Name: Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Scopri un modello di coltura cellulare di trofoblasti villosi umani primari per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro lo stress ossidativo indotto da ipossia/riossigenazione.

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Sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (n. 262011-2009) a CV e dalla sovvenzione March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research (#12-FY12-179) a CV e JTS; da borse di studio a LSF dal Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) e dalla Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, a HC dal Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, ad AAHT dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e FRQ-Santé, e a JBP da NSERC; da una borsa di studio a EMAS del Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) e del Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Placente sono stati ottenuti immediatamente dopo parto vaginale spontaneo da gravidanze complicate al CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canada, con consenso informato del paziente e l&#39;approvazione dei comitati etici (CHUM-St-Luc Hospital e INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada). 1. isolamento e la purificazione delle cellule dei villi citotrofoblasto <ol><li> Soluzioni e supporti <ol><li> Preparare mezzi di trasporto, completandolo Dulbecco Modified Eagle Medio Alto-glucosio (DMEM-HG) con 1% vol / vol antibiotico (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare terreni di coltura primaria, completandolo DMEM-HG con il 10% vol / vol siero fetale bovino (FBS), 25 mM 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% vol / vol antibiotici (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) e conservare a 4 ° C. mezzi Riscaldare a 37 ° C primauso. </li><li> Preparare 4 L di soluzione salina (0,9% di cloruro di sodio in peso / vol). </li><li> Preparare modificato soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con l&#39;aggiunta di 25 mM HEPES a 1x HBSS (pH 7,4). </li><li> Preparare freschi, quattro bottiglie di soluzione di digestione con HBSS modificato (preparato in 1.1.4), solfato di magnesio (MgSO 4), cloruro di calcio (CaCl 2), tripsina, deossiribonucleasi IV (DNasi IV), e 1% vol / vol antibiotico ( 10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato) come mostrato in Tabella 1. </li><li> Preparare la densità dei media centrifugazione in gradiente <ol><li> Preparare la densità centrifugazione soluzione multimediale completandola mezzi centrifugazione densità con 10% vol / vol HBSS 10x. </li><li> Preparare 14 provette con soluzione supporti densità centrifugazione e modificato HBSS, come descritto nella Tabella 2. </li><li> Mescolare ogni soluzione densità (passo 1.1.6.2) vigorosamente prima di aggiungere il suo contenuto al gradiente. Delicatamenteaggiungere le soluzioni densità a 50 ml tubo di vetro con una pompa peristaltica (1 ml / min), che inizia con la più alta concentrazione (70%). Evitare goccioline drenando le soluzioni contro la parete del tubo per mantenere la corretta separazione di ogni strato del gradiente. <ol><li> In assenza di una pompa peristaltica, applicare gli strati molto delicatamente con pipette Pasteur. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare tampone di corsa finale completando il tampone di corsa (vedi Tabella dei Materiali) con il 2% vol / vol antibiotico / antimicotico (10.000 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina solfato). Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Villi isolamento citotrofoblasto Nota: utilizzare sterile chirurgica attrezzature, vetreria, pipette, flaconi, ecc <ol><li> Il giorno di isolamento citotrofoblasto villi, a bagnomaria C 37 °, riscaldare le soluzioni digestioni (dal punto 1.1.5) e 70 ml di FBS. Nota: Usare 50 ml di FBS per interrompere la digestione e larestante 20 ml per la fase di congelamento (1.2.22), che possono essere immessi sul ghiaccio, una volta scongelati. </li><li> Dopo la consegna, portare la placenta al laboratorio in terreno di trasporto ghiacciata (dal punto 1.1.1) il più rapidamente possibile (meno di 1 ora). </li><li> mezzo di trasporto degli scarti e del sangue placentare in pattumiera liquido. Pesare la placenta ed immergerlo in soluzione salina fredda. </li><li> Misurare e analizzare le seguenti caratteristiche: lunghezza del cordone ombelicale; localizzazione cordone ombelicale; lunghezza placentare, la larghezza, la forma (ovale, discoide); colore membrana; patologie struttura cotyledon. Nota: I dati sono presentati nella sezione risultati. </li><li> Tagliare il cordone ombelicale al fianco il suo inserimento placentare (vale a dire, alla sua base, con un ulteriore 1 cm di raggio cerchio intorno al cavo). Immergere in 300 ml di soluzione di tessuto fissativo istologico (formalina al 10%) per l&#39;analisi istologica successiva. </li><li> Tagliare l&#39;intera placenta a cubetti di 5 x 5 x 5 cm. Lavare accuratamente (4 volte x ~ 1 min) in sol salinaution (0,9%) per rimuovere le cellule del sangue fino soluzione salina è chiara. Eliminare