39;immagine in formato tif. </li><li> Scaricare e installare il software di analisi delle immagini. </li><li> Eseguire il software di analisi di immagine e fare clic sul pulsante d&#39;accordo. </li><li> Fare clic sul pulsante aperta. Aprire le immagini con telomeri FISH facendo doppio clic sul file di immagine. </li><li> Clic[Modifica] - [seleziona regione di elaborazione], selezionare regione di interesse da parte di sinistra del mouse e trascinamento. Escludere tutte le colorazione aspecifica. </li><li> Fare clic su [misura] - [Spot densità ottiche], selezionare il canale con il segnale dei telomeri e immettere il nome del file per salvare i risultati in file txt. Nota: La colonna di risultati sono nel seguente ordine: fluorescenza di spot, intensità di spot e area di spot background. </li><li> Copiare i valori e sottrarre l&#39;intensità di spot sfondo da fluorescenza della macchia. I valori possono essere analizzati statisticamente. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il vantaggio principale del nostro protocollo è la semplicità della procedura senza danni evidenti alla morfologia della struttura cellulare. Diversi passaggi sono stati ottimizzati per C. elegans FISH in questo protocollo. I passaggi critici per i pesci di successo includono l&#39;etichettatura di sonde, la fissazione di embrioni e la penetrazione. metodo di etichettatura digossigenina-dUTP fornisce un metodo di etichettatura di facile utilizzo mediante PCR o nick-translation. Per etichettare lunga sequenza be...

Telomeri protegge le estremità cromosomiche dalla fusione aberranti e degrado. telomeri mammiferi è composta da G-ricchi ripete esamerica, TTAGGG, e complessi shelterin. La sequenza di ripetizione telomerica del nematode è simile a quelle dei mammiferi (TTAGGC). La maggior parte degli eucarioti utilizzano telomerasi per aggiungere le ripetizioni dei telomeri alle loro estremità cromosomiche. Tuttavia, il 10 - 15% delle cellule tumorali utilizzano telomerasi meccanismo indipendente, conosciuto come allungamento dei telomeri alternativo (ALT) 3. In precedenza, abbiamo riportato che ripete telomeri e le sue sequenze associate, come il nome TALT, sono stati amplificati nei telomeri di linee mutanti telomerasi che sono sopravvissuti la sterilità critica 2. La lunghezza dei telomeri è stata misurata mediante PCR quantitativa o Southern blot, che fornisce la lunghezza media dei telomeri totale 4,5,6,7. Leggi conteggio di ripetizione dei telomeri in tutto il sequenziamento del genoma dei dati è anche un indicatore del totale contenuti telomeri 8. Sebbene SinGLE Telomere Lunghezza Analysis (STELA) potrebbe fornire la lunghezza di un singolo telomero, essa non può fornire informazioni spaziali dei telomeri 9. Mentre POT-1 :: mCherry proteina reporter fornisce le informazioni spaziali dei telomeri in vivo, non può rappresentare lunghezze dei telomeri a doppio filamento, come POT-1 è un telomero singolo filamento proteico il 10 vincolante. Mentre i metodi di cui sopra prevedono l&#39;informazione media delle sequenze ripetitive, ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette di osservare la quantità e la distribuzione spaziale delle singole sequenze di interesse su scala cromosomica. Invece di purificazione del DNA, tessuti o cellule vengono fissate per mantenere le informazioni nativo spaziale FISH. Così, il pesce è uno strumento sia quantitativa e qualitativa per l&#39;osservazione delle singole sequenze ripetute, come ripete telomeri. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per la rilevazione simultanea di entrambi telomeri e altre repliche basate su miglioramenti da metodi descritti in precedenza 11,12. C. elegans larve o adulti sono organismo multicellulare con cellule altamente differenziate. L&#39;eterogeneità delle cellule impedisce sull&#39;analisi quantitativa di un gran numero di macchie telomeri. Per massimizzare il numero di cellule analizzate, gli embrioni sono isolati e diffondere sugli scivoli polilisina rivestita per i pesci. Inoltre, questo protocollo può anche essere combinato con immunofluorescenza. Come prova che il protocollo funziona, mostriamo che è possibile osservare e quantificare due differenti sequenze ripetitive. sonda di DNA contro TALT1 è stata generata con semplice PCR che incorpora digossigenina-dUTP. Poi questa sonda TALT1 e sonda PNA telomeri fluorescenza marcati sono stati ibridati simultaneamente. Successivamente, digossigenina stato rilevato con metodi di immunofluorescenza canonici. Vi presentiamo qui le immagini rappresentative dove TALT1 colocalizzava con il telomero in TRT-1 </eM&gt; i sopravvissuti.

