Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza In Situ Ibridazione (FISH) con sonde PNA in Caenorhabditis elegans
August 4th, 2016
Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).
L'obiettivo generale di questa tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza è quello di analizzare in modo conciso il numero e la lunghezza dei telomeri in C.Elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regenesi del tumore, sull'allungamento alternativo dei telomeri e sulla senescenza cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le procedure sono concise e i telomeri possono essere visualizzati e quantificati in meno di 24 ore.
Raccogli i vermi adulti gravidi con un po' di terreno liquido senza detriti in un tubo da 15 millilitri. Ora lava i vermi tre volte come segue. Aggiungere il tampone M9 per un volume totale di 15 millilitri.
Quindi centrifugare il tubo a 300 G per tre minuti e scartare la soluzione sopra il pellet di vermi. Quindi ripetere il processo. Se dopo la centrifugazione le viti vengono a galla, alleggerire il freno della centrifuga.
Dopo il terzo lavaggio, lasciare i vermi con 5 millilitri di M9. Quindi aggiungere 6,5 millilitri di acqua distillata, due millilitri di iperclorito e un millilitro di idrossido di potassio a cinque molari. Lasciare incubare i vermi in questa soluzione sbiancante per tre minuti con 50 giri/min di agitazione. Quindi agitare i vermi per tagliarli e liberare le loro uova.
Sotto un microscopio da dissezione, cerca le uova rilasciate. Se non vengono ancora rilasciati, continuare l'incubazione o fino a otto minuti. Se i vermi sono per lo più disciolti e le uova sono libere, riempi il tubo fino a 15 millilitri con M9 e lava le uova tre volte proprio come i vermi sono stati lavati prima.
Alle uova lavate, con la maggior parte dell'M9 rimosso, riempire il volume a 500 microlitri con PBST, quindi aggiungere 500 microlitri di PFA al 4%. Ora caricare 40 aliquote di microlitri di uova in PFA al 2% nei pozzetti dei vetrini rivestiti di polilisina. Quindi trasferire i vetrini in una camera umidificata e lasciarli incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Per questo protocollo, avere un blocco di alluminio su ghiaccio secco conservato a 80 gradi Celsius. Inoltre, conserva metanolo e acetone a 20 gradi Celsius. Al termine della fase di fissaggio, rimuovere la maggior parte della soluzione di PFA dai vetrini, lasciando circa cinque microlitri.
Quindi posizionare i secondi vetrini rivestiti di polilisina su ciascun vetrino campione in modo che le due superfici rivestite aderiscano insieme, intrappolando i tessuti nel pozzetto. Se c'è un fissativo eccessivo, pulirlo con un fazzoletto. Ora congelate i vetrini posizionandoli sul blocco di alluminio freddo per almeno 15 minuti.
Nel frattempo, preparare bagni di metanolo e acetone con ghiaccio per gli scivoli. Una volta che i vetrini sono congelati, ruotarne uno per congelare il campione. Scartare il vetrino superiore e immergere il vetrino inferiore in metanolo ghiacciato per cinque minuti.
Eseguire questa operazione per tutti i campioni. Il freeze cracking consente la penetrazione delle sonde e degli anticorpi attraverso il guscio duro dell'uovo. Se le uova vengono congelate con successo, potresti vedere le uova su entrambe le diapositive.
Dopo almeno cinque minuti in metanolo, spostare i vetrini sull'acetone freddo per cinque minuti. In altri cinque minuti, immergere i campioni in PBST tre volte per cinque minuti per bagno. Dopo i lavaggi PBST, i vetrini possono essere conservati in etanolo al 100% a quattro gradi Celsius per diversi giorni.
Per procedere, aggiungere 20 microlitri di soluzione di RNasi ai pozzetti del campione e incubarli in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi lavare i vetrini in 2x SSCT due volte per 15 minuti per lavaggio. Dopo i due lavaggi, aggiungere 20 microlitri di soluzione di ibridazione ai campioni e incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora in una camera umidificata.
Nel frattempo, preparare la sonda per una sonda di DNA a doppio filamento. Denaturarlo a 95 gradi Celsius per cinque minuti e poi raffreddarlo brevemente con ghiaccio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione di ibridazione e aggiungere la soluzione della sonda.
Da questo passaggio in avanti, proteggere il campione dalla luce. Dopo aver aggiunto la sonda, coprire i campioni con vetrini. Quindi creare una camera umidificata su un blocco termico a 80 gradi Celsius.
Quando il blocco termico si è stabilizzato a 80 gradi Celsius, posizionare i vetrini del campione nella camera riscaldata e lasciare denaturare per tre minuti. Quindi incubare tutti i vetrini trattati in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per una notte. Dopo l'incubazione notturna, lavare i campioni in PBST a temperatura ambiente per cinque minuti.
In preparazione, scaldare la soluzione di ibridazione a 37 gradi Celsius un'ora prima del lavaggio. Quindi caricare i vetrini in un barattolo di soluzione di lavaggio per ibridazione e incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per rimuovere la soluzione di ibridazione, lavare i campioni con PBST a temperatura ambiente per 15 minuti.