il risciacquo liquido. </li><li> In un vetro da orologio, rimuovere membrane placentari e tessuti trito per rimuovere i vasi sanguigni e calcificazioni. Tenere i vasi sanguigni saldamente con una pinza e rimuovere i tessuti utilizzando la parte posteriore di forbici Metzenbaum. <ol><li> Mettere placenta tritato in un imbuto Büchner. Risciacquare con circa 100 ml di soluzione salina tampone. Continuare a tritare fino 30 - 35 g di tessuto tritato si ottiene (l&#39;uso di plastica barca e bilancia). Se necessario, tritare il resto della placenta avere fino a tre ulteriori 30 - preparazioni 35 g. Durante questo tempo, mettere dei tessuti macinata in una barca pesata su ghiaccio. Nota: Questo passo ci vorranno circa 45 minuti a 1 ora. </li></ol></li><li> Aggiungere il 30 - 35 g di tessuto placentare macinata in un pallone trypsinizing. Transfer 150 ml del preparato di digestione soluzione 1 (tabella 1) al pallone trypsinizing e mescolare bene. </li><li> Porre il pallone in trypsinizingun bagno d&#39;acqua agitando per 30 minuti ad una velocità di non più di 50 cicli / min e miscelare manualmente la beuta trypsinizing ogni 5 minuti per la digestione omogenea. </li><li> Alla fine del primo digestione, rimuovere il matraccio trypsinizing dal bagno e inclinarlo (45 °) per 1 min per sedimentare il tessuto placentare. Con un 10 ml pipetta sterile, rimuovere ed eliminare circa 80 ml di surnatante. Evitare di aspirare il tessuto. </li><li> Trasferire 100 ml di soluzione di digestione 2 (Tabella 1) al pallone trypsinizing; mescolare bene e ripetere il punto 1.2.9. </li><li> Alla fine della seconda digestione, rimuovere il matraccio trypsinizing dal bagno e inclinarlo 45 ° per 1 min. Con un 10 ml pipetta sterile, rimuovere 80 ml surnatante e trasferire delicatamente per un tubo da centrifuga con un colino cella (100 mesh micron). Trasferire il surnatante filtrato in un becher contenente 2 ml di FBS ogni volta la provetta è pieno. </li><li> Eseguire il terzo digestione come descritto per ilsecondo la digestione (1.2.11 e 1.2.12) con 75 ml di soluzione di digestione 3. In parallelo, eseguire i passaggi 1.2.15 a 1.2.16.1 per la digestione 2. </li><li> Eseguire il quarto digestione identico al terzo digestione con la soluzione di digestione 4 (75 ml), ma raccogliere una quantità massima di surnatante. Eseguire le operazioni da 1.2.15 a 1.2.16.1 in parallelo per la digestione 3, e, infine, per la digestione 4. </li><li> Aliquotare il surnatante (da digestioni 2, 3 e 4) in 13,5 ml parti, ciascuna parte in una provetta da centrifuga da 15 ml. Con una lunga 22,8 cm pipetta Pasteur di vetro, molto delicatamente e lentamente posizionare 1,5 ml di FBS al fondo di ogni tubo in modo da creare uno strato separato. Non mescolare FBS e surnatante. Centrifugare i tubi senza freno per 20 min a 1250 xga temperatura ambiente. Nota: Dopo centrifugazione, 4 strati sono visibili nel tubo, come mostrato nella Figura 1 La separazione delle cellule tripsina e trofoblasto evita eccessivo digestione cellulare.. </li><li> Con una pompa a vuoto, aspirmangiato e scartare il surnatante (soluzione digestione) e strati FBS, tra cui la pellicola biancastra tra i due strati. Risospendere il pellet (i trophoblasts e strati di globuli rossi) con 1 ml di mezzo di coltura cellulare calda (fase 1.1.2, senza FBS e senza HEPES). <ol><li> Raccogliere cellule risospese da tutte le provette e combinarli in 1 tubo. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino alla fine di tutte digestioni. Nota: Dopo tutte le digestioni, il rendimento abituale è di 3 tubi di cellule risospese (uno per la digestione). </li></ol></li><li> Portare al volume di 15 ml con mezzo di coltura cellulare caldo. Centrifugare a 1250 xg per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto. Evitare di aspirare il pellet. </li><li> Risospendere delicatamente il pellet ottenuto dalle 3 tubi con 1 ml di Abbastanza caldo coltura cellulare. In comune il loro contenuto in 1 tubo. Per ottenere 8 ml, completare il volume con il mezzo di coltura cellulare caldo. </li><li> Molto strato delicatamente la sospensione cellulare su un grad di separazioneiente con una pipetta Pasteur. Centrifugare senza freno per 30 min a 507 xg a temperatura ambiente. </li><li> Dopo centrifugazione, identificare i diversi strati di cellule in gradiente con retroilluminazione. Individuare gli strati che contengono trofoblasto e contaminanti cellule tra il 40 - 50% di media densità centrifugazione. Con una pompa a vuoto, rimuovere gli strati superiori (&gt; 50%). </li><li> Raccogliere le cellule situate negli strati di interesse con una pipetta Pasteur e trasferirli in una provetta da centrifuga da 50 ml. Portare al volume di 50 ml con terreno di coltura cellulare. Centrifugare per 10 minuti a 1250 xg a temperatura ambiente. </li><li> In condizioni sterili, scartare il surnatante, risospendere il pellet con 20 ml di FBS e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Sul ghiaccio, aggiungere 2,22 ml di dimetilsolfossido sterile (DMSO) e mescolare delicatamente spostando. Aliquotare 1,5 ml di sospensione cellulare in fiale criogeniche, congelare una notte a -80 ° C e trasferire ad un serbatoio di azoto liquido. </li></ol></li> &lt;li&gt; purificazione Trofoblasto <ol><li> Installare il risciacquo e buffer in esecuzione e una nuova colonna di filtro sullo strumento di purificazione magnetica in base alle istruzioni del produttore. Eseguire il programma &quot;pulito&quot; per pulire negativi porte 1, positivo 1 e positivo 2, e quindi introdurre i tubi da 50 ml sotto ogni porta secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Scongelare le cellule che sono stati congelati in passaggio 1.2.22 rapidamente in un bagno di acqua C 37 °. