Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza
4 agosto 2016
Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).
L'obiettivo generale di questa tecnica di ibridazione fluorescente in situ è analizzare in modo sintetico il numero e la lunghezza dei telomeri in C. elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo la rigenerazione tumorale, l'allungamento alternativo dei telomeri e la senescenza cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le procedure sono concise e i telomeri possono essere visualizzati e quantificati in meno di 24 ore.
Raccogliere i vermi adulti gravidi con un po' di mezzo liquido senza detriti in un tubo da 15 millilitri. Lavare ora i vermi tre volte come segue. Aggiungere tampone M9 per un volume totale di 15 millilitri.
Quindi centrifugare il tubo a 300 G per tre minuti e scartare la soluzione sovrastante il pellet di vermi. Ripetere quindi il processo. Se dopo la centrifugazione i vermi galleggiano, ridurre l'azione del freno sulla centrifuga.
Dopo il terzo lavaggio, lasciare i vermi con 5 millilitri di M9. Quindi aggiungere 6,5 millilitri di acqua distillata, due millilitri di ipoclorito e un millilitro di idrossido di potassio cinque molare. Incubare i vermi in questa soluzione sbiancante per tre minuti con un'agitazione di 50 giri al minuto. Successivamente, vortexare i vermi per romperli e liberare le uova.
Sotto un microscopio stereoscopico, cercare le uova rilasciate. Se non sono ancora state rilasciate, proseguire l'incubazione per un massimo di otto minuti. Se i vermi sono per lo più dissolti e le uova sono libere, portare il volume del tubo a 15 millilitri con M9 e lavare le uova tre volte, esattamente come si è fatto in precedenza con i vermi.
Agli uova lavati, rimuovendo la maggior parte dell'M9, portare il volume a 500 microlitri con PBST, quindi aggiungere 500 microlitri di PFA al 4%. Prelevare ora aliquote di 40 microlitri di uova in PFA al 2% e distribuirle nei pozzetti di vetri coprioggetto rivestiti con polilisina. Trasferire quindi i vetri coprioggetto in una camera umidificata e lasciarli incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Per questo protocollo, preparare un blocco di alluminio su ghiaccio secco conservato a 80 gradi Celsius. Inoltre, conservare metanolo e acetone a 20 gradi Celsius. Al termine del passaggio di fissazione, rimuovere la maggior parte della soluzione di PFA dai vetrini, lasciandone circa cinque microlitri.
Quindi posizionare un secondo vetrino rivestito di polilisina su ciascun vetrino campione in modo che le due superfici rivestite aderiscano tra loro, intrappolando i tessuti nella depressione. Se è presente un eccesso di fissativo, asciugarlo con un fazzoletto di carta. Congelare ora i vetrini appoggiandoli su un blocco di alluminio freddo per almeno 15 minuti.
Nel frattempo, preparare bagni di metanolo e acetone su ghiaccio per i vetrini. Una volta che i vetrini sono congelati, ruotarne uno per provocare la rottura da congelamento del campione. Scartare il vetrino superiore e immergere il vetrino inferiore in metanolo ghiacciato per cinque minuti.
Eseguire questa procedura per tutti i campioni. La fratturazione mediante congelamento permette la penetrazione di sonde e anticorpi attraverso il guscio rigido dell'uovo. Se la fratturazione mediante congelamento è stata eseguita con successo, sarà possibile osservare le uova su entrambi i vetrini.
Dopo almeno cinque minuti in metanolo, trasferire i vetrini in acetone freddo per cinque minuti. Dopo altri cinque minuti, immergere i campioni in PBST tre volte per cinque minuti per ogni bagno. Dopo i lavaggi con PBST, i vetrini possono essere conservati in etanolo al 100% a quattro gradi Celsius per diversi giorni.
Per procedere, aggiungere 20 microlitri di soluzione di RNase nei pozzetti del campione e incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, lavare i vetrini due volte in 2x SSCT, per 15 minuti per ogni lavaggio. Dopo i due lavaggi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di ibridazione ai campioni e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora in una camera umidificata.
Nel frattempo, preparare la sonda per una sonda di DNA a doppio filamento. Denaturarla a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddarla brevemente sul ghiaccio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione di ibridazione e aggiungere la soluzione della sonda.
A partire da questo passaggio, proteggere il campione dalla luce. Dopo aver aggiunto la sonda, coprire i campioni con coprioggetti di vetro. Quindi preparare una camera umidificata su un blocco termocontrollato a 80 gradi Celsius.
Quando il blocco riscaldante ha raggiunto nuovamente la stabilizzazione a 80 gradi Celsius, posizionare i vetrini campione nella camera riscaldata e lasciarli denaturare per tre minuti. Successivamente, incubare tutti i vetrini processati in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Al termine dell'incubazione notturna, lavare i campioni in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti.
Come preparazione, riscaldare la soluzione di ibridazione a 37 gradi Celsius un'ora prima del lavaggio. Quindi caricare i vetrini in un barattolo contenente soluzione di lavaggio per ibridazione e incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per rimuovere la soluzione di ibridazione, lavare i campioni con PBST a temperatura ambiente per 15 minuti.
Eseguire questa operazione tre volte. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio con PBST, aggiungere 20 microlitri di soluzione bloccante a ciascun campione e incubare i campioni in camere umidificate a temperatura ambiente per un'ora al buio. Quindi aspirare la soluzione bloccante e sostituirla con soluzione di anticorpo anti-digossigenina coniugato con FITC in rapporto di uno a 200.
Coprire i vetrini e incubarli a temperatura ambiente per tre ore al buio. Dopo la colorazione con l'anticorpo, lavare i campioni due volte con PBST per 15 minuti per ogni lavaggio al buio. Successivamente aspirare il PBST e sostituirlo con 10 microlitri di soluzione di montaggio contenente DAPI.