<table><tbody><tr><td>Sonda PNA</td><td>PANAGENE</td><td>ordine</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-Fluoresceina, frammenti Fab</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>uso 1:200 diluito in PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenina-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>preparare il 4% di paraformaldeide riscaldando in DW con poche gocce di NaOH. aggiungi 0,1 volumi di 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Soluzione di ibridazione</td><td>3x SSC, 50% formammide, 10% (p/v) destrano solfato, 50 &#956; g/ml di eparina, 100 &#956; g/ml di tRNA di lievito, 100 &#956; g/ml sperma di salmone sonicato DNA</td></tr><tr><td>Hybridizaiton soluzione</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>2x SSC, 50% formammide</td></tr><tr><td>formammide</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>tossico</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>fare 10 mg/ml per soluzione madre</td></tr><tr><td>Destrano solfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>Per 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226; 7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>Nome commerciale è Tween-20</td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina (0,1% p/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>preparare una soluzione fresca allo 0,01% p/v prima dell'uso</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g di KH2PO4, 6 g di Na2HPO4, 5 g di NaCl, 1 ml di 1 M di MgSO4, H2O in 1 L di</td></tr><tr>soluzione<td>sbiancante</td> 20% di ipoclorito di <td></td><td></td><td>sodio, 0,5 M KOH</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> anticorpale <td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Sodio azide (tossico)</td></tr><tr><td>Soluzione bloccante</td><td></td><td></td><td>Tampone anticorpale con albumina sierica bovina al 5% (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Per fare 1 L, 175,3 g di NaCl, 88,2 g di citrato di sodio, H2O a 1 L, regolare il pH a 7,0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>10x digossigenina-dUTP miscela</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>Colonne di purificazione PCR</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Detergente per vetri / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino multipozzetto</td><td>MP biomedicals</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr>Terreni <td></td><td></td> di<td>crescita dei nematodi</td><td>Per fare 1 L, 3 g di NaCl, 17 g di agar, 2,5 g di peptone, H2O a 974 ml. Autoclavare e raffreddare il pallone. Aggiungere 1 ml di 1 M CaCl2, 1 ml di colesterolo 4 mg/ml in etanolo, 1 ml di 1 M MgSO4, 25 ml di 1 M KPO4.</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>SIGMA-ALDRICH 196142</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama di piuma di rasoio</td><td></td><td>n. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzinomica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Microsope confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X è stato utilizzato come obiettivo obiettivo.</td></tr><tr><td>Camera</td><td></td><td></td> umida <td>Scatola di plastica riempita con tovagliolo di carta imbevuto di</td></tr><tr><td>software di analisi delle immagini DW&nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive usando fluorescenza<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione (fish) con sonde pna in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Il telomero è una struttura ribonucleoproteica che protegge le estremità cromosomiche dalla fusione e dalla degradazione aberrante. La lunghezza dei telomeri è mantenuta dalla telomerasi o da una via alternativa, nota come allungamento alternativo dei telomeri (ALT)1. Recentemente, C. elegans è emerso come un organismo modello multicellulare per lo studio dei telomeri e di ALT2. La visualizzazione delle sequenze ripetitive nel genoma è fondamentale per comprendere la biologia dei telomeri. Mentre la lunghezza dei telomeri può essere misurata mediante saggio dei frammenti di restrizione dei telomeri o PCR quantitativa, questi metodi forniscono solo la lunghezza media dei telomeri. Al contrario, l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) può fornire le informazioni dei singoli telomeri nelle cellule. Qui, forniamo protocolli e risultati rappresentativi del metodo per determinare la lunghezza dei telomeri di C. elegans mediante ibridazione fluorescente in situ. Questo metodo fornisce una procedura in situ semplice ma potente che non causa danni evidenti alla morfologia. Utilizzando l'acido peptidico nucleico (PNA) marcato in fluorescenza e la sonda marcata con digossigenina-dUTP, siamo stati in grado di visualizzare due diverse sequenze ripetitive: ripetizioni di telomeri e modello di ALT (TALT) in embrioni e gonadi di C. elegans.

