Name: A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi ( Bombus terrestris) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Scopri un nuovo test comportamentale per analizzare le risposte gustative individuali di bombi liberi (Bombus terrestris). Questo metodo misura il consumo e la durata dei pasti per studiare la rilevazione di nutrienti e tossine.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione Leverhulme Trust (RPG-2012-708) e una borsa di studio BBSRC (BB / M00709X / 1) per GAW.

1. Acquisizione di api dalla colonia e il periodo di fame Nota: esperimenti descritti qui sono stati eseguiti presso l&#39;Università di Newcastle, Regno Unito con Bombus terrestris audax. Multipli (2-3) acquistabile colonie sono stati utilizzati per il trattamento. Le colonie sono state mantenute su una panchina in condizioni di laboratorio (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH) nel buio costante e sono stati alimentati con il miele polline d&#39;api raccolte e soluzioni zuccherine ad libitum. <ol><li> Raccogliere singolo lavoratore bombi utilizzando una fiala di plastica (lunga 7 cm, 2,8 cm di diametro interno) con un tappo di plastica perforata, dopo aver aperto la porta alla colonia giusto il tempo per un ape per uscire e essere intrappolati. </li><li> Prima dell&#39;esperimento, fame singolarmente tutti i bombi per 2-4 ore in flaconi di plastica e conservare a temperatura ambiente in completa oscurità. </li></ol> 2. Trasferire api nei tubi della tenuta e la Habituation Phase <ol><li> Dopo il periodo di fame, trasferire un calabrone direttamente dalla fiala di plastica in un tubo di supporto. La tenendo il tubo è un 15 ml tubo da centrifuga modificato (lunghezza 119 mm, diametro 17 mm), con fori da 4 mm forato in punta e un pezzo di maglia di acciaio (base: 8 mm, altezza 30 mm) fissata all&#39;interno per fusione la plastica del tubo con ago in acciaio dissezione riscaldata. </li><li> Fissare il tubo di supporto che contiene il calabrone su un supporto in polistirolo con impronte dentarie. Fissare due pezzi di cartone su entrambi i lati del tubo di supporto. Questo per proteggere il ape da stimoli visivi che potrebbero interferire con l&#39;esperimento. </li><li> Posizionare una fotocamera digitale microscopica 5 cm sopra la punta del tubo di supporto e collegare la fotocamera a un computer portatile compatibile. </li><li> Regolare il tubo di supporto in modo che almeno i primi 18 mm di punta tubo Holding è all&#39;interno del frame video. Prima dell&#39;esperimento, possono cominciare il periodo di assuefazione 3 min. </li></ol> 3.Fase pre-test: Presentare una goccia di saccarosio <ol><li> Collegare una siringa ad un adattatore femmina contenente una goccia di soluzione di saccarosio (~ 3,5 ml, 500 mM saccarosio disciolto in acqua deionizzata). Presentare il saccarosio all&#39;interno della punta tubo di supporto per motivare l&#39;estensione della proboscide. </li><li> Dare il calabrone fino a 5 minuti per consumare la goccia di saccarosio. Se la goccia non viene consumato, rimuovere il calabrone dall&#39;esperimento. </li><li> Iniziare la registrazione video dopo il periodo di assuefazione. In questo studio, l&#39;attività proboscide è stato registrato a 26,7 fotogrammi / sec -1 con un tasso di ingrandimento 25X. </li></ol> 4. fase di test: Presentazione della soluzione di prova <ol><li> Riempire un microcapillare 100 ml con la soluzione di prova. Collegarlo a un pezzo di tubo in silicone (lunghezza 6 centimetri, 1 mm di diametro interno) e fissarlo ad un micro manipolatore. <ol><li> Collegare il tubo tramite un adattatore maschio ad un altro tubo in silicone (6 cm di lunghezza, 4 mm di diametro interno), WHIch agisce come una lampadina pipetta. </li><li> Posizionare il microcapillare tubo di 5-10 mm di distanza dalla punta del tubo azienda. Premere delicatamente il tubo per mantenere la soluzione di alimentazione a punta del tubo microcapillare. </li></ol></li><li> Dopo il calabrone consuma la goccia di saccarosio, rimuovere immediatamente la siringa contenente la soluzione di saccarosio 500 mm. </li><li> Inizia la fase di test 2 minuti quando il dell&#39;ape Bumble proboscide in contatto con la soluzione all&#39;interno del tubo microcapillare. <ol><li> Per controllare per possibili evaporazione, riempire due tubi microcapillari supplementari con saccarosio o di acqua e manipolare esattamente come durante la fase di test. </li></ol></li><li> Prima e dopo ogni prova scansionare i livelli del liquido all&#39;interno del tubo microcapillare utilizzando uno scanner a 600 dpi per misurare la quantità di cibo consumato (Figura 4A). </li></ol> 5. Analisi Immagine <ol><li> Determinare il volume del consumo di soluzione con ImageJ (versione 1.48), un proc immagineessing software. <ol><li> Carica il file immagine e ingrandire l&#39;immagine (~ 400%). Per impostare la scala di riferimento, selezionare lo strumento linea retta e tracciare una linea tra le due estremità del tubo microcapillare. Seleziona &#39;Analizza&#39; poi &#39;Set Scala&#39;. Inserire la lunghezza totale del tubo sotto &#39;distanza nota&#39; e la corrispondente unità sotto &#39;Unità di lunghezza&#39;. </li><li> Selezionare nuovamente lo strumento retta e tracciare una linea tra le due estremità del livello del liquido. Seleziona &#39;Analizza&#39; poi &#39;Misura&#39;. Nella finestra dei risultati della lunghezza del liquido è dato nella colonna &#39;intera&#39;. </li></ol></li><li> Calcolare il volume del consumo soluzione utilizzando la formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> dove <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" /> è la lunghezza del tubo e microcapillare <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" /> e <img alt= &quot;Equazione 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt; sono le lunghezze misurate del liquido all&#39;interno del microcapillare prima e dopo la fase di test, rispettivamente. </li></ol> 6. Le analisi Video <ol><li> Punteggio i comportamenti di alimentazione durante la fase di test 2 minuti di ogni video utilizzando un software di registrazione degli eventi (vedi Materiali Tavolo). <ol><li> Dapprima, definire i comportamenti alimentari (cioè gli elementi.) Nel menu classi comportamentali del software di registrazione. I comportamenti alimentari sono come segue: (1) proboscide out / contatto: la proboscide estende ed è in contatto con la soluzione all&#39;interno del tubo microcapillare (2) proboscide out / assenza di contatto: la proboscide estende e non è in contatto con la soluzione all&#39;interno del tubo microcapillare, (3) proboscide sistemati a bordo: la proboscide non si estende invece riposti sotto la testa e (4) fuori dalla vista: il calabrone è fuori dal fotogramma video. </li><li> Impostare ogni comportamentocome uno &#39;stato&#39; e &#39;escludono a vicenda&#39; nel menu delle proprietà e di effettuare registrazioni continue per un intervallo di 2 min. Riprodurre i video in modalità slow-motion (2 volte più lento) per una maggiore precisione. </li></ol></li><li> Misurare la velocità della proboscide retrazione dalla soluzione test dopo il primo contatto tra due fotogrammi consecutivi (separati da 37,5 msec nelle registrazioni video mostrato qui) utilizzando un software di video motion tracking (vedi Materiali Tavolo). <ol><li> Carica il file video e passare al fotogramma in cui la proboscide primi contatti la soluzione. </li><li> Per impostare la scala di riferimento, selezionare lo strumento Linea e tracciare una linea sulla larghezza del microcapillare nel fotogramma video. Fare clic destro sulla linea e selezionare &#39;Calibrare misura&#39;. Inserire la larghezza del capillare el&#39;unità corrispondente. </li><li> Selezionare &#39;Immagine&#39; poi &#39;coordinate origine del sistema&#39;. Nella nuova finestra cliccare sulla punta della proboscide e selezionare9; Applica &#39;. </li><li> Selezionate lo strumento mano mossa, fare clic destro sulla punta della proboscide sul telaio video e selezionare &#39;Percorso Traccia&#39;. Spostare al fotogramma successivo e regolare il punto di tracking per la punta della proboscide. </li></ol></li><li> Fare clic destro sul punto di monitoraggio e selezionare &#39;Configurazione&#39;. Seleziona &#39;completa Path&#39; e selezionare &#39;Speed&#39; sotto misura. Seleziona &#39;Applica&#39;. Viene visualizzata la velocità. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