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e risospendere le cellule delicatamente con 20 ml di soluzione tampone fredda corrente. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 450 xg e 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio con tampone fredda corrente. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare la vitalità. Ripetere la centrifugazione (per 5 min, 450 xga 4 ° C). rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 1 ml di tampone fredda contenente 1% vol / vol di topo anticorpi anti-HLA-ABC. Incubare a 4 ° C per 30 min, mixing delicatamente ogni 5 minuti. </li><li> Aggiungere 6 ml di tampone fredda corrente. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e ripetere questo passaggio. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone fredda contenente 10% vol / vol di anti-topo sfere magnetiche anticorpi accoppiati secondarie. Incubare a 4 ° C per 15 minuti, mescolando delicatamente ogni 5 min. </li><li> Aggiungere 6 ml di tampone fredda corrente. Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere in 5 ml di tampone fredda corrente. </li><li> Separare le cellule del trofoblasto utilizzando lo strumento di purificazione magnetica. Raccogliere cellule al porto negativo e aggiungere 20 ml di tampone fredda. Nota: cellule del trofoblasto non contengono il complesso HLA-ABC, e sono quindi separati da altri tipi di cellule e diretti verso il porto 1 negativo. </li><li> Centrifugare per 5 min a 450 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 20 ml di caldo terreno di coltura primaria. Contare le cellule usinga emocitometro per determinare la vitalità. </li><li> Piastra le cellule ai seguenti densità: 0.15 x 10 6 cellule / pozzetto in piastre a 96 pozzetti, 1,6 x 10 6 cellule / pozzetto in piastre da 24 pozzetti e 4,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 6 pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Confermare la purezza delle cellule del trofoblasto mediante citometria di flusso 16,17 e / o immunocitochimica 18. Nota: La purezza delle cellule immunopurified è stato determinato utilizzando anticorpi monoclonali coniugati FITC-contro-citocheratina 7 e vimentina 17-19. Questo protocollo è ben dettagliata in Lanoix et al., 2008 7. </li><li> Dopo almeno 4 ore, lavare le cellule due volte con mezzo di coltura calda per rimuovere le cellule senza legami e poi trasferire le piastre alla camera normoxia, che è composta da 8% O 2 (vedi figura 2 e la sezione 2). </li></ol></li></ol> 2. In Vitro installn di normossia e ipossia / riossigenazione <ol><li> Il funzionamento della camera Incubator (vedi Figura 2A per il set-up). <ol><li> In una cappa a flusso laminare, collocare un piatto Petri contenente acqua sterile sul fondo della camera di incubazione per evitare secchezza; quindi posizionare le piastre o fiaschi (step 1.3.10) di coltura cellulare precedentemente preparati sugli scaffali superiori della camera. </li><li> All&#39;esterno della cappa, collegare la camera (porta di ingresso) al tubo di gas (Figura 2A: 5a, b, c) per raggiungere il tubo di gas (8% O 2 o 0,5% O 2) (Figura 2A: 7). Aprire entrambe le porte di entrata e di uscita della camera. In questo momento, il regolatore del gas (Figura 2A: 4) dovrebbe rimanere chiuso. </li><li> Aprire con cautela la valvola di regolazione del gas (Figura 2A: 4). Flush per 4 minuti con un flusso di aria di 25 L / min per sostituire completamente l&#39;aria all&#39;interno della camera. </li><li> Dopo il lavaggio della camera, chiudere il regolatore del gas poi l&#39;ingresso e l&#39;UOporti tlet della Camera. </li><li> Scollegare il tubo di scarico flussometro (Figura 2A: 5c) dalla porta di ingresso della camera e posizionare la camera in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. </li><li> Sostituire l&#39;aria attualmente presenti nelle piastre, flaconi e disciolto nel mezzo di coltura riempiendo la camera a gas 1 ora dopo passo 2.1.3. </li><li> Ripetere i punti da 2.1.1 a 2.1.6 per le altre composizioni del gas (ad esempio, 2% O 2 per il primo trimestre cultura trofoblasto 9). </li></ol></li><li> Confermare la percentuale di ossigeno (Figura 2B-C) <ol><li> Per confermare la concentrazione di ossigeno nel terreno di coltura cellulare (senza cellule) all&#39;interno della camera, utilizzare un elettrodo di ossigeno collegato ad un adattatore di ossigeno. Collegare l&#39;elettrodo ossigeno ad un voltmetro. </li><li> Creare una curva di calibrazione nella stessa soluzione (cioè, coltura cellulare medium) esponendo la soluzione ai gas con