Name: Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate alletà o malattie metaboliche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Scopri come modellare la rigidità della membrana basale nel cancro alla prostata usando tecniche interdisciplinari di chimica, fisica e biologia. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi di invasione cellulare.

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Ringraziamo Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) per le cellule BPH-1; e Thomas Cox e Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, Università di Copenhagen) per la loro assistenza nelle misurazioni reologiche. MR-T è stato finanziato da Worldwide Cancer Research, ex The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo e Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). La MC è stata supportata da Prostate Cancer UK (Grant S14-017 a JS e GS). KW è stato finanziato dal China Scholarship Council. Il MAM è stato finanziato dall'Ufficio Culturale dell'Arabia Saudita.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un protocollo per la generazione di acini ghiandolari 3D da MECs a puro gel rbm 6 è stato modificato in uno studio precedente con l&#39;aggiunta di 4 mg tipo / ml collagene alla matrice MLF. L&#39;aggiunta di collagene provocato il modulo elastico del gel meccanismi crescenti da 175 ± 37 al 1589 ± 380 Pascal. Questo aumento 9,1 volte della rigidità modulata la crescita, la sopravvivenza, la migrazione e la differenziazione delle MECs 21. Il protocollo è stato modificato nuovamente includendo una fase di trattamento con D - (-) - ribosio promuovere reticolazione non enzimatica del collagene di tipo I che era stato aggiunto al gel MLF. Il risultante aumento di 15 volte della rigidità è stato trovato a collaborare con la trasformazione oncogenica di MECs per promuovere il loro comportamento invasivo 22. L&#39;approccio sperimentale di tipo aggiunta di collagene di gel RBM facilita l&#39;interazione diretta di MECs con fibre di collagene, che si verifica solo nei tessuti umani dopo la barriera fisica tra lo stromaed epitelio fornite dal BM subisce degradazione proteolitica. Generando acini ghiandolari 3D da PEC in gel puro RBM pre-trattati con GLA, l&#39;attuale protocollo apre la strada per studiare come BM rigidità di per sé in grado di attivare il loro comportamento invasivo (Figura 3). I livelli di BM rigidità indotte in questo protocollo hanno rilevanza fisiologica. L&#39;incubazione con 50 mM GLA per 6 ore e 14 ore, rispettivamente aumentato i moduli elastici del gel puro meccanismi a 175 ± 90 e 322 ± 160 rispetto a 122 ± 55 Pascal in gel MLF trattati con PBS (Tabella 1). Questo aumento 1,7-3,2 volte in RBM rigidità ricapitola il 2,5 a 3,4 volte aumento della rigidità osservato in maligno della prostata rispetto al normale o tessuto di BPH 23-26. Come indicato in una recente pubblicazione 13 le variazioni morfologiche indotte da un accumulo di AGE e RBM rigidità PEC acini può essere quantificato per un cambiamento statisticamente significativo da arounded a forma poligonale, diminuzione del lume / superficie totale acinare, e le cellule sporgenti che migrano dal acina nel ricco-AGE RBM (Figura 3). Immunoblotting può anche essere utilizzato per valutare marcatori di EMT (ad esempio perdita di E-caderina 13) e il comportamento contrattili (es fosforilata leggera della miosina catena 2, pMLC2 13) in PEC coltivati ​​in normale rispetto rigida MLF (Figura 3). Ulteriore valutazione usando immunofluorescenza e microscopia confocale può essere applicata per visualizzare il BM (es laminina, collagene IV e accumulo di AGE 13), cellulare polarità apicale-to-basale (es localizzazione apicale EEA1: primi endosomal antigene 1 e GM130: 130 kDa marcatore cis-Golgi 13) e modelli cellulari di molecole di adesione (es localizzazione e-caderina per giunzioni cellula-cellula 13) (Figura 3). <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Panoramica dei diversi protocolli qui presentati Il diagramma illustra come preparare e irrigidire la membrana basale ricostituita (RBM) con glicolaldeide (reazione di Maillard), come seme le cellule al rigida RBM, come analizzare la rigida RBM ( entità della reazione di Maillard) e le procedure che possono essere utilizzate per analizzare i cambiamenti cellulari e molecolari indotte da ricchi-AGE RBM. AGE, prodotti finali della glicazione avanzati; BM, membrana basale; DAPI, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, presto antigene endosomal 1; GAPDH, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi; GLA, glicolaldeide; GEE, glicina estere etilico; GM130, 130 kDa marcatori cis-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miosina luce catena 2 fosforilata in siti treonina 18 e serina 19; RBM, membrana basale ricostituita; SDS-PAGE, sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide. Per la barra RWPE1 acini Scala = 10 micron; per cellule tumorali PC3bar sferoidi Scala = 100 micron. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> saranno necessari passaggi di risoluzione dei problemi se D - (-) - ribosio viene scelto come agente reticolante per RBM. Durante lo sviluppo del protocollo è stato trovato che il trattamento con 1 M D - (-) - ribosio per 72 ore, come precedentemente descritto per i gel RBM / collagene 22, portato alla disidratazione e ritiro del gel MLF. La valutazione delle concentrazioni inferiori di D - (-) - ribosio e tempi di trattamento più brevi può contribuire a superare questa limitazione. Un potenziale limitazione future applicazioni del protocollo potrebbe essere incontrata in cui si desiderano livelli più alti di RBM rigidità. Se i tempi di incubazione più lunghi e concentrazioni più elevate di GLA vengono utilizzati per indurre livelli elevati di MLF gel rigidità sarà necessario<html> valutare se tali condizioni di trattamento hanno un impatto sulla sopravvivenza e la proliferazione cellulare, come descritto in precedenza 13. Va inoltre notato che l&#39;incubazione di RWPE-1 le cellule con siero induce una transizione EMT-like fenotipica e l&#39;esposizione a siero o materiali contenenti siero deve essere evitato. Ad esempio, se gli esperimenti riguardano la transfezione di short interfering RNA oligonucleotidi (siRNA), la procedura deve essere ottimizzato usando le cellule RWPE-1 coltivate in KSFM, senza passare le cellule su un supporto a basso siero trasfezione. Questo inconveniente potrebbe compromettere il livello di silenziamento genico ottenuto utilizzando siRNA transitorio si avvicina nel modello. Per alcuni bersagli proteici che sarebbe stato consigliato di utilizzare vettori shRNA inducibili per sintonizzabile silenziamento genico e la diminuzione desiderata in livelli di proteine. Adattamenti che incorporano reticolazione enzimatica da cellule stromali o cellule tumorali lysyl associato ossidasi (LOX) 17 potrebbe anche essere incorporati in modelli futuri. jove_content &quot;&gt; Questo protocollo faciliterà il futuro studio dei meccanismi pro-invasive attivati ​​da età-dipendente BM rigidità PEC (RWPE-1, BPH-1) e la valutazione degli obiettivi anti-metastatici in PTC invasive (PC3). Dato che BPH è considerato come un disordine metabolico 27, questo protocollo spiana anche la strada verso la nostra migliore comprensione del legame tra disturbi del metabolismo e aumento del rischio di cancro alla prostata. Dato che BM rigidità indotta dalla sua esposizione alle età può essere un innesco per l&#39;invasività in altro cancro tipi, sarà di interesse per utilizzare il protocollo per impostare modelli simili che incorporano normali cellule epiteliali e le cellule tumorali di altri organi (ad esempio seno, del colon, ovaie, pancreas). Passaggi critici all&#39;interno del protocollo, insieme con i loro tempi, sono riassunte nella Figura 4. Durante la fase iniziale, è fondamentale per mantenere la soluzione stock di RBM a 4 ° C, mentre si scioglie per evitare che la sua polymerization. puntali delle pipette non devono essere inseriti nella soluzione rM magazzino fino a quando non sono state refrigerate a 4 ° C. Per il passo successivo è anche importante per garantire i vetrini camera sono equilibrati a 4 ° C prima di essere rivestiti con la soluzione RBM. Appena la temperatura della soluzione MLF è aumentata oltre 4 ° C che a polimerizzazione irreversibile per formare un gel. È essenziale che i meccanismi non è disturbato durante la fase di polimerizzazione per assicurare che forma una superficie piana adatto per coltura cellulare e analisi microscopica. La durata di incubazione con GLA, con o senza inibitori della reazione di Maillard (sodiocianoboroidruro e amingoguanidine) determinerà come il gel rigido RBM diventa. Si consiglia di utilizzare una incubazione 6 ore con GLA se sono richieste condizioni di semi-rigide, e l&#39;incubazione 14 ore se sono necessarie condizioni rigide (Tabella 1). tempi di incubazione alternative o concentrazioni di GLA possono essere usati se diversi livellidi rigidità sono desiderato. In questo caso l&#39;analisi reologiche del gel RBM devono essere incorporato come un passo essenziale. Dopo la fase di tempra reazione di Maillard mediante incubazione con GEE e le successive fasi di lavaggio con PBS, i gel RBM possono essere utilizzati immediatamente o conservati a 4 ° C per un massimo di 48 ore prima del loro utilizzo per colture cellulari. Una volta colture cellulari sono impostati è importante cambiare il terreno di coltura (compresi eventuali trattamenti) ogni due giorni. Si raccomanda di mantenere le colture cellulari 3D per 3-12 giorni secondo i parametri oggetto di indagine. Per 3D PEC acini si consiglia di analizzare le culture dopo 6 giorni, e per il 3D PTC sferoidi analisi è raccomandata dopo 3 giorni di coltura in prima istanza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Figura 4:. Semplice Panoramica del protocollo con i punti critici e tempi indicati la floSchema w descrive come preparare e irrigidire la membrana basale ricostituita (RBM) con glicolaldeide (reazione di Maillard) con i punti critici e tempi indicati. Punti in cui il protocollo può essere fermato, e gel RBM conservato, sono indicati anche. RBM, membrana basale ricostituita; GLA, glicolaldeide; GEE, glicina estere etilico; ON, durante la notte; PBS, fosfato tamponata salina; RT, a temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