Applicare un coprioggetto ed eliminare eventuali eccessi di soluzione. Infine, sigillare i bordi del coprioggetto con lo smalto per unghie ed esaminare i campioni al microscopio fluorescente. Utilizzando la sonda PNA, sono stati osservati i telomeri di animali sopravvissuti a una mutazione sufficiente per i telomeri.
Nelle gonadi, il numero di telomeri per nucleo è quantificabile. Il segnale del telomero si è sovrapposto a un segnale TALT1, sostenendo l'ipotesi che TALT1 sia responsabile della sopravvivenza in assenza di telomeri. L'intensità del segnale del telomero è stata confrontata utilizzando un software.
Il segnale era più intenso nei sopravvissuti ALT rispetto ai ceppi parentali utilizzati per generare i mutanti carenti di telomeri. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e formammide può essere estremamente pericoloso, e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di guanti, durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) per l'analisi della lunghezza e del numero di telomeri in Caenorhabditis elegans. Il metodo consente la visualizzazione e la quantificazione dei ripetuti telomerici e dell'allungamento telomerico alternativo (TALT) in meno di 24 ore.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- I telomeri proteggono le estremità dei cromosomi e sono fondamentali nell'invecchiamento cellulare.
- Comprendere la dinamica dei telomeri è importante per la ricerca sul cancro.
- L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è uno strumento potente per visualizzare il materiale genetico.
- Caenorhabditis elegans si avvale come organismo modello per studi genetici.
Scopo dello studio
- Sviluppare una procedura FISH concisa per C. elegans.
- Quantificare la lunghezza e il numero dei telomeri in un breve lasso di tempo.
- Studiare il ruolo dei telomeri nella rigenerazione tumorale e nella senescenza cellulare.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di adulti gravidi di C. elegans in mezzo liquido.
- Lavaggio dei vermi con tampone M9 per prepararli alla FISH.
- Applicazione della FISH per visualizzare le sequenze telomeriche.
- Quantificazione delle ripetizioni telomeriche e del TALT.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita di ripetizioni telomeriche in C. elegans.
- Quantificazione di due sequenze ripetitive diverse ottenuta.
- Dimostrata l'efficacia della tecnica FISH in breve tempo.
- Forniti spunti sulla biologia dei telomeri rilevanti per la ricerca sul cancro.
Conclusioni
- Il metodo FISH sviluppato è efficace per lo studio dei telomeri in C. elegans.
- Questa tecnica può facilitare la ricerca sulle malattie correlate ai telomeri.
- Studi futuri potranno approfondire le implicazioni della dinamica telomerica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo FISH consente la visualizzazione diretta e la quantificazione della dinamica dei telomeri in un modello multicellulare, supportando la validazione degli obiettivi nella biologia dei telomeri e nei percorsi di allungamento alternativo. Fornendo una risoluzione a livello di singola cellula per sequenze ripetitive, aumenta la sicurezza predittiva negli studi meccanicistici sulla stabilità genomica e sulla senescenza cellulare. L'approccio offre un saggio rapido e che preserva la morfologia, adatto a flussi di lavoro di scoperta precoce incentrati su bersagli legati ai telomeri.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi di mantenimento dei telomeri, inclusa l'attività della via ALT, per validare ipotesi terapeutiche.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative del numero e della lunghezza dei telomeri per nucleo, utili per la valutazione funzionale della proteina bersaglio.
- Valore predittivo: Permette una valutazione allineata ai biomarcatori dell'instabilità genomica in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera segnali FISH standardizzati e riproducibili per le sequenze telomeriche e TALT, consentendo la prontezza del saggio.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi di imaging compatibili con pipeline di analisi ad alto contenuto.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la visualizzazione dei telomeri all'attività ALT, supportando la riduzione del rischio meccanicistica in modelli preclinici.
- Continuità traslazionale: Permette la correlazione dei segnali telomerici con la co-localizzazione di TALT1 per la validazione del percorso.
- Avanzamento ponderato rispetto al rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla dinamica telomerica in contesti rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fino alla preclinica, fornendo una quantificazione dei telomeri che contribuisce a definire la fiducia nel bersaglio e la validazione del percorso prima dell'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla regolazione della lunghezza dei telomeri e sul meccanismo ALT in C. elegans.
- Screening: Fornisce segnali quantitativi e riproducibili dei telomeri per la standardizzazione dei saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Permette il confronto basato sull'intensità dei segnali telomerici mediante software di analisi delle immagini per letture oggettive.
- Ricerca traslazionale: Collega la dinamica dei telomeri all'attività della via ALT attraverso la co-localizzazione di TALT1 per ottenere informazioni meccanicistiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità FISH riutilizzabile per l'analisi di telomeri e sequenze ripetitive in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella biologia dei telomeri, validazione degli obiettivi e riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei meccanismi ALT.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della quantificazione dei telomeri in campioni fissati.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi mirati ai telomeri.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata sulla validazione del meccanismo di mantenimento dei telomeri.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nella microscopia a fluorescenza, nell'ibridazione delle sonde e nella preparazione dei campioni per C. elegans in preparazione intera.
- Necessità di vetrini rivestiti con polilisina, camere umidificate e sistemi di incubazione con controllo della temperatura.
- Esigenza di manipolazione delle sonde PNA, trattamento con RNasi e passaggi di amplificazione del segnale basati su anticorpi.
- Considerazioni per l'adattamento a diversi sistemi modello o tipi di tessuto oltre agli embrioni e ai gonadi.
- I limiti pratici includono la manipolazione di reagenti pericolosi (paraformaldeide, formammide) e la necessità di proteggere i campioni dalla luce durante l'ibridazione.
