Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule progenitrici mesangiogeniche o MPC dal midollo osseo umano mediante condizioni di coltura selettive. Stiamo testando sia il loro potenziale mesogenico che angiogenico. Le cellule progenitrici mesangiogeniche vengono identificate a bassa percentuale con una coltura cellulare mesen-ki-ma-stro-mo ottimizzata per l'applicazione clinica.

Quando FBS può essere sostituito dal siero umano. Questa tecnica è unica, infatti consente l'isolamento molto consistente di un gran numero di NPC alli-pol-ificate adatte per la germinazione dell'angiogenesi e una generazione di colture di MSC sincronizzate. Lo abbiamo scoperto quando, dopo viaggi nella digestione di colture di MCS in un siero talgrum, alcune cellule a forma di uovo fritto rimangono attaccate ma differenziate in MC dopo il trattamento con FPS.

Per isolare le cellule mononucleate del midollo osseo umano, o MNC, iniziare diluendo da cinque a 10 millilitri di midollo osseo fresco fino a un volume totale di 50 millilitri con DPBS e mescolare la soluzione cellulare per inversione. Successivamente, distribuire equamente 25 millilitri di cellule in due nuove provette coniche da 50 millilitri e aggiungere 25 millilitri di DPBS fresco a ciascuna provetta per una seconda miscelazione per inversione. Quindi far riposare le cellule a temperatura ambiente per consentire ai frammenti di ossa minerali e al grasso di separarsi dalla soluzione.

Dopo 10 minuti, utilizzare una pipetta per pasta per rimuovere con cura il grasso galleggiante e filtrare le sospensioni cellulari attraverso filtri individuali da 70 micron senza disturbare i pellet di frammenti di osso minerale. Per isolare la MNC, sovrapporre 20-25 millilitri di midollo osseo diluito su un terreno di gradiente di densità a temperatura ambiente di 1,007 grammi per millilitro in ciascuna delle due provette da 50 millilitri e separare le cellule mediante centrifugazione. Quindi utilizzare una pipetta sterile per pastori per raggruppare gli anelli biancastri di cellule sulle facce di ingresso in una nuova provetta da 50 millilitri.

Lavare le cellule mononucleate isolate con terreno di coltura fresco per cinque minuti a 400 volte G e temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet in 5-10 millilitri di terreno di coltura fresco. Per isolare l'MPC, equilibrare le fiasche idrofobiche T75 con 15 millilitri di terreno di coltura fresco a 37 gradi Celsius e il cinque percento di anidride carbonica.

Dopo 30 minuti, seminare da quattro a sei volte 10 su sette delle cellule mononucleate del midollo osseo umano per fiaschetta per un'incubazione di 48 ore. Il secondo giorno scartare il terreno e le cellule non aderenti dai palloni e nutrire le cellule con 15 millilitri di terreno di coltura fresco. Rimetti le colture nell'incubatrice per sei-otto giorni.

Al termine dell'incubazione lavare le cellule aderenti con DMEM fresco. Quindi incubare le cellule con due millilitri di soluzione di distacco di protee libere di animali per 5-15 minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono sollevate dal fondo del pallone, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura fresco per fermare la reazione e raccogliere le cellule mediante centrifugazione, rimettendo in sospensione il pellet in uno o due millilitri di terreno di coltura fresco.

Dopo aver contato la piastra MPC due volte, da 10 a quattro per centimetro quadrato delle cellule in fiasche di coltura tissutale trattate con fiasche di coltura T75 e far aderire le cellule per una notte in 15 millilitri di terreno di coltura fresco nell'incubatore per colture cellulari. La mattina successiva sostituire il terreno di coltura con 200 microlitri per centimetro quadrato di cellula di misancolmulstromul o terreno di espansione MSC e coltivare le cellule per altri sette-10 giorni. Quando le colture hanno raggiunto la confluenza, la sottocoltura da tre a cinque volte dieci per tre cellule per centimetro quadrato fino a raggiungere una nuova confluenza di passaggio due presso MSC, eseguire la digestione delle protee per raccogliere le cellule come precedentemente dimostrato.

