Tecniche per l'evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo

L'obiettivo generale di questa procedura di evoluzione adattativa è quello di derivare ceppi robusti del lievito fermentante nativo xilosio scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 in grado di fermentare più rapidamente gli zuccheri esoso e pentoso in idrolizzati non detossificati in etanolo economicamente recuperabile. Questo metodo fa avanzare l'industria della lignocellulosa verso l'etanolo, fornendo una road map per i ceppi con modifiche complesse, consentendo la fermentazione degli zuccheri in idrolizzati che contengono inibitori microbici. In questo caso, il vantaggio principale dell'evoluzione mirata è che i ceppi robusti sono modellati da un lievito autoctono in grado di fermentare lo xilosio, eliminando la necessità di ingegnerizzare ceppi industriali di saccharomyces.

Ci siamo resi conto che era improbabile che ogni singolo ceppo di lievito fosse robusto in diversi tipi di idrolizzati, come il pagliaccio di mais pretrattato AFEX o il panico verga pretrattato con acido diluito. La capacità di scheffersomyces stipitis di subire un ciclo riproduttivo sessuale è vantaggiosa per un ulteriore sfruttamento nel presente lavoro perché i vari ceppi sviluppati possono essere combinati in un unico ceppo più robusto attraverso l'accoppiamento di ceppi aventi questi vari tratti. A dimostrare la procedura saranno le coautrici Stephanie Thomson e Maureen Shea-Andersh, che sono tecnici di scienze biologiche nel mio laboratorio.

Prima di iniziare questa procedura di arricchimento, preparare una precoltura del ceppo NRRL Y-7124 in un pallone da 125 millilitri e una serie di diluizioni dell'idrolizzato di spiga di mais pretrattato per l'espansione della fibra di ammoniaca saccarificata, o AFEX CSH. Utilizzare una pipetta ripetuta per riempire una micropiastra da 96 pozzetti con 15 microlitri per pozzetto e otto pozzetti per diluizione dell'idrolizzato. Inoculare con alcuni microlitri di precoltura per pozzetto per consentire un'assorbanza iniziale a 620 nanometri, o A620 maggiore o uguale a 0,1.

Metti la micropiastra in una scatola di plastica con un tovagliolo di carta bagnato per l'umidità e incuba staticamente per 24-28 ore a 25 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro di lettura per micropiastre per identificare le colture che sono cresciute fisicamente fino a un A620 maggiore di 1,0 nella diluizione dell'idrolizzato più concentrata. Raggruppare i pozzetti identificati in un tubo per microfuge e distribuirli in una piastra di riempimento.

Trasferire da uno a cinque microlitri dalla piastra di riempimento a ciascun pozzetto di una nuova serie di diluizione dell'idrolizzato per ottenere un A620 iniziale maggiore o uguale a 0,1 e incubare la piastra come prima. Monitorare la crescita delle colture nella micropiastra con uno spettrofotometro di lettura per micropiastre. Preparare regolarmente scorte di glicerolo di colture di adattamento.

Raggruppare quattro pozzetti della massima concentrazione di idrolizzato colonizzati in un criofile e miscelare uno a uno con glicerolo sterile al 20%. Congelare le celle a meno 80 gradi Celsius. Ripetere questa procedura di arricchimento fino a quando la crescita del 12% di glicocano AFEX CSH è costantemente visibile a 24 ore.

Per iniziare questa procedura, striare ha selezionato scorte di glicerolo di colture di adattamento al peptone di malto di lievito, destrosio o agar YM. Quindi, dopo la crescita, utilizzare le striature per inoculare 50 microlitri di glicocano AFEX CSH al 3% o al 6% in ciascuno dei tre pozzetti per micropiastre. Incubare la micropiastra per 24 ore a 25 gradi Celsius.

Pool replica pozzi colonizzati alla massima forza di idrolizzato con una forte crescita. E piastra di diluizione in agar YM o 6% di glucano AFEX CSH. Incubare le piastre in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per 24-48 ore.

Scegli cinque colonie singole dalla piastra di diluizione più alta che mostra la crescita fino al congelamento come colture stock di glicerolo. Strisciare ogni colonia su una piastra YM e incubare per 24 ore. Con un anello sterile, trasferire una striscia sviluppata di cellule in un piccolo volume di glicerolo al 10% mescolato per sospendere le cellule e distribuirlo in due o tre criofile per il congelamento a meno 80 gradi Celsius.