In precedenza era stato riferito che sopravvissuto ALT può emergere dal mutante telomerasi-deficienti, TRT-1 (ok410), in bassa frequenza replicando localizzato internamente &#39;Modello di ALT&#39; (TALT) sequenze per telomeri manutenzione 2. Utilizzando la sonda PNA, siamo stati in grado di visualizzare telomeri nelle gonadi sezionati (Figura 2A). Il segnale telomeri debole è stato rilevato sia in TRT-1 (ok410) e ALT superstite. Il segnale s...

Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di ibridazione fluorescente in situ è analizzare in modo sintetico il numero e la lunghezza dei telomeri in C. elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo la rigenerazione tumorale, l'allungamento alternativo dei telomeri e la senescenza cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le procedure sono concise e i telomeri possono essere visualizzati e quantificati in meno di 24 ore.Raccogliere i vermi adulti gravidi con un po' di mezzo liquido senza detriti in un tubo da 15 millilitri. Lavare ora i vermi tre volte come segue. Aggiungere tampone M9 per un volume totale di 15 millilitri.Quindi centrifugare il tubo a 300 G per tre minuti e scartare la soluzione sovrastante il pellet di vermi. Ripetere quindi il processo. Se dopo la centrifugazione i vermi galleggiano, ridurre l'azione del freno sulla centrifuga.Dopo il terzo lavaggio, lasciare i vermi con 5 millilitri di M9. Quindi aggiungere 6,5 millilitri di acqua distillata, due millilitri di ipoclorito e un millilitro di idrossido di potassio cinque molare. Incubare i vermi in questa soluzione sbiancante per tre minuti con un'agitazione di 50 giri al minuto. Successivamente, vortexare i vermi per romperli e liberare le uova.Sotto un microscopio stereoscopico, cercare le uova rilasciate. Se non sono ancora state rilasciate, proseguire l'incubazione per un massimo di otto minuti. Se i vermi sono per lo più dissolti e le uova sono libere, portare il volume del tubo a 15 millilitri con M9 e lavare le uova tre volte, esattamente come si è fatto in precedenza con i vermi.Agli uova lavati, rimuovendo la maggior parte dell'M9, portare il volume a 500 microlitri con PBST, quindi aggiungere 500 microlitri di PFA al 4%. Prelevare ora aliquote di 40 microlitri di uova in PFA al 2% e distribuirle nei pozzetti di vetri coprioggetto rivestiti con polilisina. Trasferire quindi i vetri coprioggetto in una camera umidificata e lasciarli incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Per questo protocollo, preparare un blocco di alluminio su ghiaccio secco conservato a 80 gradi Celsius. Inoltre, conservare metanolo e acetone a 20 gradi Celsius. Al termine del passaggio di fissazione, rimuovere la maggior parte della soluzione di PFA dai vetrini, lasciandone circa cinque microlitri.Quindi posizionare un secondo vetrino rivestito di polilisina su ciascun vetrino campione in modo che le due superfici rivestite aderiscano tra loro, intrappolando i tessuti nella depressione. Se è presente un eccesso di fissativo, asciugarlo con un fazzoletto di carta. Congelare ora i vetrini appoggiandoli su un blocco di alluminio freddo per almeno 15 minuti.Nel frattempo, preparare bagni di metanolo e acetone su ghiaccio per i vetrini. Una volta che i vetrini sono congelati, ruotarne uno per provocare la rottura da congelamento del campione. Scartare il vetrino superiore e immergere il vetrino inferiore in metanolo ghiacciato per cinque minuti.Eseguire questa procedura per tutti i campioni. La fratturazione mediante congelamento permette la penetrazione di sonde e anticorpi attraverso il guscio rigido dell'uovo. Se la fratturazione mediante congelamento è stata eseguita con successo, sarà possibile osservare le uova su