La membrana basale (BM) è un foglio di matrice extracellulare specializzata (ECM) che mantiene stabili i bordi dei tessuti separando strati di cellule epiteliali dallo stroma1. La reticolazione covalente tra triple eliche adiacenti di collagene IV nel midollo osseo stabilizza la loro associazione laterale stabilendo una rete irregolare di eliche super-attorcigliate2. Questi reticoli di collagene IV fungono da impalcatura per la sua interazione con la laminina e altri componenti del midollo osseo1. La disposizione strutturale del midollo osseo gli conferisce la resistenza meccanica e la rigidità necessarie per il normale sviluppo degli epiteli ghiandolari3. 
Durante l'invecchiamento e la malattia, il midollo osseo si ispessisce e si irrigidisce progressivamente3,4. Ad esempio, un aumento di 3 volte del modulo elastico (E) del midollo osseo oculare si verifica tra i 50 e gli 80 anni nella popolazione normale e questo irrigidimento è ulteriormente esacerbato nei disturbi metabolici come il diabete5. I cambiamenti strutturali e biomeccanici nel midollo osseo che determinano il suo aumento della rigidità si verificano quando i suoi componenti della MEC, collagene IV e laminina, diventano reticolati in modo non enzimatico in seguito alla loro esposizione ai prodotti finali della glicazione avanzata (AGE).
Lo scopo del metodo qui descritto era quello di stabilire un modello per lo studio di come la rigidità del midollo osseo, dovuta all'esposizione all'AGE, promuova l'invasività delle cellule epiteliali prostatiche (PEC) e delle cellule tumorali della prostata (PTC) nel contesto del passaggio al carcinoma prostatico metastatico (PCa). A tal fine, un metodo precedente utilizzato per generare acini ghiandolari 3D da cellule epiteliali mammarie (MEC) in gel rBM6 ricostituiti è stato adattato per includere una fase aggiuntiva in cui i gel rBM vengono pretrattati con glicolaldeide (GLA). Vengono descritte diverse tecniche per valutare la reticolazione e l'irrigidimento indotti da GLA di gel rBM pretrattati, tra cui l'analisi fotometrica, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio (SDS PAGE), la microscopia confocale e l'analisi reometrica. I tipi di cellule prostatiche selezionate per la coltura sull'rBM pre-irrigidito includono: RWPE-1, PEC derivate da una ghiandola prostatica normale7; BPH-1, PEC derivate da una ghiandola prostatica affetta da BPH8; e PC3, PTC metastatici derivati da un tumore secondario localizzato nell'osso vertebrale di un paziente con carcinoma prostatico (PCa)9. 
Oltre a far progredire lo studio della patologia della ghiandola prostatica, il protocollo per l'irrigidimento dei gel rBM mediante il loro trattamento con GLA può essere adattato per studiare come la rigidità del midollo osseo contribuisca ad altre patologie legate all'età e ai disturbi metabolici. Ad esempio, il modello può essere applicato direttamente per studiare come il cancro metastatico sia indotto dalla rigidità del midollo osseo in organi come il seno, il colon, l'ovaio e il pancreas mediante l'incorporazione di tipi cellulari appropriati. Inoltre, il protocollo può essere adattato per studiare come il midollo osseo rigido promuova i meccanismi biomeccanici della progressione della malattia nelle malattie microvascolari correlate al diabete, nella retinopatia, nella nefropatia e nella neuropatia.