Con questo test comportamentale romanzo, il chinino è mostrato per scoraggiare l&#39;alimentazione del calabrone appassionato di coda. Il tempo di contatto proboscide ridotto e la frequenza attacco alimentazione con acqua o la soluzione di saccarosio cucita con il chinino è interpretato qui come un rifiuto di avviare ulteriori nutrendosi di soluzioni non nutritivi o potenzialmente tossici. Quando chinina viene aggiunto alla soluzione 1 M di saccarosio, calabroni non solo riducono il volume di soluzione che consumano, anche ritirano proboscide veloce, riducendo così il tempo di contatto tra i boccale e la soluzione contenente una tossina. Insieme, questi risultati suggeriscono che il chinino è percepita da parte delle cellule del recettore gustative sulle apparato boccale del calabrone, come già precedentemente identificato nel miele delle api 9. Il chinino è una tossina per gli insetti che induce un comportamento malessere simile a l&#39;ape 10 e atterramento nel malaria zanzare (Anopheles gambiae) 23. Questo test potrebbe portare alla identificationi di alcuni composti di dissuasione e potenzialmente tossici che sono percepite da parte delle cellule del recettore gusto sulle apparato boccale dei bombi. È fondamentale per la microcapillare di essere riempito con un volume sufficiente di soluzione di prova all&#39;ultimo durante la fase di test. Si raccomanda che almeno circa tre quarti della microcapillare (ad esempio 70-80 ml) è pieno. Tuttavia, occorre prestare attenzione a non riempire completamente il microcapillare per ridurre il rischio di perdite durante il processo di scansione e di presa del microcapillare per l&#39;apparato sperimentale. Si deve anche essere presa in sede di presentazione della 500 mm gocciolina di saccarosio al calabrone, in modo che lo sperimentatore evita che perde la goccia nel tubo azienda. Il foro 4 mm alla punta del tubo partecipazione è abbastanza grande per un adulto lavoratore Bumble Bee di estendere naturalmente la sua proboscide verso la soluzione di prova. Tuttavia è possibile chebombi possono gustare la soluzione con le loro antenne prima di estendere le loro proboscidi. Questo potrebbe influenzare la probabilità di estensione proboscide come PER potrebbe essere raggiunta in bombi, stimolando la loro antenne con una soluzione di zucchero 15. Infatti le antenne di imenotteri come la vespa parassitoide (Trissolcus brochymenae) 24 o l&#39;ape 13 sono dotati di gusto sensilli, permettendo loro di degustare gli zuccheri e le tossine come il chinino. Di conseguenza, i contatti delle antenne iniziali con soluzioni contenenti composti altamente deterrenti come il chinino potrebbero anche ridurre la motivazione di un calabrone di estendere la sua proboscide e quindi influenzare il tasso di successo sperimentale. Sebbene il contatto antennale con la soluzione in esame non può essere controllato, nel presente studio non abbiamo trovato alcun effetto significativo di contatto antenne sulla estensione proboscide verso la soluzione di test. In questo saggio, subito impostazione del microcapillare dopo la fase di pre-test wgallina antenne dei bombi &#39;sono ancora all&#39;interno del tubo di supporto in grado di ridurre la possibilità per i bombi per gustare la soluzione di test con le loro antenne. Il limite principale di questo saggio sorge quando il tracciamento della retrazione proboscide dalla soluzione di prova dopo il primo contatto proboscide utilizzando il software di monitoraggio motion video. Il filmato mostra solo il movimento in 2D della proboscide, quindi l&#39;uscita data della misurazione della velocità può essere sotto o sopra previsto. Tuttavia, con alcune modifiche, questo aspetto del dosaggio potrebbe essere migliorata. Questo test può essere usato per osservare le risposte alimentazione naturale verso soluzioni contenenti composti diversi, tra cui metaboliti secondari naturali che si verificano vegetali. Osservando le risposte immediate di alimentazione con questo test fornisce informazioni dettagliate su come bombi rilevare questi composti. Questo è vantaggioso rispetto agli attuali &#39;go-no go&#39; metodi come PER 18,19 </sup&gt; E più saggi di due a scelta 7 perché questo metodo produce una serie di misure di risposta comportamentale, tra cui il consumo di cibo durante un attacco di alimentazione discreta. Misurazione diversi parametri contemporaneamente permette una migliore valutazione della appetibilità di un composto. Ad esempio nel nostro test, bombi evitare di consumare l&#39;acqua o la soluzione di saccarosio cucita con il chinino. Retrazione della proboscide potrebbe essere causato da un cambiamento nelle risposte delle cellule recettori zucchero 12,13. La nostra analisi mostra che bombi ritraggono la proboscide più veloce dopo aver contattato la soluzione di saccarosio chinino di sola acqua; questo potrebbe suggerire che il chinino colpisce una serie distinta di neuroni, oltre a inibire i neuroni sensori zucchero 9,12,13,25. La nostra analisi permette l&#39;analisi del pattern temporale delle risposte comportamentali durante l&#39;alimentazione. Un protocollo simile in cui viene misurato il tempo di consumo e il numero di attacchi ha alpronti stato implementato per valutare la risposta alimentazione di Drosophila di zuccheri nutritivi e non nutritivi 26. Prevediamo che api mostrano una risposta più affidabile ad alimentare stimolanti nei nostri test che in altri metodi come PER perché le api sono liberi di muoversi nel tubo di supporto 21. Questa tecnica permetterà un&#39;analisi esaustiva delle soglie gustative per i nutrienti e le tossine per illuminare i meccanismi di alimentazione in bombi e potenzialmente altre specie di api.