un contenuto di ossigeno noto (ad esempio, 0% e21% di ossigeno). Dopo le letture sono stabilizzare per ciascuna concentrazione, introdurre l&#39;elettrodo nel mezzo della camera. Nota: prendere tutti misura alla stessa profondità in modo da evitare qualsiasi distorsione della concentrazione di ossigeno 10. </li></ol></li><li> Induzione di normossia e ipossia / riossigenazione in trophoblasts. <ol><li> Dopo l&#39;aggiunta di cellule del trofoblasto primarie alle appropriate fiasche di coltura cellulare, piatti o piastre Petri, effettuare trattamenti come necessarie. </li><li> Parallelamente, all&#39;interno della camera, esporre le cellule per la miscela di gas desiderata per riprodurre una condizione specifica ogni 24 ore (Figura 3). </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nei mammiferi, lo sviluppo fetale è direttamente dipendente adeguata funzione placentare. Le origini dello sviluppo di disturbi di salute sono basate sull&#39;ipotesi che la causa delle malattie che si manifestano più tardi nella vita può essere fatta risalire al primo sviluppo e che la placenta ha un ruolo meccanicistico nella programmazione fetale 30-32. La placenta è il mediatore chiave della crescita e lo sviluppo fetale: regola il trasferimento dei nutrienti, protegge contro le esposizioni dannose, e ha ...

Nel corso della gravidanza umana, le cellule placentari citotrofoblasto, che sono le cellule staminali mononucleate, rapidamente proliferano e si differenziano in cellule sia citotrofoblasto villi o extravilloso. citotrofoblasti extravilloso invadono e rimodellano le arterie a spirale della parete uterina. Cytotrophoblasts villi, invece, continuano a proliferare, differenziare e fusibile per formare syncytiotrophoblast multinucleate (il sincizio) 1. Il mantenimento della omeostasi dei villi trofoblasto è essenziale per il benessere fetale e gravidanza sana. In realtà, trophoblasts villi consentono lo scambio materno-fetale di ossigeno e nutrienti, e producono ormoni essenziali per la gravidanza. Inoltre, il syncytiotrophoblast è l&#39;unico tipo cellulare in diretto contatto con la circolazione del sangue materno e fornisce una barriera fisica e immunologica essenziale. Pertanto, il sinciziotrofoblasto deve subire apoptosi e la sostituzione per la manutenzione omeostatico e di AVOid placentare patologie 2-5. La tecnica sviluppata da Kliman et al. 6 nel 1986 per isolare citotrofoblasti villi primari da placenta umana ha causato una rivoluzione nel campo della ricerca placentare, consentendo lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella differenziazione dei villi trofoblasto. Questa tecnica classica, sulla base di digestioni enzimatiche sequenziali con tripsina e DNasi, seguita da isolamento nei media densità centrifugazione (particelle di silice colloidale rivestito da polivinilpirrolidone, o Percoll) è ormai riconosciuto come il gold standard per isolare le cellule citotrofoblasto villi. La tecnica può essere ottimizzata immunopurificazione magnetica, una procedura che separa cytotrophoblasts villi da cellule non trofoblastiche basati sull&#39;espressione differenziale di antigeni specifici sulla superficie di queste cellule. Abbiamo scelto l&#39;antigene leucocitario umano ABC (HLA-ABC) per l&#39;assenza della sua espressione sulla membran cellulare trofoblasticae 7,8. La placenta è un organo che subisce drammatiche variazioni nei livelli di ossigeno durante la gravidanza. Nel primo trimestre, il rapporto di ossigenazione è fisiologicamente molto bassa (2% O 2), ma aumenta a livelli lievi di ossigenazione (8% O 2) nel secondo e terzo trimestre. Tuuli et al. 9 descritto che la riproduzione in vitro dell&#39;ambiente trofoblasto all&#39;interno del villi della placenta è una sfida e le variazioni dei livelli di ossigenazione può anche portare a cambiamenti fenotipici. È pertanto suggerito di adottare dell&#39;8% ossigeno come normossia per imitare la tensione di ossigeno trovato in villi placentari durante il terzo trimestre di gestazione 8,9. Chen et al. 10 ampiamente studiato diverse variabili legate alla tensione di ossigeno nelle cellule in coltura trofoblasto e dimostrato l&#39;importanza di determinare i livelli di ossigeno in un ambiente pericellulare. I livelli di ossigeno nei villi tendono ad aumentarea causa di vasculogenesi. Il flusso di sangue placentare villi aumenta costantemente e il livello di perossido di idrogeno (un&#39;abbondante specie reattive) è un segnale importante che controlla vasculogenesi 11,12. In complicazioni della gravidanza, la mancanza di vasculogenesi genera ipossia, e ancora più importante, le variazioni intermittenti di ossigenazione (chiamato ipossia / riossigenazione). Queste condizioni portano ad un aumento anomalo stress ossidativo, che compromette placentare e fetale 13,14 vitalità. Le alterazioni che le cellule del trofoblasto subiscono in vivo durante gli episodi di ipossia / riossigenazione possono essere imitate in vitro come segue: citotrofoblasti villi sono mantenute in condizioni di normossia (8% O 2) fino a quando non si differenziano in sinciziotrofoblasto. Essi vengono quindi sottoposti a condizioni