<table><tbody><tr><td>I - Materiale per coltura monostrato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>Database di linee cellulari CaP</td><td>PCaCL-132</td><td>Contatto: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Terreni completi privi di siero per cheratinociti&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>Non riscaldare a 37 &ordm; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Negozio a -20 &ordm; C in aliquote</td></tr><tr><td>PC3&nbsp;</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato Soluzione salina (Dulbecco A) compresse</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>caldo in 37 &ordm; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>II - Materiale per cultura 3D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Aminoguanidina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle</td></tr><tr><td>Vetrini della camera, 8 pozzetti&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di coltura Membrana basale ricostituita (rBM) estratto di fattore di crescita ridotto&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Conservare la membrana basale (BM) a -80 &ordm; C in aliquote Bromuro di</td></tr><tr><td>cianogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Tossico per contatto con la pelle e inalazione</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Glicina estere etilico cloridrato (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Irritante per gli occhi</td></tr><tr><td>Dimero di glicolaldeide (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Cianoboroidruro di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Facilmente infiammabile; Tossico per contatto con la pelle e per inalazione</td></tr><tr><td>Filtro siringa 0,22 micron</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>III - Materiale per quantificare la reazione di Maillard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>sensibile alla luce e conservare a -20 &ordm; C in aliquote</td></tr><tr><td>Cilindri di clonazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG (H+L) Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>fotosensibile</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG (H+L) Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>fotosensibile</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Conservare a -20 &ordm; C in aliquote</td></tr><tr><td>Supporti di montaggio Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Clone di topo anti-pentosidina PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Conservare a -20 &ordm; C in aliquote</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale IV anti-collagene umano di coniglio&nbsp; &nbsp;</td><td>Acris Antibodies</td><td>R1041</td><td>Negozio a -20 &ordm; C in aliquote</td></tr><tr><td>Coniglio anti-laminina A/C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Negozio a -20 &ordm; C in aliquote</td></tr><tr><td>Polietilenglicole terz-ottilfeniletere (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole sorbitano monolaurato (Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per dialisi Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>IV - Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 reometro rotazionale a deformazione controllata</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td>Microscopio</tr><tr><td>Axiovert S100 (ingrandimento 20X)</td> Camera di incubazione umidificata controllata a CO2 <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per microscopio Zeiss Axio S100</td><td>Microscopio Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Axiovert 200M (ingrandimento 40X, 63X)</td> Microscopio <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A dotato di fotocamera digitale a contrasto di fase&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per lettore di piastre PHERAstar Plus</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>V - Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>National Institute of Health, Dispositivi</td> molecolari MetaXpress USA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

come studiare membrana basale rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all&#39;età o malattie metaboliche

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Qui si descrive un protocollo che può essere utilizzato per studiare il microambiente biofisico relativi a spessore maggiorato e la rigidità della membrana basale (BM) durante le patologie legate all&#39;età e disturbi metabolici (come cancro, diabete, malattie microvascolare, retinopatia, nefropatia e neuropatia) . La premessa del modello è reticolazione non enzimatica della matrice ricostituito BM (RBM) di trattamento con glicolaldeide (GLA) promuovere avanzata glicazione prodotto finale (AGE) generazione tramite la reazione di Maillard. Esempi di tecniche di laboratorio che possono essere utilizzati per confermare la generazione AGE, reticolazione non enzimatica e una maggiore rigidità in GLA trattati meccanismi sono delineati. Questi includono la preparazione di natale RBM (trattato con soluzione salina tamponata con fosfato, PBS) e rigido RBM (trattato con GLA) per la determinazione di: suo contenuto AGE da analisi fotometrica e microscopia a immunofluorescenza, la sua reticolazione non enzimatica da sodio dodecil solfato poliacrilammideelettroforesi su gel (SDS PAGE) e microscopia confocale, e la sua maggiore rigidità utilizzando reometria. Il procedimento qui descritto può essere utilizzato per aumentare la rigidità (moduli elastici, E) di MLF fino a 3,2 volte, in linea con le misurazioni effettuate in sani contro tessuto prostatico umano malato. Per ricreare il microambiente biofisico associato con l&#39;invecchiamento e la prostata malata ghiandola tre tipi di cellule della prostata sono stati introdotti a RBM nativo e rigido RBM: RWPE-1, le cellule epiteliali della prostata (PEC) derivato da una ghiandola prostatica normale; BPH-1, PEC derivati ​​da una ghiandola prostatica affetti da iperplasia prostatica benigna (BPH); e PC3, cellule metastatiche derivate da un tumore osseo secondario proveniente da cancro alla prostata. parametri multipli possono essere misurati, tra cui le dimensioni, la forma e le caratteristiche invasive della acini ghiandolari 3D formato da RWPE-1 e BPH-1 sul nativo contro rigida RBM, e la durata media delle cellule, la velocità migratoria e la persistenza di movimento delle cellule di spher 3DOID formate da cellule PC3 alle stesse condizioni. Cellulare vie di segnalazione e la localizzazione subcellulare delle proteine ​​può anche essere valutato.