interazioni pianta-impollinatori sono complesse. Impollinatori visitano i fiori per ottenere nettare e polline come cibo; a sua volta, impollinatori facilitano la riproduzione sessuale nelle piante. Anche se questo rapporto è in gran parte mutualistica, nettare e polline floreale a volte contengono tossine o altri composti vegetali 1-5 che possono danneggiare gli impollinatori. Il razionale ecologico per la presenza di tali composti in nettare e polline non è chiaro in tutti gli ambienti. Una domanda eccezionale in questo campo è come impollinatori come le api in grado di rilevare ed evitare i fiori con nettare contenente tossine. Le specie di bombi, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), è un impollinatore generalista che visita i fiori di molte specie di piante, tra cui quelli che producono il nettare contenente tossine 6. Bombi sono stati indicati per evitare soluzioni che consumano contenenti elevate concentrazioni di tossine in un test di 24 ore due scelta 7. Questo testdei consumi alimentari descritto da Tiedeken et al. 7 hanno rivelato che le api in grado di rilevare i composti amari nelle soluzioni. Tuttavia, questo test è stato in grado di distinguere il gusto da processi post-ingestive come malessere che potrebbe anche influenzare il comportamento alimentare su questo intervallo di tempo 8-10. Le api possiedono sensilla gustative sulle loro antenne, apparato boccale e tarsi per rilevare composti 11-13. Il riflesso di estensione proboscide (PER) esperimenti coinvolgere frenare singole api in una imbracatura e quindi stimolando sensilli antennali delle api per produrre l&#39;alimentazione reflex 14-17. Le api possono essere trattenuti nei singoli cablaggi e poi stimolate a produrre il riflesso di alimentazione come un saggio della loro capacità di gustare i composti 18,19. Altri hanno modificato il saggio PER studiare la sensibilità delle antenne o boccale a tossine 9,20. Tuttavia, le api sono sottoposti a stress durante lo sfruttamento. Questo potrebbe influenzare il modoessi rispondono ai composti 21. Qui, un nuovo test è descritto per valutare la risposta gusto comportamentale dei liberamente muoversi bombi per il saccarosio e il chinino, un alcaloide che è stato precedentemente segnalato per essere deterrente 9 e tossici 10 alle api (Apis mellifera) e bombi (Bombus terrestris) 7, 22. Anche se il chinino non è stato trovato nel nettare di piante, questo alcaloide è spesso usato come uno stimolo avversivo in studi comportamentali e fisiologici nelle api 7,9,12,13,22. Il metodo prevede la registrazione video apparato boccale dei bombi &#39;a grande risoluzione durante il contatto iniziale con proboscide le soluzioni di prova. In particolare, la struttura fine della risposta alimentazione viene esaminato segnando continuamente il comportamento in un intervallo di 2 min. Il volume di soluzione consumato viene misurata durante il periodo di alimentazione e quindi la quantità di cibo ingerito può essere correlata con la microstruttura diil comportamento alimentare. Anche la velocità di retrazione proboscide è misurata, come indicatore di evitamento attivo, e quindi di rilevamento pre-ingestive.