entrambi i vetrini.Dopo almeno cinque minuti in metanolo, trasferire i vetrini in acetone freddo per cinque minuti. Dopo altri cinque minuti, immergere i campioni in PBST tre volte per cinque minuti per ogni bagno. Dopo i lavaggi con PBST, i vetrini possono essere conservati in etanolo al 100% a quattro gradi Celsius per diversi giorni.Per procedere, aggiungere 20 microlitri di soluzione di RNase nei pozzetti del campione e incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, lavare i vetrini due volte in 2x SSCT, per 15 minuti per ogni lavaggio. Dopo i due lavaggi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di ibridazione ai campioni e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in una camera umidificata.Nel frattempo, preparare la sonda per una sonda di DNA a doppio filamento. Denaturarla a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddarla brevemente sul ghiaccio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione di ibridazione e aggiungere la soluzione della sonda.A partire da questo passaggio, proteggere il campione dalla luce. Dopo aver aggiunto la sonda, coprire i campioni con coprioggetti di vetro. Quindi preparare una camera umidificata su un blocco termocontrollato a 80 gradi Celsius.Quando il blocco riscaldante ha raggiunto nuovamente la stabilizzazione a 80 gradi Celsius, posizionare i vetrini campione nella camera riscaldata e lasciarli denaturare per tre minuti. Successivamente, incubare tutti i vetrini processati in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Al termine dell'incubazione notturna, lavare i campioni in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti.Come preparazione, riscaldare la soluzione di ibridazione a 37 gradi Celsius un'ora prima del lavaggio. Quindi caricare i vetrini in un barattolo contenente soluzione di lavaggio per ibridazione e incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per rimuovere la soluzione di ibridazione, lavare i campioni con PBST a temperatura ambiente per 15 minuti.Eseguire questa operazione tre volte. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio con PBST, aggiungere 20 microlitri di soluzione bloccante a ciascun campione e incubare i campioni in camere umidificate a temperatura ambiente per un'ora al buio. Quindi aspirare la soluzione bloccante e sostituirla con soluzione di anticorpo anti-digossigenina coniugato con FITC in rapporto di uno a 200.Coprire i vetrini e incubarli a temperatura ambiente per tre ore al buio. Dopo la colorazione con l'anticorpo, lavare i campioni due volte con PBST per 15 minuti per ogni lavaggio al buio. Successivamente aspirare il PBST e sostituirlo con 10 microlitri di soluzione di montaggio contenente DAPI.Applicare un coprioggetto ed eliminare eventuali eccessi di soluzione. Infine, sigillare i bordi del coprioggetto con lo smalto per unghie ed esaminare i campioni al microscopio fluorescente. Utilizzando la sonda PNA, sono stati osservati i telomeri di animali sopravvissuti a una mutazione sufficiente per i telomeri.Nelle gonadi, il numero di telomeri per nucleo è quantificabile. Il segnale del telomero si è sovrapposto a un segnale TALT1, sostenendo l'ipotesi che TALT1 sia responsabile della sopravvivenza in assenza di telomeri. L'intensità del segnale del telomero è stata confrontata utilizzando un software.Il segnale era più intenso nei sopravvissuti ALT rispetto ai ceppi parentali utilizzati per generare i mutanti carenti di telomeri. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e formammide può essere estremamente pericoloso, e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di guanti, durante l'esecuzione di questa procedura.

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