Fallo tre volte. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio PBST, aggiungere 20 microlitri di soluzione bloccante a ciascun campione e incubarli in camere umidificate a temperatura ambiente per un'ora al buio. Quindi aspirare la soluzione bloccante e sostituirla con una soluzione di anticorpi anti-digossigenina coniugata FITC a una risoluzione su 200.
Coprire i vetrini e incubarli a temperatura ambiente per tre ore al buio. Dopo la colorazione con anticorpi, lavare i campioni due volte con PBST per 15 minuti per lavaggio al buio. Successivamente aspirare il PBST e sostituirlo con 10 microlitri di soluzione di montaggio contenente DAPI.
Applicare un vetro di copertura e assorbire la soluzione in eccesso. Infine, sigillare i bordi del vetro di copertura con lo smalto per unghie e procedere con l'osservazione dei campioni al microscopio a fluorescenza. Utilizzando la sonda PNA, sono stati osservati i telomeri degli animali sopravvissuti a una mutazione sufficiente per i telomeri.
Nelle gonadi, il numero di telomeri per nucleo è quantificabile. Il segnale dei telomeri è co-localizzato con un segnale TALT1, supportando l'idea che TALT1 sia responsabile della sopravvivenza senza telomeri. L'intensità del segnale dei telomeri è stata confrontata utilizzando un software.
Il segnale era più forte nei sopravvissuti all'ALT rispetto ai ceppi parentali utilizzati per generare i mutanti carenti di telomeri. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e formamide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare i guanti.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica di ibridazione in situ fluorescente (FISH) concisa per l'analisi della lunghezza e del numero dei telomeri in Caenorhabditis elegans. Il metodo consente la visualizzazione e la quantificazione delle ripetizioni dei telomeri e dell'allungamento alternativo dei telomeri (TALT) in meno di 24 ore.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Genetica
Contesto
- I telomeri proteggono le estremità dei cromosomi e sono fondamentali nell'invecchiamento cellulare.
- Comprendere la dinamica dei telomeri è importante per la ricerca sul cancro.
- L'ibridazione in situ fluorescente (FISH) è uno strumento potente per la visualizzazione del materiale genetico.
- Caenorhabditis elegans funge da organismo modello per gli studi genetici.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una procedura FISH concisa per C. elegans.
- Quantificare la lunghezza e il numero dei telomeri in un breve lasso di tempo.
- Indagare il ruolo dei telomeri nella rigenerazione tumorale e nell'invecchiamento cellulare.
Metodi utilizzati
- Raccolta di C. elegans adulti gravidi in mezzo liquido.
- Lavaggio dei vermi con tampone M9 per prepararli alla FISH.
- Applicazione della FISH per visualizzare le sequenze dei telomeri.
- Quantificazione delle ripetizioni dei telomeri e del TALT.
Risultati principali
- Visualizzazione con successo delle ripetizioni dei telomeri in C. elegans.
- Quantificazione di due diverse sequenze ripetitive ottenuta.
- Dimostrato l'efficacia della tecnica FISH in un breve periodo di tempo.
- Fornito approfondimenti sulla biologia dei telomeri rilevanti per la ricerca sul cancro.
Conclusioni
- Il metodo FISH sviluppato è efficiente per lo studio dei telomeri in C. elegans.
- Questa tecnica può facilitare la ricerca sulle malattie legate ai telomeri.
- Studi futuri possono approfondire le implicazioni della dinamica dei telomeri.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This FISH method enables direct visualization and quantification of telomere dynamics in a multicellular model, supporting target validation in telomere biology and alternative lengthening pathways. By providing single-cell resolution of repetitive sequences, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of genomic stability and cellular senescence. The approach offers a rapid, morphology-preserving assay suitable for early discovery workflows focused on telomere-related targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of telomere maintenance mechanisms, including ALT pathway activity, to validate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of telomere number and length per nucleus for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports biomarker-aligned evaluation of genomic instability in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible FISH signals for telomere and TALT sequences to enable assay readiness.
- Operational Value: Delivers quantitative imaging outputs compatible with high-content analysis pipelines.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links telomere visualization to ALT activity, supporting mechanistic de-risking in preclinical models.
- Translational Continuity: Enables correlation of telomere signals with TALT1 co-localization for pathway validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on telomere dynamics in disease-relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing telomere quantification that informs target confidence and pathway validation before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of telomere length regulation and ALT mechanism in C. elegans.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible telomere signals for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables intensity-based comparison of telomere signals using image analysis software for objective readouts.
- Translational Research: Connects telomere dynamics to ALT pathway activity via TALT1 co-localization for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FISH capability for telomere and repetitive sequence analysis across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in telomere biology, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in ALT mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of telomere quantification in fixed samples.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in telomere-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on telomere maintenance mechanism validation.
Implementation Considerations
- Expertise in fluorescence microscopy, probe hybridization, and sample preparation for whole-mount C. elegans.
- Requirement for polylysine-coated slides, humidified chambers, and temperature-controlled incubation systems.
- Need for PNA probe handling, RNase treatment, and antibody-based signal amplification steps.
- Adaptation considerations for different model systems or tissue types beyond embryos and gonads.
- Practical limitations include hazardous reagent handling (paraformaldehyde, formamide) and requirement for light protection during hybridization.