di ipossia (0,5% O 2) per 4 ore, seguito da un ulteriore 18 ore di normossia (riossigenazione). Usando questo approccio ipossia / riossigenazione, trofoblasto exvietare liberalizzato stato redox e aumento dei livelli di apoptosi intrinseca 8, come è stato osservato in alcune complicazioni durante la gravidanza. Quindi, questo è un utile modello in vitro per valutare nuovi approcci preventivi e terapeutici per combattere le complicazioni della gravidanza associate a ipossia placentare / riossigenazione. Cellule placentari producono melatonina, che ha diverse funzioni importanti, come la capacità di ovviare stress ossidativo e disfunzione placentare 15. Qui, presentiamo i modelli di approccio e cellulari sperimentali utilizzate per dimostrare gli effetti protettivi della melatonina in cellule del trofoblasto placentare a livello molecolare, cellulare e funzionale 8.

<table><tbody><tr><td>Forbici Metzenbaum curve</td><td>Attrezzatura chirurgica Shandon</td><td>9212</td><td>(isolamento cellulare) (2 unità)</td></tr><tr><td>Pinze per schegge Fine 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>attrezzatura chirurgica (isolamento cellulare) (2 unità)</td></tr><tr><td>Forbici 4,5 Str Dissezione</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>attrezzatura chirurgica (isolamento cellulare) (2 unità)</td></tr><tr><td>Spugna di garza 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>Teglia in vetro oblungo</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>vetreria (2,8 L)</td></tr><tr><td>Imbuto Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Vetreria (diametro 114 mm)</td></tr><tr><td>Orologio in vetro&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Vetreria</td></tr><tr><td>Soluzione di formalina, tamponata neutra, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>soluzione fissativa istologica tissutale</td></tr><tr><td>Palloni di tripsinizzazione</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>vetreria (1 unità)</td></tr><tr><td>Provette di coltura monouso</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Vetreria</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato Pasteur Pipet (22,8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>vetreria</td></tr><tr><td>Bicchieri di vetro da 250 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>Glassware</td></tr><tr><td>Flaconi di vetro con tappo</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>vetreria (8 unità)</td></tr><tr><td>Tubo Corex da 50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td> <td>(1 unità)</td></tr> <tr><td>Provetta da centrifuga in polistirene da 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga in polistirene da 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &mu; m Nylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Fodera assorbente</td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp; Bottiglie da ml Filtro superiore</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore: 0,22 &micro; m / medium e preparazione HBSS</td></tr><tr><td>Fiale criogeniche da 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>modello</td><td></td>P3</tr><tr><td>Agitazione Bagno d'acqua</td><td>Fisher</td><td>modello 127</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Soluzione salina 0,9%</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina tamponata (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Quantità: 9,25 (una fiala) per 1 L di soluzione di digestione</td></tr><tr><td>Acido idrossipiperazineetansulfonico (Hepes)</td><td><a name="RANGE! B29">Life Technologies</A></td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) per 1 L di soluzione digestiva</td></tr><tr><td>Tripsina Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9.888 U</td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi Tipo IV</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402.000 U</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato Glucosio medio alto (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina solfato</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Corning</td><td></td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Gradiente di terreni di centrifugazione a densità. Volume: 36 ml</td></tr><tr><td>di isopropanolo</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>di dimetilsolfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>separatore magnetico Automacs.