Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all'età o malattie metaboliche

L'obiettivo generale di questo modello è quello di studiare come la rigidità e lo spessore della membrana basale, dovuti alla glicazione avanzata e all'esposizione al prodotto, possano modulare il comportamento delle cellule invasive corrispondenti agli stadi precoci e avanzati del carcinoma prostatico metastatico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle patologie legate all'età. Ad esempio, il modo in cui l'aumento della rigidità e dello spessore della membrana basale contribuisce alla progressione del cancro e anche a disturbi metabolici come il diabete.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice per imitare il livello di rigidità misurato nei tumori della prostata umana in ambito clinico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia e diagnosi del cancro alla prostata, migliorando la nostra comprensione di come la rigidità della membrana basale promuova i cambiamenti molecolari e cellulari. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà, perché il modello è multidisciplinare.

Combinando tecniche provenienti dai campi della chimica, della fisica e della biologia. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo ipotizzato che la rigidità della membrana basale nella ghiandola prostatica possa promuovere un comportamento invasivo de novo in cellule epiteliali trasformate note. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, perché è necessario descrivere i passaggi interdisciplinari.

Compresa la reticolazione della membrana basale, seguita da coltura cellulare 3D. Inizia preparando una superficie uniforme di ghiaccio e usandola per raffreddare un vetrino a otto pozzetti a quattro gradi Celsius. Quindi, tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 200 microlitri e raffreddare anche il puntale a quattro gradi Celsius.

Una volta raffreddato, posizionare il puntale su un ausilio per il pipettaggio da 200 microlitri. E usalo per trasferire 40 microlitri di soluzione di matrice BM ghiacciata in ciascun pozzetto del vetrino raffreddato a otto pozzetti. Quindi posizionare il vetrino della camera a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire la polimerizzazione della membrana basale.

Chiudere la porta dell'incubatrice con molta attenzione per evitare di disturbare la membrana basale ricostituita dal liquido. Dopo esattamente 30 minuti, aggiungere 250 microlitri di una soluzione di glicolaldeide preparata per coprire la membrana basale polimerizzata e ricostituita. Successivamente, preparare un controllo negativo aggiungendo 250 mircolitri di PDS sterile a un gel nativo e ricostituito per la membrana basale.

Inoltre, preparare due controlli aggiuntivi aggiungendo 50 millimolari di cianoboroidrridio di sodio o 250 millimolari di aminoguanidina alla soluzione di glicolaldeide prima di aggiungerla al gel della membrana basale. Quindi, incubare i gel a 37 gradi Celsius per sei ore per produrre un gel semi-rigido. O per 14 ore per produrre un gel rigido.

Dopo l'incubazione, rimuovere con cura le soluzioni dai gel e aggiungere 250 microlitri di un estere etilico di glicina molare a ciascun gel. E incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare ogni gel 10 volte in 500 mircolitri di PBS per rimuovere ogni traccia della soluzione di glicolaldeide e dell'estere etilico della glicina.

Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS per prevenire la disidratazione e incubare i gel della membrana basale ricostituita durante la notte a 37 gradi Celsius. Quando si è pronti per continuare, rimuovere il PBS dai gel della membrana basale ricostituita e aggiungere 250 microlitri di acqua ghiacciata a doppia distillazione in ciascun pozzetto. Incubare i gel a quattro gradi Celsius per 16-24 ore per assicurarsi che la matrice sia completamente liquefatta.

Quindi trasferire la membrana basale liquefatta in un tubo da 1,5 millilitri e misurare l'emissione fluorescente della soluzione utilizzando uno spettrofotometro. Quindi centrifugare la soluzione e rimuovere il surnatante risultante. Risospendere il pellet in 500 microlitri di una soluzione contenente 20 milligrammi per millilitro di bromuro di cianogeno e acido formico al 70%.

Incubare i campioni per una notte a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare una siringa monouso da un millilitro per trasferire il gel della membrana basale risospeso in una cassetta per dialisi con un taglio del peso molecolare di 3,5 kilodalton. Immergere la cassetta in un becher di vetro da 500 millilitri contenente 500 millilitri di acqua bidistillata.

E mescola l'acqua con un'ancoretta magnetica. Posiziona questa configurazione durante la notte a quattro gradi Celsius per rimuovere tutte le tracce di bromuro di cianogeno e acido formico. Utilizzare una siringa monouso da un millilitro per trasferire la soluzione dializzata dalla cassetta in una provetta da 1,5 millilitri.