3D prostata Acini coltivate su Stiff RBM Dopo 6 giorni di coltura, PEC derivate da tessuto prostatico normale (RWPE-1) (Figura 1A) e il tessuto di BPH (BPH-1) (Figura 1B) forma acini su nativa (PBS trattata) RBM che sono organizzati in sferoidi uniformi epiteliale cellule. Questi acini hanno anche le caratteristiche di PEC altamente organizzati con spazio apicale-to-basale polarità e un luminale visibile 13,20. Il acini formata da PEC derivate da tessuto prostatico normale (RWPE-1) (Figura 1A) e tessuto di BPH (BPH-1) (Figura 1B) su irrigidito RBM (ricco-AGE) (trattato con GLA) hanno un&#39;architettura perturbato (shifting da sferoidale a forma poligonale e le cellule sporgenti / migrazione da acini nel RBM ricco di età) (Figura 1A). Queste<html> acini sono caratterizzati anche da PEC altamente disorganizzati che hanno perso la loro polarità apicale-to-basale con un piccolo o inesistente spazio luminale 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Figura 1:. Le cellule epiteliali della prostata coltivata come 3D ghiandolare Acini su Native e Stiff ricostituito membrana basale (RBM) (A) le immagini in campo chiaro di RWPE-1 le cellule coltivate per 12 ore fino a 6 giorni su gel meccanismi trattati con PBS (nativo) o 50 mm glicolaldeide per 14 ore (ricchi di età; rigida); Barra di scala = 50 micron. (B) BPH-1 le cellule, cresciute come descritto nel pannello A; Barre di scala = 50 micron; Dati rappresentativa 3 esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> Tabella 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabella 1:. Caratteristiche epiteliali della prostata RWPE-1 acini Grown su Native, semi-rigida e Stiff ricostituito membrana basale (RBM) RWPE-1 acini sono state coltivate su meccanismi pre-trattati con PBS per 14 ore (nativo), glicolaldeide (GLA ) per 6 ore (semi-rigido) o GLA per 14 ore (rigida). Per la forma acinar, la percentuale (%) ± deviazione standard (SD) di turno, acini semi-poligonale e poligonali sono stati calcolati da 5 esperimenti indipendenti (50 acini quantificati per condizione). dimensione acinare relativa è stata calcolata (nativo RBM = 100%) da 3 esperimenti indipendenti. Per invasività,% ± SD acini con una o più celle sporgenti sono stati calcolati da 3 esperimenti indipendenti. cambiamento Fold è calcolato dividendo il valore medio ottenuto in condizioni di semi-rigidi o rigide per il valore corrispondente per condizioni native. valori di P calcolati utilizzando il test t di Student (α = 0,05). ontent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE dipende maggiore rigidità RBM promuove la migrazione delle cellule tumorali della prostata PC3 Cellule PC3 coltivate su nativo RBM migrano, mantenendo costante il contatto cellula-cellula, mentre le cellule PC3 coltivate su ricchi di AGE (rigida) RBM mossa in modo indipendente l&#39;una dall&#39;altra (Figura 2A). Dopo 72 ore nelle cellule PC3 cultura formare foci (sferoidi) su nativo (PBS trattata) RBM, mentre le cellule PC3 sulla rigida (ricco di AGE) RBM Non da sferoidi e migrare in modo indipendente (Figura 2B). Cellule PC3 sulla rigida RBM (ricchi di AGE) sono più allungate rispetto alle cellule PC3 coltivate su nativo RBM (Figura 2C). Cellule PC3 sulla rigida meccanismi migrano più velocemente rispetto alle cellule PC3 coltivate su nativo RBM (Figura 2D). Cellule PC3 sulla rigida meccanismi mostrano una diminuzione della persistenza rispetto alle cellule PC3 coltivate su nativo RBM (Figura 2E). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2:. La migrazione delle cellule tumorali della prostata su Native e Stiff ricostituito membrana basale (RBM) (A) le immagini in campo chiaro di cellule PC3 coltivate su gel di meccanismi trattati con PBS (nativo) o 50 mm glicolaldeide per 14 ore (ricchi di AGE, rigido) . Le cellule sono state ripreso con un microscopio campo chiaro (obiettivo 10X) e un tasso di acquisizione di 1 immagine per ora per 12 ore seguita da cellule di monitoraggio per generare traiettorie. Immagini mostrati corrispondono ai punti di tempo dopo 0, 3, 6, 9 e 12 ore. Traiettorie delle singole celle sono indicati per il punto di tempo 12 hr. Barra di scala = 100 micron. Cellule (B) PC3 coltivati ​​su meccanismi nativo o rigida per 72 ore, e ripreso come descritto nel pannello (A). Barra di scala = 100 micron. Particolare mostra area selezionata a 2X ingrandimento. (C) Media ± SD lunghezza cellulare (micron); differenza significativa tra i meccanismi nativi e rigido RBM (p = 1.2 x 10 -23). ( <strong&gt; D) Media ± SD velocità (micron / ora) calcolato da traiettorie delle cellule; differenza significativa tra i meccanismi nativi e rigido RBM (p = 0,004). (E) Media ± SD persistenza del movimento delle cellule (rapporto D / T, dove D = distanza dall&#39;inizio alla fine della traiettoria delle cellule, T = lunghezza totale della traiettoria delle cellule); differenza significativa tra i meccanismi nativi e rigido RBM (p = 0,0007). Per i pannelli CE&gt; 10 cellule sono stati analizzati, i dati rappresentativa 3 esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui spieghiamo un protocollo per modellare il microambiente biofisico dove reticolazione e una maggiore rigidità della membrana basale (BM) indotta da prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) ha rilevanza patologica.

Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all&#39;età o malattie metaboliche

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

L'obiettivo generale di questo modello è studiare in che modo la rigidità e lo spessore della membrana basale, causati dalla glicosilazione avanzata e dall'esposizione a prodotti correlati, possano modulare il comportamento invasivo delle cellule corrispondenti alle fasi iniziali e avanzate del cancro alla prostata metastatico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle patologie legate all'invecchiamento, ad esempio come l'aumento della rigidità e dello spessore della membrana basale contribuisca alla progressione tumorale e a disturbi metabolici come il diabete.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice per riprodurre il livello di rigidità misurato nei tumori della prostata umana in ambito clinico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi del cancro alla prostata, migliorando la comprensione di come la rigidità della membrana basale promuova cambiamenti molecolari e cellulari. Le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché il modello è multidisciplinare.Combinazione di tecniche provenienti dai campi della chimica, della fisica e della biologia. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo ipotizzato che la rigidità della membrana basale nella ghiandola prostatica possa promuovere un comportamento invasivo *de novo* in cellule epiteliali trasformate note. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale, poiché è necessario descrivere passaggi interdisciplinari.Inclusione del reticolo incrociato della membrana basale, seguito da coltura cellulare tridimensionale. Iniziare preparando una superficie uniforme di ghiaccio e utilizzarla per raffreddare una piastra in vetro con otto camere a quattro gradi Celsius. Successivamente, tagliare l'estremità di una punta per pipetta da 200 microlitri e raffreddare anche la punta a quattro gradi Celsius.Dopo averlo raffreddato, posizionare la punta su un ausilio per pipettatura da 200 microlitri e utilizzarlo per trasferire 40 microlitri di soluzione di matrice BM ghiacciata in ciascun pozzetto della camera in vetro da otto pozzetti pre-raffreddata. Quindi, posizionare la camera in vetro a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire la polimerizzazione della membrana basale.Chiudere con molta attenzione la porta dell'incubatrice per evitare di disturbare il reagente liquido di membrana basale ricostruita. Dopo esattamente 30 minuti, aggiungere 250 microlitri di una soluzione di glicolaldeide preparata per ricoprire la membrana basale ricostruita polimerizzata. Successivamente, preparare un controllo negativo aggiungendo 250 microlitri di PDS sterile a un gel di membrana basale ricostruita nativa.Inoltre, preparare due controlli aggiuntivi aggiungendo alla soluzione di glicolaldeide rispettivamente 50 millimoli di cianoboroidrato di sodio oppure 250 millimoli di aminoguanidina, prima di aggiungere la soluzione al gel della membrana basale. Quindi, incubare i gel a 37 gradi Celsius per sei ore per ottenere un gel semi-rigido oppure per 14 ore per ottenere un gel rigido.Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione le soluzioni dai gel e aggiungere 250 microlitri di glicina etilestere uno molare a ciascun gel. Incubarli a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare ogni gel 10 volte in 500 microlitri di PBS per rimuovere ogni traccia della soluzione di glicolaldeide e del glicina etilestere.Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS per prevenire la disidratazione e incubare le membrane basali ricostituite tutta la notte a 37 gradi Celsius. Quando si è pronti per proseguire, rimuovere il PBS dalle membrane basali ricostituite e aggiungere 250 microlitri di acqua distillata doppia fredda a ogni pozzetto. Incubare i gel a quattro gradi Celsius per 16-24 ore per assicurare che la matrice sia completamente liquefatta.Quindi trasferire la membrana basale liquefatta in una provetta da 1,5 millilitri e misurare l'emissione fluorescente della soluzione utilizzando uno spettrofotometro. Successivamente centrifugare la soluzione ed eliminare il soprannatante ottenuto. Ri-sospendere il pellet in 500 microlitri di una soluzione contenente 20 milligrammi per millilitro di bromuro di cianogeno e acido formico al 70%.Incubare i campioni tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare una siringa monouso da un millilitro per trasferire il gel della membrana basale ri-sospeso in una cassetta per dialisi con un cutoff di peso molecolare di 3,5 chilodalton. Immergere la cassetta in un becher di vetro da 500 millilitri contenente 500 millilitri di acqua doppio-distillata.E agitare l'acqua con una barra magnetica. Lasciare questo apparato tutta la notte a quattro gradi Celsius per rimuovere ogni traccia di bromuro di cianogeno e acido formico. Utilizzare una siringa monouso da un millilitro per trasferire la soluzione dializzata dalla cassetta in un tubo da 1,5 millilitri.Quindi analizzare la soluzione eseguendone l'elettroforesi su un gel di poliacrilammide al 12%. Colorare il gel con la colorazione argentica per