<table><tbody><tr><td>Colonie di bombi</td><td>Koppert Biological Systems</td><td></td><td>NATUPOL Beehive</td></tr><tr><td>Fotocamera microscopica digitale&nbsp;</td><td>Dino-lite Europa</td><td>AM4815ZT</td><td>Dino-Lite Edge&nbsp;</td></tr><tr><td>100 &mu; l tubo microcapillare&nbsp;</td><td>Blaubrand IntraEND</td><td>709144</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene centifugo da 15 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific 11849650</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml siringa luer slip in plastica monouso</td><td>BD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>laptop Dell Latitude 3550</td><td>Dell</td><td></td><td>Verificare la compatibilità con il software video.</td></tr><tr><td>Canon CanoScan LiDE 120</td><td>Canon</td><td></td><td>Verificare la compatibilità con il computer/laptop</td></tr><tr><td>Observer versione software 5.0.25</td><td>Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinovea versione software 0.8.15</td><td>Kinovea&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo in</td><td></td><td></td> silicone <td>6&nbsp; cm di lunghezza, 1&nbsp; mm interno &Oslash; e 6&nbsp; cm di lunghezza, 4&nbsp; mm interno &Oslash;</td></tr><tr><td>Adattatore maschio luer x1/16" standard in polipropilene spinato</td><td>Cole-Parmer</td><td>TW-45518-22</td><td></td></tr><tr><td>Femmina luer x 1/16" adattatore standard in polipropilene spinato</td><td>Cole-Palmer</td><td>TW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Rete d'acciaio&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,5 mm di maglia</td></tr><tr><td>Saccarosio (grado II)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>Chinino cloridrato diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q1125</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ versione software 1.48</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel comportamentale test per indagare risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; bombus terrestris</em&gt;)