Piastra due volte dieci al quarto di cellule per centimetro quadrato in coltura tissutale trattata con piastre a sei pozzetti e terreno di espansione fresco. Dopo aver fatto crescere nuovamente le colture fino alla confluenza, contrassegnare due pozzetti come nessuna differenziazione e rinfrescare il mezzo di espansione. Contrassegnare due pozzetti come osteoblasti e sostituire il terreno con 200 microlitri per centimetro quadrato di terreno osteogenico standard specificamente progettato per la differenziazione delle MSC.

Quindi contrassegnare due pozzetti come siti adipo e sostituire il terreno con 200 microlitri per centimetro quadrato di terreno adipogenico standard specificamente progettato per la differenziazione delle MSC. Rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per due o tre settimane fino a quando le cellule non si sono differenziate. Quindi procedere alla rilevazione fluorescente dei depositi di calcio extracellulari e dell'accumulo di goccioline lipidiche introcellulari.

Per produrre sferoidi 3D, seminare un gran numero di gocce da 20 microlitri di sospensione di MPC appena isolata sulla superficie interna del coperchio di una capsula di Petri. Quando tutte le gocce sono state posizionate con cura, posizionare il coperchio su una base di piastre di Petri contenente DPBS per evitare l'evaporazione delle gocce sospese e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari durante la notte. La mattina successiva aggiungere 300 microlitri di alloquat standard della matrice extracellulare a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti da quattro gradi Celsius e gelificare le proteine della matrice ai loro 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Aggiungere 700 microlitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali vascolari standard ricco di fattore di crescita endoteliale sulle proteine gelificate della ECM. Quando gli MPC si sono aggregati in sferoidi 3D, capovolgere con cura il coperchio della capsula di Petri e utilizzare una pipetta pasteur sterile per raccogliere delicatamente gli sferoidi. Infine, seminare gli sferoidi nei pozzetti di coltura e rimettere la piastra nell'incubatrice.

Morficologicamente le MPC sono caratterizzate dalla loro caratteristica forma a uovo fritto con una regione centrale spessa circondata da una periferia piatta e sottile che mostra molti philipodia. Spesso si osserva anche l'allungamento polare del confine cellulare esterno. La coltura di MPC in terreno di espansione MSC determina una rapida ma parziale differenziazione in cellule proliferanti piatte e multiramificate con MPC indifferenziate residue ancora rilevabili.

Dopo un ulteriore passaggio, le colture danno luogo a un monostrato di cellule simili a MSC in crescita esponenziale. Nel processo, le MPC riorganizzano la loro F-actina in fibre di stress, mentre l'espressione della nestina viene confinata a poche cellule rare. L'analisi dei flussi delle MPC appena isolate mostra che oltre il 95% delle cellule esprime CD31 e CD45 ma manca degli antigeni associati al mis-en-com-al CD90 e CD 73.

Questi ultimi antigeni sono altamente espressi solo dopo una completa differenziazione in MSC. Confermando la loro natura di mis-en-com-al quando alimentate con mezzo differenziante per almeno due settimane, queste cellule possono essere facilmente indotte in osteoblasti, come indicato dai loro depositi di calcio o adiposite, come evidente dall'accumulo di goccioline lipidiche. Confermare la natura MSC delle colture cellulari predifferenziate.

tipizzazione delle MPC è ulteriormente confermata in un test di angiogenesi a germoglio con le cellule che mostrano la capacità di invadere un gel proteico della matrice extracellulare di Myrian da sferoidi 3D dopo 24 ore di stimolo del fattore di crescita endoteliale vascolare. Dopo una settimana, le cellule invasive migrano su una distanza ancora maggiore, una capacità di invasione che viene persa nelle MSC di secondo passaggio dopo la differenziazione mesangenica. Una volta padroneggiate, le colture di MSC possono essere stabilite in un'ora, se questa viene affrontata correttamente, fornendo tra uno o due milioni di MPC in meno di una settimana.

Quando si tenta questa procedura, è importante valutare le prestazioni dei batch CR umani prima di utilizzarli nelle colture. Al momento il nostro protocollo di isolamento MPC è l'unico per ottenere colture di MC quasi pure ad alta riproducibilità per ulteriori applicazioni a valle. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo delle terapie cellulari per esplorare la possibilità di applicare l'MPC nella rigenerazione del tessuto scheletrico.