visualizzare il profilo elettroforetico dei peptidi matriciali derivati dal bromuro di cianogeno. A partire dai gel di membrana basale ricoperti con PBS, lavare i gel altre due volte con 300 microlitri di PBS contenente 0,1 millimoli di cloruro di calcio.E 0,5 millimoli di cloruro di magnesio. Per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere 300 microlitri di paraformaldeide al 4% per coprire ciascun gel di membrana basale ricostituito.Incubare i gel per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare i componenti della membrana basale ricostituita. Successivamente, rimuovere il fissativo e aggiungere 300 microlitri di una soluzione di blocco contenente 75 millimoli di cloruro di ammonio e 0,5 millimoli di cloruro di magnesio. Incubare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la soluzione e ripetere il risciacquo altre quattro volte.Dopo il risciacquo finale, aggiungere 300 microlitri di buffer per immunofluorescenza ai gel di membrana basale ricostruiti per prevenire reazioni non specifiche. Incubare i gel nella soluzione per due ore a temperatura ambiente su una piattaforma agitatrice. Successivamente, rimuovere il buffer bloccante per immunofluorescenza.Aggiungere 300 microlitri di anticorpo primario diluito nel buffer di blocco. Incubare i gel di membrana basale ricostruiti a quattro gradi Celsius per 16 ore. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e lavare i gel tre volte con 300 microlitri di buffer per immunofluorescenza.Agitare i gel a temperatura ambiente su una piastra agitatrice per 10 minuti dopo ogni aggiunta di tampone. Rimuovere quindi il tampone e aggiungere 300 microlitri dell'anticorpo secondario marcato con fluorocromo, diluito nel tampone di blocco. Posizionare i campioni su una piastra agitatrice e incubare i gel per due ore a temperatura ambiente.Rimuovere l'anticorpo secondario. Lavare il campione in un buffer per immunofluorescenza, seguito da PBS, quindi fissare e quenchare i campioni una seconda volta. Infine, montare i gel e utilizzare un microscopio per analizzare la formazione di fasci densi.Per formare acini ghiandolari prostatici, diluire 5.000 cellule RWPE-1 in 300 microlitri di KSFM completo, integrato con il 2% della soluzione di membrana basale. Per aggregati di cellule tumorali prostatiche, diluire 2.500 cellule PC3 in 300 microlitri di mezzo di coltura RPMI-1640, integrato con il 2% della soluzione di membrana basale. Dopo l'incubazione notturna dei gel di membrana basale ricostituiti in PBS, lavarli due volte con 500 microlitri di mezzo di coltura.Prima di seminare le cellule. Seminare delicatamente le cellule sui membrane basali ricostituite native e indurite dai prodotti finali della glicazione avanzata. Quindi posizionare con attenzione le colture in un incubatore per garantire una distribuzione uniforme degli acini e dei sferoidi in crescita.Per le cellule che formano acini, cambiare il mezzo ogni due giorni con mezzo di coltura fresco, contenente il 2% della soluzione di membrana basale. Per garantire che le cellule ricevano i fattori di crescita necessari per l'omeostasi normale degli acini. Dopo sei giorni di coltura, le cellule epiteliali della prostata formano acini sulla membrana basale ricostruita nativa.Sono organizzati in sferoidi uniformi di cellule epiteliali. Questi acini presentano anche le caratteristiche di cellule epiteliali prostatiche altamente organizzate con polarità apicale-basale e uno spazio luminale visibile. Quando coltivati per sei giorni su una membrana indurita, le cellule mostrano un'architettura alterata.E il cambiamento dalla forma sferoidale a quella poligonale. Inoltre, questi acini sono altamente disorganizzati e hanno perso la loro polarità apicobasale, con uno spazio luminale ridotto o addirittura assente.Questo vale anche per le cellule derivate da una ghiandola prostatica affetta da iperplasia prostatica benigna. Quando sono state misurate le cellule tumorali della prostata, si è osservato che erano più allungate sul membrana basale riconstituita rigida, si spostavano più velocemente e mostravano una maggiore persistenza cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come modellare gli effetti della rigidità della membrana basale sul comportamento delle cellule epiteliali e tumorali.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che deve essere indotta la rigidità desiderata della membrana basale e che gli acini singoli o gli s-sferoidi siano correttamente formati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'induzione dell'invasione delle cellule tumorali da parte della rigidità della membrana basale nella ghiandola prostatica. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunoblotting dei lisati cellulari, per rispondere ad ulteriori domande relative alle vie di segnalazione modulate dalla rigidità della membrana basale.Non dimenticare che lavorare con cianoboroidruro di sodio, bromuro di cianogeno e acido formico può essere estremamente pericoloso, e si devono sempre adottare precauzioni come indossare camice da laboratorio, guanti, schermo facciale e respiratore quando si lavora sotto cappa chimica durante l'esecuzione di questa procedura.