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Impollinatori generalisti come il calabrone appassionato di coda, Bombus terrestris, incontrano entrambe le sostanze e le tossine nel nettare floreale che raccolgono da piante da fiore. Solo pochi studi hanno descritto le risposte gustative di api verso tossine nei prodotti alimentari, e questi esperimenti hanno utilizzato principalmente la risposta estensione proboscide in api mellifere trattenuto. Qui, un nuovo test comportamentale è presentato per misurare le risposte di alimentazione di liberamente in movimento, singolo lavoratore bombi ai nutrienti e le tossine. Questo test misura la quantità di soluzione ingerita da ogni calabrone ed identifica come tastants negli alimenti influenzano la microstruttura del comportamento alimentare. Le soluzioni sono presentati in un microcapillare ai singoli bombi che sono stati precedentemente digiuno per 2-4 ore. Il comportamento è catturato in video digitale. La struttura fine del comportamento alimentare viene analizzato segnando costantemente la posizione della ProboSIC (apparato boccale) da registrazioni video utilizzando il software di registrazione degli eventi. La posizione della proboscide è definito da tre diverse categorie comportamentali: (1) proboscide viene estesa e in contatto con la soluzione, (2) proboscide è estesa ma non in contatto con la soluzione e (3) proboscide è sistemato sotto la testa. Inoltre la velocità della proboscide a scomparsa dalla soluzione viene anche stimato. Nel presente saggio il volume di soluzione consumato, il numero di attacchi di alimentazione, la durata dei periodi di alimentazione e la velocità di retrazione proboscide dopo il primo contatto è utilizzato per valutare la phagostimulatory o l&#39;attività deterrente dei composti testati. Questo nuovo test gusto permetterà ai ricercatori di misurare quanto composti trovati in nettare influenzano il comportamento alimentare delle api e sarà anche utile per biologi impollinazione, tossicologi e neuroethologists che studiano il sistema gusto del calabrone.