Per testare gli isolati in semplici colture batch di AFEX CSH al 6% di glucano, trasferire le cellule da piastre di 48 ore striate da stock di glicerolo a tampone fosfato di potassio a pH 7 per preparare le sospensioni cellulari. Dopo aver misurato la densità ottica di ciascuna sospensione di celle, regolare il volume con un tampone aggiuntivo per raggiungere un A620 di dieci. Utilizzare un microlitro di ciascuna sospensione per inoculare ciascuno dei quattro pozzetti da 50 microlitri di idrolizzato di glucano al 3% a un A620 iniziale di 0,2.

Incubare la micropiastra per 24 ore. Successivamente, trasferire due pozzetti per micropiastre 24 ore su 24 per inoculare precolture da 25 millilitri di 6% di glucano AFEX CSH a pH 5. Chiudere i palloni con chiusure in spugna siliconica e incubare per 24 ore a 25 gradi Celsius e 150 RPM.

Utilizzare le precolture AFEX CSH al 6% di glucano per inoculare colture di crescita simili da 25 millilitri in duplicato con un A620 iniziale di 0,1. Incubare le colture di crescita per 24 ore a 25 gradi Celsius e 150 giri/min. Per testare la mancanza diossica di isolati in colture batch di terreno definito ottimale, o ODM, con zuccheri misti, inoculare precolture di 75 millilitri ODM con 150 grammi per litro di xilosio in fiasche da 125 millilitri con chiusure in spugna di silicone.

Incubare per 24 ore a 25 gradi Celsius e 150 giri/min. Utilizzare le precolture per inoculare in un A620 di 0,1 colture di prova duplicate simili da 75 millilitri con ODM contenenti 75 grammi per litro di glucosio e 75 grammi per litro di xilosio a pH 6,5. Agitare i palloni a 25 gradi Celsius e 150 giri/min.

24 ore prima dell'inoculazione di una coltura continua, preparare una precoltura di una colonia rappresentativa tollerante all'AFEX CSH in ODM senza etanolo in un pallone da 125 millilitri. Utilizzare da cinque a 10 millilitri di isolato tollerante AFEX CSH in precoltura per inoculare 100 millilitri di ODM in un pallone da 100 millilitri incamiciato per ottenere un A620 iniziale di 0,5. Mantenere il volume di raccolta della coltura a 25 gradi Celsius.

Mescolarlo a 200 giri/min e dotarlo di un elettrodo pH sterilizzabile, un regolatore di pH e un bagnomaria a circolazione controllata. Inizialmente, poiché la crescita cellulare sarà lenta a causa dell'esposizione all'etanolo, impostare una pompa azionata dal pH in modo che quando la fermentazione della coltura riduce il pH a 5,4, la pompa alimenterà il pH 6,3 ODM con 100 grammi per litro di xilosio e 50 grammi per litro di etanolo per fermare ulteriori diminuzioni del pH. Mantenere il volume a 100 millilitri con una pompa per effluenti che sfiora continuamente la superficie di coltura.

Misurare il volume degli effluenti raccolti e prelevare campioni da colture continue ogni 48-72 ore per l'analisi della concentrazione di cellule vitali, dei prodotti e dei substrati come descritto nel manoscritto. Risparmiate regolarmente le scorte di glicerolo isolando le colonie da piastre vitali di diluizioni di campioni tamponati che formano da 30 a 100 colonie, che rappresentano le colonie robuste più diffuse in quel momento in fase di arricchimento. Inondare le piastre con cinque millilitri di glicerolo al 10% per consentire la preparazione di criofile duplicati.

Se le colture possono crescere costantemente a velocità specifiche superiori a 0,01 all'ora con xilosio in presenza di più di 25 grammi per litro di etanolo, iniziare l'alimentazione continua della coltura a una bassa velocità di diluizione di circa 0,01 all'ora fino al volume di contenimento di 100 millilitri. Nel tempo, aumentare l'etanolo nel mangime fino a 50 grammi per litro. L'irradiazione ultravioletta degli inoculi per riavviare le colture continue è un'opzione per accelerare il tasso di mutazione.

Cattura le popolazioni avanzate negli stock di glicerolo. Prima di isolare le colonie di singole cellule, le popolazioni di glicerolo con una migliore fermentazione dello xilosio in presenza di etanolo, vengono identificate come descritto nel protocollo di testo. Usa queste popolazioni superiori per striare le piastre.