</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Modello 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Colonne&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Running Buffer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Clone purificato Hla Abc anti-umano W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>anticorpo anti-topo</td></tr><tr><td>Microsfere Igg anti topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr> piastra <tr><td>a pozzetti multipli -&nbsp; 6 pozzetti con Coperchio</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Superficie di rilegatura delle celle</td></tr><tr><td>Piastra a pozzetti multipli -&nbsp; 24 pozzetti con coperchio</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Superficie di rilegatura delle celle</td></tr><tr><td>Piastra a pozzetti multipli -&nbsp; 96 pozzetti con coperchio</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Superficie di rilegatura delle celle</td></tr><tr><td>Camera dell'incubatore modulare&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Un set di due è necessario per generare simultaneamente condizioni di normossia e ipossia/riossigenazione</td></tr><tr><td>Misuratore di portata singolo</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Filtro in linea</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, pore: 1,0 &; m</td></tr><tr><td>Regolatore di gas</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>È necessario un set di due per generare simultaneamente condizioni di normossia e ipossia/riossigenazione</td></tr><tr><td>Tubo del gas Classe Vi Trasparente 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 pezzi con ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Regolabile Tubo del gas</td><td>Fascetta Tiewraps</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Bombola di gas Normoxia&nbsp;</td>Composizione del trimestre <td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Taglia K (3rd: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Bombola di gas Normoxia&nbsp;</td>Composizione del trimestre <td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Taglia K (3rd: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Microelettrodo di ossigeno Microelettrodi Mi-730</td><td>Microelettrodi Adattatore di ossigeno INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Reagente</td> di rilevamento ROS INC <td>3572</td><td></td></tr><tr><td>: CM-H2DCFDA&nbsp;</td>Kit ELISA <td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-hCG&nbsp;</td><td>DRG internazionale</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo purificato anti-vimentina</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Ospite:</td></tr><tr><td>anticorpo anti-citocheratina 7 (FITC) di topo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Ospite: mouse</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra Anti-mousse IgG H& Anticorpo L</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

umana trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione disruption-indotta

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Questo protocollo descrive come le cellule villose del citotrofoblasto vengono isolate dalla placenta a termine mediante successive digestioni enzimatiche, seguite da centrifugazione per densità, isolamento del gradiente di terreno e purificazione immunomagnetica. Come osservato in vivo, le cellule villose mononucleate di citotrofoblasto in coltura primaria si differenziano in cellule multinucleate di sinciziotrofoblasto dopo 72 ore. Rispetto alla normossia (8% O2), le cellule villose del citotrofoblasto che subiscono ipossia/riossigenazione (0,5% / 8% O2) subiscono un aumento dello stress ossidativo e dell'apoptosi intrinseca, simile a quello osservato in vivo nelle complicanze della gravidanza come la preeclampsia, il parto pretermine e la restrizione della crescita intrauterina. In questo contesto, i trofoblasti villosi primari coltivati in condizioni di ipossia/riossigenazione rappresentano un sistema sperimentale unico per comprendere meglio i meccanismi e le vie di segnalazione che sono alterati nella placenta umana e facilitare la ricerca di farmaci efficaci che proteggano da alcuni disturbi della gravidanza. I trofoblasti villosi umani producono melatonina ed esprimono i suoi enzimi e recettori sintetizzanti. La melatonina è stata suggerita come trattamento per la preeclampsia e la restrizione della crescita intrauterina a causa dei suoi effetti antiossidanti protettivi. Nel modello di cellule primarie di citotrofoblasto villoso descritto in questo articolo, la melatonina non ha alcun effetto sulle cellule del trofoblasto allo stato normossico, ma ripristina l'equilibrio redox delle cellule di sinciziotrofoblasto interrotte da ipossia/riossigenazione. Pertanto, le cellule del trofoblasto villoso umano in coltura primaria sono un approccio eccellente per studiare i meccanismi alla base degli effetti protettivi della melatonina sulla funzione placentare durante l'ipossia/riossigenazione.

Isolamento e immunopurificazione di cellule citotrofoblasto villi da una normale placenta termine ottenuti da parto vaginale ha prodotto 1 x 10 8 cellule vitali. La placenta pesava 350 g, era di 19 cm di diametro, 4 cm di altezza con forma discoidale e le membrane trasparenti. è stata rilevata alcuna cotyledon malformazione. Il cordone ombelicale aveva localizzazione paracentrale e una lunghezza di 56 cm. La purezza è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando vim...

Questo manoscritto presenta un modello unico in vitro di cellule di citotrofoblasto villoso umano immunopurificate coltivate in ipossia/riossigenazione. Questo modello è adatto per studiare gli effetti protettivi di trattamenti promettenti, come la melatonina, sulle complicanze della gravidanza associate all'aumento dello stress ossidativo e all'alterazione della funzione placentare.

Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare gli effetti protettivi della melatonina utilizzando cellule primarie di citotrofoblasto villifero umano immuno-purificate, coltivate in condizioni di ipossia o riossigenazione. Questo metodo può contribuire a comprendere i meccanismi e le vie di segnalazione associate alle complicanze della gravidanza in presenza di placenta sottoposta a ipossia e riossigenazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si presta allo studio di trattamenti promettenti, come la melatonina, nei disturbi della gravidanza associati a un aumento dello stress ossidativo.Generalmente, chi è alle prime armi con questo metodo avrà difficoltà con i passaggi di isolamento dei citotrofoblasti villiferi, come il trinciamento dei tessuti e la preparazione del gradiente mediano per la centrifugazione in densità. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui trofoblasti del terzo trimestre, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la placenta del primo trimester e la placenta di altre specie. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché molti passaggi sono difficili da apprendere senza osservarli direttamente; ciò aumenta la riproducibilità e riduce il tempo di apprendimento.La procedura sarà dimostrata dalle studentesse laureate Andree-Anne Hudon-Thibeault e Philippe Wong Yen e da Eugenia Assuncao del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, tagliare il cordone ombelicale lungo il suo punto di inserzione placentare e conservarlo in 300 ml di soluzione fissativa per tessuti per l'analisi istologica. Successivamente, tagliare l'intera placenta in cubetti.Lavare ripetutamente i cubetti in soluzione salina per rimuovere le cellule sanguigne finché la soluzione salina non diventa limpida. Successivamente, rimuovere le membrane placentarie e tritare i tessuti per eliminare ulteriormente i vasi sanguigni e consentire le calcificazioni. Quindi afferrare saldamente i vasi sanguigni con una pinzetta ed eliminare i tessuti tritati.Successivamente, collocare la placenta tritata in un imbuto di Buchner e risciacquare i tessuti con 100 ml di soluzione salina tampone. Continuare il tritamento fino a ottenere da 30 a 35 grammi di tessuti tritati e posizionarli su un contenitore per pesatura posto sul ghiaccio. In seguito, aggiungere i tessuti placentari tritati a un matraccio per tripsinizzazione.Successivamente, trasferire 150 ml della soluzione di digestione preparata 1 nel flacone per la tripsinizzazione e mescolare accuratamente. Posizionare il flacone per la tripsinizzazione in un bagnomaria agitato per 30 minuti e mescolare manualmente il flacone ogni cinque minuti per omogeneizzare la digestione. Al termine della prima digestione, rimuovere il flacone per la tripsinizzazione dal bagnomaria e inclinarlo di 45 gradi per un minuto al fine di sedimentare i tessuti placentari.Con una pipetta sterile da 10 ml, rimuovere e scartare circa 80 ml di sopranatante senza aspirare il tessuto. Successivamente, trasferire 100 ml della soluzione di digestione 2 nel flacone per la tripsinizzazione e mescolare accuratamente. Posizionare il flacone per la tripsinizzazione in un bagnomaria agitato per 30 minuti e mescolare manualmente il flacone ogni cinque minuti per garantire una digestione omogenea.Al termine della seconda digestione, rimuovere la fiala con tripsina dal bagnomaria e inclinarla di 45 gradi per un minuto. Rimuovere 80 ml di sopranatante e trasferirli delicatamente in un tubo da centrifuga utilizzando un filtro cellulare con maglia da 100 micrometri. Eseguire la terza e la quarta digestione ed aliquotare il sopranatante delle digestioni due, tre e quattro in porzioni da 13,5 ml nei tubi da centrifuga da 15 ml.Quindi, aggiungere delicatamente e lentamente 1,5 ml di FBS sul fondo di ogni tubo in modo da creare uno strato separato. Centrifugare i tubi per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare e scartare gli strati di supernatante e FBS, inclusa la pellicola biancastra tra i due strati.Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di coltura cellulare tiepido. Raccogliere le cellule risospese da tutti i tubi e combinarle in un unico tubo per ogni digestione. Successivamente, portare il volume a 15 ml con mezzo di coltura cellulare tiepido.Centrifugare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il soprannatante con una pompa a vuoto ed evitare di aspirare il pellet. Dopo di ciò, risospendere delicatamente il pellet con 1 ml di mezzo di coltura cellulare tiepido.Unire il contenuto dei tubi di tutte le digestioni. Aggiungere ulteriore mezzo di coltura cellulare tiepido per ottenere un volume di 8 ml. Successivamente, stratificare delicatamente la sospensione cellulare su un gradiente di separazione e centrifugare per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, identificare i diversi strati cellulari nel gradiente mediante retroilluminazione. Individuare gli strati contenenti i trofoblasti e le cellule contaminanti tra il 40% e il 50% del mezzo di centrifugazione in densità e rimuovere gli strati superiori con una pompa a vuoto. Successivamente, raccogliere le cellule localizzate negli strati di interesse e trasferirle in un tubo da centrifuga da 50 ml.Portare il volume a 50 ml con il mezzo di coltura cellulare e centrifugare per 10 minuti a temperatura