Il nuovo metodo di analisi è utilizzato per testare le risposte di alimentazione a 1 M di saccarosio, 1 M soluzione di saccarosio più 1 mM chinino e acqua deionizzata solo. Le risposte di alimentazione immediate a ciascun trattamento sono determinati quantificando la durata dei contatti proboscide con la soluzione in esame, la frequenza degli attacchi di alimentazione e la velocità della proboscide a scomparsa dalla soluzione di prova dopo il primo contatto durante la fase di test 2 min. Il volume di soluzione consumato è misurato anche dopo la fase di test. In questo studio, abbiamo scelto un intervallo di criterio di attacco di 5 secondi (Figura 1, vedere File supplementare) sulla base di precedenti lavori da French et al. 25 che ha usato una soglia di 5 secondi per caratterizzare il comportamento proboscide retrazione da Drosophila in risposta a dissuasive composti 25. Così, abbiamo definito un attacco di alimentazione come un contatto tra la proboscide estesi e la soluzione nont interrotto da una assenza di contatti di 5 sec. In confronto al saccarosio e acqua deionizzata da solo, aggiungendo il chinino di soluzione di saccarosio scoraggia evidentemente alimentazione da bombi in quanto saranno rapidamente allontanarsi se rilevano una sostanza avversione (Video Figura 1). In questo esperimento, i trattamenti hanno un effetto significativo sulla durata di contatti cumulativo proboscide durante la fase di prova (ANOVA sui dati di log-trasformati, F 2,31 = 41, p &lt;0.001). La durata complessiva del tempo di contatto con il saccarosio contenente chinino è significativamente ridotta rispetto a solo saccarosio (p &lt;0.001), ma non all&#39;acqua deionizzata solo (p = 0,219) (Figura 2). Allo stesso modo, i trattamenti hanno un effetto significativo sulla durata cumulata di attacchi di alimentazione (ANOVA sui dati di log-trasformati, F <sub&gt; 2,31 = 27.95, p &lt;0.001, Figura 3A). La durata complessiva del alimentazione periodi con saccarosio contenente chinino è significativamente ridotta rispetto a solo saccarosio (p &lt;0.001), ma non rispetto alla sola acqua deionizzata (p = 0,41). I trattamenti hanno anche un effetto significativo sulla frequenza di attacchi di alimentazione (Poisson GLM con una funzione di collegamento log, variazione devianza rispetto alla distribuzione c 2: p &lt;0.050), per cui il numero di periodi con saccarosio contenente chinino è significativamente maggiore nei rispetto al saccarosio (p &lt;0,01), ma marginalmente significativamente differente al trattamento acqua deionizzata (p = 0,055, a causa di una bumblebee visualizzazione sette periodi alimentazione sull&#39;acqua, Figura 3B). Analogamente, la velocità di retrazione proboscide differisce significativamente tra i trattamenti (ANOVA sui dati di log-trasformati, F 2,31 = 5.12, p &lt;0.050). bombi ritraggono il proboscis dalla soluzione di prova significativamente più veloce dopo il primo contatto con saccarosio contenente chinina che con saccarosio o acqua deionizzata solo (p &lt;0,050, Figura 3C). Questi risultati suggeriscono che il chinino attiva un comportamento di evitamento attivo di bombi. I trattamenti hanno anche un effetto significativo sul volume totale di soluzione consumata (ANOVA sui dati di log-trasformati, F 2,32 = 62,5, p &lt;0.001), per cui il consumo di saccarosio contenente chinina si riduce rispetto al saccarosio (p &lt;0.001), ma non in acqua deionizzata (p = 0,457) (Figura 4B). Il volume di soluzione evaporata dal capillare durante il periodo di prova è trascurabile. In condizioni di laboratorio (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH), l&#39;evaporazione varia tra 0,033 a 0,883 microlitri con una media di 0,276 ml e 0,171 microlitri per acqua deionizzata e 1 M di saccarosio, rispettivamente. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; In questo test i contatti tra l&#39;antenna e la soluzione non può essere evitato. Tuttavia, la percentuale di bombi con le loro antenne di gustare la soluzione di alimentazione durante la fase di prova (saccarosio: 46,1%, saccarosio chinino: 60,0% e acqua deionizzata: 33,3%) non è significativamente diversa tra i trattamenti (binomiale GLM, cambiamento in devianza rispetto alla distribuzione c 2: p = 0.450). Nessun effetto dei trattamenti si trova sulla latenza tra i primi contatti antennali e la soluzione di prova ed i primi contatti della proboscide (mediana: 2,67 sec per saccarosio; 1,10 sec per saccarosio chinina; 0,80 sec per acqua deionizzata, ANOVA sulla i dati di log-trasformati, F 2,13 = 0.620, p = 0,550). Inoltre, la percentuale di bombi estendono la proboscide di gustare la soluzione di test rimane costante attraverso i trattamenti (saccarosio: 66,7%; saccarosio chinino: 50,0%; acqua deionizzata: 52,2%; binomio GLM, variazione devianza rispetto alla distribuzione c 2: p = 0.840). Insieme, questi risultati suggeriscono che le antenne hanno un ruolo minore nella rilevazione delle tossine in questo saggio. Un esperimento separato esamina se sia necessario testare api per un periodo di tempo più lungo di 2 min. La quantità di cibo consumato dalle api viene testato con il 1 M di saccarosio o 1 mM chinino in 1 M soluzioni di saccarosio in due condizioni: un periodo di prova 2 minuti e un periodo di prova di 10 min. Per entrambi i trattamenti, il consumo totale di cibo non differisce per i periodi di prova e interazioni significative verifica tra il periodo di prova e il trattamento (N = 6 - 13 ANOVA sui dati registro trasformati; effetto dei trattamenti: F = 1,31 54,8, p &lt;0,001; effetto del periodo di prova: F 1,31 = 0, p = 0,979; effetto dell&#39;interazione: F = 0.1, p = 0,457). In sintesi, un2 min periodo di prova è sufficiente per valutare l&#39;effetto della soluzione sulla quantità totale di cibo consumata dai bombi e gli effetti deterrenti di sostanze tossiche o repellenti in questo saggio. Pertanto, misurando il consumo di cibo e saggiando comportamento alimentare, è possibile correlare il consumo totale di cibo alla struttura fine dell&#39;alimentazione durante il dosaggio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> Figura 1: periodi di latenza tra la proboscide contatti durante i primi 2 min del test di alimentazione trame densità dei periodi di latenza di tempo che separa ogni contatto proboscide con la soluzione di saccarosio 1 M, la soluzione di chinino 1 M saccarosio + 1 mm ed acqua.. I dati cumulativi da 13, 10 e 11 le api sono rappresentate rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> Figura 2: proboscide contatto durate durante la prima 2 min del test di alimentazione trame densità della durata di contatto proboscide di bombi si nutrono di 1 M di saccarosio, 1 M di saccarosio + 1 mM chinino o acqua.. La dimensione del campione, come in Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> Figura 3: Proboscis Attività di Bombi si nutrono di 1 M saccarosio, 1 M saccarosio + 1 mM chinino o acqua (A) La durata complessiva di attacchi di alimentazione durante la fase di test (B) la frequenza di alimentazione attacchi e (C) la velocità. della proboscide retrazione dopo il primo contatto. Scrittura indica una differenza significativa: trattamenti con diverse lettere indicano P &lt;0.05. trame Box rappresentano la mediana (barre nere), il i punti dati più alti e più bassi ancora a 1,5 della gamma interquartile (baffi) e gli outlier (cerchi). La dimensione del campione, come in Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> Figura 4:. Sopprime i chinino alimentazione da calabroni (A) digitalizzate immagini dei tubi microcapillari indicanti il grado di saccarosio 1 M o 1 M di saccarosio 1 mM soluzione chinina (indicata da una linea nera) prima e dopo la fase di test rispettivamente. (B) Il consumo di 1 M di saccarosio, 1 M di saccarosio 1 mM chinino o deionizzata<html> solo da bombi dopo la fase di test. Scrittura indica una differenza significativa: trattamenti con diverse lettere indicano P &lt;0.001. trame Box rappresentano la mediana (barre nere), il i punti dati più alti e più bassi ancora a 1,5 della gamma interquartile (baffi) e gli outlier (cerchi). La dimensione del campione, come in Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Video Figura 1: registrazioni video della proboscide attività verso (A) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 M saccarosio</a> , (B) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 M di saccarosio 1 mM chinino</a> e (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; deionizzata durante la fase di test.