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L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere...

Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

Presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento delle aorte dal topo e la misurazione del loro modulo elastico utilizzando la microscopia a forza atomica.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Recentemente abbiamo identificato l'irrigidimento capillare retinico come un nuovo paradigma per la disfunzione retinica associata al diabete. Questo protocollo elabora le fasi per l'isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale da colture endoteliali retiniche, seguite da una descrizione della tecnica di misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica.

Isolamento dei capillari retinici di topo e della matrice subendoteliale per la misurazione della rigidità mediante microscopia a forza atomica

Questo protocollo visualizza come preparare criosezioni di tessuto polmonare murino, eseguire esperimenti di mappa della forza di microscopia a forza atomica e analizzare i dati per determinare il modulo di Young della membrana basale polmonare murina nativa.

Estrazione del modulo di Young delle membrane basali polmonari murine native dalle mappe di forza derivate dalla microscopia a forza atomica

Questo protocollo dimostra come generare tumori clonali fluorescente segnato, geneticamente definite nei dischi immaginali antennali (EAD) occhio Drosophila /. Esso descrive come sezionare la EAD e il cervello dalla terza larve instar e come elaborarli per visualizzare e quantificare i cambiamenti di espressione genica e l'invasività del tumore.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Scopri come modellare la rigidità della membrana basale nel cancro alla prostata usando tecniche interdisciplinari di chimica, fisica e biologia. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi di invasione cellulare.

Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate alletà o malattie metaboliche (Video) | JoVE Journal

Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all'età o malattie metaboliche

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