Quindi analizzare la soluzione facendola scorrere su un gel di poliacrilammide al 12%. Colorare il gel con una macchia d'argento per visualizzare il modello elettroforetico dei peptidi della matrice di bromuro di cianogeno. Iniziando con i gel della membrana basale ricoperti di PBS, risciacquare i gel altre due volte, con 300 microlitri di PBS contenenti 0,1 millimoli di cloruro di calcio.

E 0,5 millimoli di cloruro di magnesio. Per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere 300 microlitri di paraformaldeide al 4% per coprire ogni gel della membrana basale ricostituita.

Incubare i gel per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare i componenti della membrana basale ricostituita. Successivamente, rimuovere il fissativo e aggiungere 300 microlitri di una soluzione di tempra contenente 75 millimoli di cloruro di ammonio e 0,5 millimoli di cloruro di magnesio. Incubare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la soluzione e ripetere il risciacquo altre quattro volte.

Dopo il risciacquo finale, aggiungere 300 microlitri di tampone di immunofluorescenza ai gel della membrana basale ricostituita per prevenire reazioni aspecifiche. Incubare i gel nella soluzione per due ore a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione. Quindi rimuovere il tampone che blocca l'immunofluorescenza.

E aggiungi 300 microlitri di anticorpo primario che viene diluito nel tampone bloccante. Incubare i gel della membrana basale ricostituita a quattro gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e lavare i gel tre volte con 300 microlitri di tampone di immunofluorescenza.

Agitare i gel a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione per 10 minuti dopo ogni aggiunta di tampone. Quindi rimuovere il tampone e aggiungere 300 microlitri dell'anticorpo secondario marcato in modo fluorescente, diluito nel tampone bloccante. Posizionare i campioni su una piattaforma di agitazione e incubare i gel per due ore a temperatura ambiente.

Rimuovere l'anticorpo secondario. Sciacquare il campione in un tampone di immunofluorescenza, seguito da PBS, quindi fissare e spegnere i campioni una seconda volta. Infine, montare i gel e utilizzare un microscopio per analizzare la formazione di fasci densi.

Per formare gli acini della ghiandola prostatica, diluire 5.000 cellule RWPE-1 in 300 microlitri di KSMM completo, integrati con il 2% della soluzione della membrana basale. Per gli aggregati di cellule tumorali della prostata, diluire 2.500 cellule PC3 in 300 microlitri di terreno di coltura RPMI-1640, integrati con il 2% della soluzione della membrana basale. Dopo l'incubazione notturna dei gel di membrana basale ricostituiti in PBS, sciacquarli due volte con 500 microlitri di terreno di coltura.

Prima di seminare le cellule. Seminare delicatamente le cellule sulle membrane basali ricostituite e irrigidite dal prodotto finale della glicazione nativa e avanzata. E posiziona con cura le colture in un'incubatrice per garantire una distribuzione uniforme di acini e sferoidi in crescita.

Per le cellule che formano gli acini, sostituire il terreno ogni due giorni con terreno di coltura fresco, contenente il 2% della soluzione della membrana basale. Per garantire che le cellule abbiano i fattori di crescita necessari per la normale omeostasi degli acini. Dopo sei giorni di coltura, le cellule epiteliali della prostata formano acini sulla membrana basale ricostituita nativa.

E sono organizzati in sferoidi uniformi di cellule epiteliali. Questi acini hanno anche le caratteristiche di PEC altamente organizzate con polarità apicale a basale e uno spazio luminale visibile. Quando vengono coltivate per sei giorni sulla membrana irrigidita, le cellule hanno un'architettura interrotta.

E cambia da sferoidale a poligonale in forma. Inoltre, questi acini sono molto disorganizzati. E hanno perso la loro polarità apicale a basale, con uno spazio luminale piccolo o inesistente.

Questo vale anche per le cellule derivate da una ghiandola prostatica affetta da iperplasia prostatica benigna. Quando sono state misurate le cellule tumorali della prostata, si è scoperto che le cellule erano più lunghe sulla membrana basale rigida e ricostituita, e migravano anche più velocemente e avevano una maggiore persistenza cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modellare gli effetti della rigidità della membrana basale sul comportamento delle cellule epiteliali e tumorali.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che viene indotto il livello desiderato di rigidità della membrana basale e che i singoli acini o s-sferoidi si formano correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'induzione dell'invasione delle cellule tumorali da parte della rigidità della membrana basale nella ghiandola prostatica. Seguendo questo protocollo, altri metodi, come l'immunoblotting del lisato cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative alla via di segnalazione, modulata dalla rigidità della membrana basale.

Non dimenticare che lavorare con cianoboroidruro di sodio, bromuro di cianogeno e acido formico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare un camice da laboratorio, guanti, visiera e un respiratore mentre si lavora nella cappa aspirante dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.