Viene descritto un nuovo test comportamentale per studiare le risposte gustative a breve termine dell'apparato boccale dei bombi che si muovono liberamente (Bombus terrestris) nei confronti di nutrienti e tossine in soluzione.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la sensibilità gustativa delle api operaie adulte di bombi nei confronti di nutrienti e tossine. Con questo metodo, possiamo misurare in dettaglio le risposte alimentari naturali delle api. Ciò ci permetterà di identificare la capacità dell'ape di rilevare sia nutrienti che tossine in soluzione.Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce diverse misure di risposta, come la quantità di cibo ingerita dalle api in un breve periodo e la durata dell'episodio alimentare. Questo presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi go-no-go esistenti, come un protocollo del riflesso di protrusione del proboiscide. I saggi del comportamento forniscono informazioni preziose sui meccanismi neuronali.Questo saggio fornirà un metodo controllato per studiare le risposte delle api in movimento libero ai composti tossici presenti nel cibo. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la preparazione e la somministrazione delle soluzioni possono risultare difficili da apprendere. Richiedono un'erogazione estremamente precisa delle soluzioni nel momento corretto.In questa dimostrazione si utilizzano Bombus terrestris audax provenienti da colonie allevate in ambito commerciale. Due ore prima dell'inizio dell'esperimento, raccogliere singole api operaie usando un vial di plastica con tappo di plastica forato. Per iniziare, trasferire i vial contenenti api singolarmente raccolte in un ambiente buio e privarle di cibo per due o quattro ore.Le api vengono testate in un tubo di contenimento. Il tubo di contenimento è un tubo da centrifuga da 15 millilitri modificato, con un foro di quattro millimetri praticato alla punta e un pezzo di rete metallica fissato all'interno. Successivamente, fissare due pezzi di cartone ai lati del supporto in polistirene per il tubo di contenimento, in modo da schermare l'ape dagli stimoli visivi durante l'esperimento.Dopo il periodo di privazione, trasferire un'ape dal vial in un tubo di contenimento. Successivamente, fissare il tubo di contenimento al supporto in polistirene utilizzando cera da dentista. Poi, posizionare una telecamera microscopica digitale.Collegare la telecamera a un computer adeguato per la registrazione. Successivamente, posizionare la telecamera a cinque centimetri sopra l'estremità del tubo di contenimento. Infine, regolare il tubo di contenimento in modo che almeno 18 millilitri della sua estremità siano all'interno del campo visivo del video.Il test è suddiviso in due fasi: la preprova, in cui viene presentata una goccia di saccarosio, e la fase di prova, in cui viene presentata la soluzione di interesse. Prima dell'inizio dell'esperimento, collegare un tubo di silicone lungo sei centimetri con un diametro interno di un millimetro, tramite un raccordo maschio, a un altro tratto di tubo di silicone lungo sei centimetri ma con un diametro interno di quattro millimetri. Questo sistema funzionerà come una pipetta automatica.Ora, preparare le soluzioni di prova. In primo luogo, preparare un tubo microcapillare da 100 microlitri con la soluzione di prova, quindi scansionare il tubo con uno scanner a piatto a 600 dpi. Successivamente, collegare il tubo microcapillare al tubo di silicone.Ora, inserire il capillare in un supporto per micromanipolatore, ad esempio una siringa modificata da un millilitro. Quindi utilizzare il manipolatore per posizionare il capillare in una posizione pronta all'uso. Iniziare la registrazione video dopo il periodo di abituazione.In questo studio, l'attività della proboiscide viene registrata a 26,7 fotogrammi al secondo con un'ingrandimento di 25X. In secondo luogo, preparare una siringa con saccarosio 500 millimolare disciolto in acqua deionizzata. Quindi collegare la siringa a un adattatore femmina.Ora, inizia il test. Per prima cosa, presenta la siringa con una goccia di saccarosio di circa 3,5 microlitri all'estremità del tubo di contenimento per indurre l'ape a estendere il suo proboiscide. Lascia all'ape fino a cinque minuti per consumare il saccarosio.Se la goccia non viene completamente consumata, rimuovere l'ape dall'esperimento. Una volta che l'ape ha terminato la goccia, rimuovere immediatamente la siringa. Successivamente, posizionare la microcapillare a una distanza compresa tra cinque e dieci millimetri dalla punta del tubo di contenimento e premere delicatamente il tubo flessibile secondo necessità per mantenere la soluzione alla punta della microcapillare.Eseguire il test per due minuti, a partire dal primo contatto della proboscide con la soluzione. Dopo due minuti, rimuovere la microcapillare e scansionarla nuovamente per misurare il volume della soluzione test consumato dall'ape. Sono stati confrontati i comportamenti alimentari in risposta a saccarosio uno molare, saccarosio uno molare con chinina uno millimolare e acqua deionizzata pura.L'attività protrusa del proboiscide è stata valutata durante i primi due minuti dei test. Un episodio alimentare è definito come il contatto tra il proboiscide esteso e la soluzione senza interruzioni di contatto per intervalli di cinque secondi o superiori. La durata cumulativa degli episodi alimentari con saccarosio contenente chinino è risultata significativamente ridotta rispetto al saccarosio da solo, ma non rispetto all'acqua deionizzata da sola.Allo stesso modo, i trattamenti hanno un effetto significativo sulla frequenza dei pasti durante la fase di prova. Analogamente, la velocità di ritrazione del proboiscide differiva in modo significativo tra i diversi trattamenti. Le bombe ritraevano il proboiscide dalla soluzione di prova significativamente più velocemente dopo il primo contatto con saccarosio contenente chinino rispetto al saccarosio o all'acqua deionizzata da soli.Il consumo totale della soluzione di prova è stato misurato al termine della fase di prova. Le api hanno ingerito significativamente meno la soluzione di saccarosio contenente chinino rispetto alla soluzione di saccarosio pura. La risposta alla chinina non è risultata significativamente diversa rispetto all'acqua deionizzata.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore con circa otto api, a condizione che venga effettuata correttamente e che tutte le api rispondano alla soluzione di interesse. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del valore di questo metodo nel fornire dati sui tipi di sostanze che le api possono rilevare nel cibo. Nel tentativo di applicare questo metodo, è molto importante non versare alcuna soluzione nel tubo di contenimento e non far fuoriuscire alcuna parte della soluzione di interesse dal tubo microcapillare.Speriamo che questa tecnica permetta ai ricercatori nel campo della gustazione di approfondire l'indagine su come il sistema del gusto delle api acquisisca informazioni sui nutrienti e sulle tossine.