Le piastre striate vengono utilizzate per preparare sospensioni di celle tamponate dense di un A620 pari a cinque. Quindi le sospensioni cellulari vengono utilizzate per inoculare le precolture in 96 piastre a pozzetti profondi. Incubare per 48 ore a 25 gradi Celsius, 400 giri/min e un'orbita di un pollice.

Successivamente, arricchire le colonie tolleranti utilizzando ogni precoltura per inoculare 16 colture replicate da un millilitro a un A620 iniziale di 0,5 in liquore idrolizzato di panico verga pretrattato acido, miscelato uno a uno con ODM più 50 grammi per litro di xilosio e abbastanza etanolo per fornire una sfida di 20, 30 o 40 grammi per litro di etanolo. Incubare per 48 ore a 25 gradi Celsius, 400 giri/min e un'orbita di un pollice. Per ogni diverso stock di glicerolo, raccogliere i pozzetti di coltura con la più alta concentrazione di etanolo che consente la crescita e l'uso dello xilosio.

Placcare ogni linea cellulare in agar YM per ottenere singole colonie prevalenti da conservare in glicerolo. Prelevare 10 colonie per linea cellulare e applicare ciascuna a una piastra di agar YM per la preparazione del brodo di glicerolo. Dopo l'adattamento su AFEX CSH, un confronto delle prestazioni di fermentazione in ODM tra il ceppo parentale e le popolazioni adattate rivela che le popolazioni adattate utilizzano lo xilosio in modo più efficiente per produrre etanolo più rapidamente e in quantità più elevate.

Una colonia tollerante all'idrolizzato è stata ulteriormente sviluppata per migliorare la tolleranza all'etanolo mediante selezione continua della coltura su ODM contenente xilosio e alti livelli di etanolo. Tutte le popolazioni adattate hanno superato il genitore nella capacità di indurre il metabolismo dello xilosio in presenza di 40 grammi per litro di etanolo. Questi grafici riassumono le prestazioni degli isolati con tolleranza superiore valutate in termini di tassi di assorbimento dello xilosio e rese di etanolo rispetto al ceppo progenitore per ciascuna formulazione di PSGHL.

I migliori ceppi selezionati dallo screening primario su PSGHL ricco di xilosio sono stati successivamente sottoposti a screening su tre idrolizzati completi e l'indice di prestazione relativa, o RPI, è stato calcolato per la fermentazione di ciascun isolato all'interno di ciascun idrolizzato. Successivamente, sono stati calcolati gli indici di prestazione complessivi combinati per ciascun isolato. Cinque isolati, tre, 14, 27, 28 e 33, avevano RPI complessivi superiori a 60, il che li ha classificati come i più robusti per tutte le variazioni di idrolizzato e condizioni nutritive combinate.

Dopo aver visto questo video, dovresti sapere come sfidare un lievito in fermentazione xilosio come lo scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 in un processo di evoluzione mirato, arricchire, isolare e valutare derivati più robusti che fermentano più efficacemente gli zuccheri misti in idrolizzati non detossificati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata con un investimento di tempo giornaliero in media di circa un'ora al giorno. Cambiamenti significativi nel processo di evoluzione possono essere documentati in soli quattro mesi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante salvare regolarmente le popolazioni che avanzano preparando le scorte di glicerolo per congelarle a meno 80 gradi Celsius. Ciò consente il recupero della popolazione, la valutazione periodica, l'isolamento o il riavvio del processo evolutivo. Per gestire le varie mutazioni, ricordarsi di esaminare regolarmente il lievito in condizioni specifiche del processo per una serie di fenotipi.

Il calcolo degli indici di prestazione relativa adimensionali complessivi, o RPI, basati su parametri cinetici, consente di valutare il grado di ceppo, e la robustezza alle variazioni delle condizioni di fermentazione, come il tipo di idrolizzato e l'integrazione di nutrienti. I lieviti superiori derivanti da ogni fase del processo evolutivo sono candidati per il sequenziamento del genoma in modo che la natura dei miglioramenti, come la tolleranza agli inibitori, sia ridotta e il ritardo diossico possa essere compreso e utilizzato per la progettazione di ceppi biocatalitici di prossima generazione.