ambiente. In condizioni sterili, scongelare rapidamente le cellule congelate al passaggio 1.2.22 in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Trasferire le cellule scongelate in una provetta da 50 ml e risospendere delicatamente con 20 ml di tampone di lavaggio freddo.Successivamente, centrifugare il tubo per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Eliminare il soprannatante e ripetere il passaggio di lavaggio con tampone di lavaggio freddo. Quindi, contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinarne la vitalità, seguito da una nuova ripetizione della centrifugazione.Successivamente, rimuovere con attenzione il soprannatante e aggiungere 1 ml di buffer di corsa freddo contenente 1% in volume/volume di anticorpo anti-HLA ABC di topo alle cellule. Incubare le cellule a 4 gradi Celsius per 30 minuti, mescolando delicatamente ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 6 ml di buffer di corsa freddo e centrifugare per 5 minuti a 4 gradi Celsius.Eliminare il soprannatante e ripetere questo passaggio. Quindi, risospendere le cellule in 1 ml di buffer di lavaggio freddo contenente il 10% in volume di microsferette magnetiche coniugate con anticorpo secondario anti topo. Successivamente, incubare le cellule a 4 gradi Celsius per 30 minuti, mescolando delicatamente ogni 5 minuti.Successivamente, aggiungere 6 ml di buffer di corsa freddo e centrifugare per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in 5 ml di buffer di corsa freddo. Successivamente, separare le cellule trofoblastiche utilizzando lo strumento di purificazione magnetica e raccogliere le cellule al bocchello negativo.Aggiungere 20 ml di buffer di lavaggio freddo alle cellule e centrifugare per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente le cellule in 20 ml di mezzo caldo per colture cellulari primarie contenente il 10% di FBS, quindi contare le cellule per determinare la vitalità. A questo punto, seminare le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.Dopo almeno quattro ore, risciacquare le cellule due volte con mezzo di coltura tiepido per rimuovere le cellule non aderenti. Successivamente, trasferire le piastre nella camera di normossia, che verrà riempita con una miscela di 8% O2. All'esterno della cappa, collegare il bocchello di ingresso della camera al tubo del gas per raggiungere il flusso di gas.Aprire entrambe le valvole di ingresso e di uscita della camera e mantenere chiuso il regolatore del gas. Successivamente, aprire con attenzione la valvola del regolatore del gas ed eseguire una purga con un flusso d'aria di 25 litri al minuto per 4 minuti, in modo da sostituire completamente l'aria all'interno della camera. Dopo la purga, chiudere il regolatore del gas, seguito dalle valvole di ingresso e di uscita della camera.Scollegare il tubo dell'uscita del flussimetro dalla porta di ingresso della camera e posizionare la camera in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per un'ora. Sostituire l'aria attualmente presente nelle piastre, nei flaconi e disciolta nel mezzo di coltura ricaricando la camera con gas a una portata di 25 litri al minuto per 4 minuti. Questa figura mostra l'effetto della melatonina sulla secrezione di gonadotropina corionica umana beta durante la differenziazione del trofoblasto villare.La differenziazione biochimica dei citotrofoblasti villosi in sinciziotrofoblasti è stata determinata dall'aumento dei valori di gonadotropina corionica umana beta, che hanno raggiunto un valore massimo dopo 72 ore di coltura cellulare, come mostrato in questo caso. Il trattamento con melatonina non ha avuto alcun effetto sulla differenziazione dei citotrofoblasti coltivati in presenza di 8% di ossigeno rispetto al controllo con veicolo. Qui viene mostrato l'effetto della melatonina a 1 millimolare sui livelli intracellulari di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule di sinciziotrofoblasto in condizioni di normossia o dopo riossigenazione indotta da ipossia, a seguito di 72 ore di coltura.Il trattamento con melatonina protegge i sinciziottrofoblasti dallo stress ossidativo aumentato indotto dalla ipossia-riossigenazione, ripristinando i livelli di specie reattive dell'ossigeno a quelli della normossia. Questo schema illustra gli ampi effetti protettivi intracellulari della melatonina contro lo stress ossidativo indotto da ipossia-riossigenazione e l'apoptosi mitocondriale nei sinciziottrofoblasti primari. Una volta padroneggiata, la tecnica di isolamento può essere eseguita in otto ore, e sono sufficienti tre ore per ottenere cellule trofoblastiche purificate se eseguita correttamente.Dopo il suo sviluppo, la tecnica di isolamento, purificazione e coltura primaria di citotrofoblasti in condizioni di ipossia-riossigenazione ha aperto la strada a una migliore comprensione delle complicanze legate alla gravidanza e al miglioramento della salute placentaria e fetale. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di valutare la purezza delle cellule trofoblastiche villose al termine della purificazione immuno-mediata. Ad esempio, mediante citometria a flusso.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare un citotrofoblasto villare primario immuno-purificato e coltivarlo in condizioni di ipossia-riossigenazione.

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