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Neuroscienze

Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l'applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

In questo protocollo si mostra come condizione sfruttata api a stimoli tattili e introdurre un 2D tecnica del motion capture per analizzare la cinematica di fine scala modello di campionamento antenne.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Una verticale, T-labirinto olfattometro è descritto per saggiare la risposta comportamentale degli artropodi. Il olfattometro permette allo sperimentatore di misurare le scelte effettuate da soggetti di prova quando è sottoposto a due campi odore potenziali. Sia attrazione e repulsione per da odoranti può essere misurata con questo dispositivo.

Verticale T-maze test di scelta per risposta artropodi di odori

In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

Il protocollo di condizionamento Proboscis Extension Response (PER), sviluppato per l'ape mellifera (Apis mellifera), fornisce un mezzo ecologicamente rilevante e facilmente quantificabile per studiare diversi meccanismi di apprendimento in molte specie di insetti.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Vi presentiamo un test di scelta per rivelare l'influenza di odoranti sul comportamento Drosophila utilizzando un test Y-labirinto.

Test<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfatto con un test Y-maze

Questo video descrive l'identificazione a radiofrequenza (RFID) e i metodi di registrazione video sensibili al movimento per monitorare il comportamento di scelta dei bombi.

Radio Frequency Identification e video sensibile al movimento in modo efficiente Automatizzare registrazione di ricompensa Scelta comportamento di bombi

Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Questo manoscritto descrive diversi protocolli per la somministrazione di agenti farmacologici alle api, tra cui semplici metodi non invasivi per le api in volo libero, così come le varianti più invasive che consentono preciso trattamento localizzato delle api trattenuti.

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Presentiamo un meccanismo non letale e automatizzato per raccogliere il polline dai lavoratori dei bombi(Bombus)che ritornano in un alveare. Sono incluse le istruzioni per la produzione, la preparazione, l'installazione e l'utilizzo dei dispositivi. Utilizzando oggetti stampati in 3D, la modifica del progetto è stata tempestiva, efficiente e ha consentito tempi di consegna rapidi per i test.

Una trappola per polline stampata in 3D per gli ingressi dell'alveare di Bombble Bee(Bombus)

Scopri un nuovo test comportamentale per analizzare le risposte gustative individuali di bombi liberi (Bombus terrestris). Questo metodo misura il consumo e la durata dei pasti per studiare la rilevazione di nutrienti e tossine.

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